Trong bài báo này chúng tôi giới thiệu một số kết quả thu được về tách dòng gen Sh2 bằng PCR từ dòng ngô H14 và xây dựng vector chuyển gen mang gen Sh2. Trình tự gen Sh2 tách dòng được từ dòng ngô H14 có độ tương đồng cao (99%) so với gen Sh2 đã công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế (GenBank) có mã số NM_001127632.1. Gen Sh2 từ dòng ngô H14 sau đó được gắn thành công vào vector biểu hiện pCambia1301 cùng với promoter Ubiquitin (Ubi) để thiết kế vector chuyển gen mang gen Sh2: pCambia 1301-Ubi-Sh2 phục vụ cho chuyển gen.
TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 122-128 TÁCH DỊNG GEN SHRUNKEN (Sh2) TỪ DỊNG NGƠ H14 VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN pCAMBIA 1301-Ubi-Sh2 Nguyễn Thị Thu, Lê Hoàng Đức, Nguyễn Đức Thành* Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *nguyenducthanh_pcg@ibt.ac.vn TÓM TẮT: Gen Shrunken (Sh2) chứng minh gen mã hóa cho tiểu phần lớn enzyme ADP-glucose pyrophosphorylase nội nhũ, enzyme tham gia vào trình tổng hợp tinh bột nội nhũ Đoạn gen nghiên cứu chuyển thành công vào ngô làm tăng hàm lượng tinh bột lên đáng kể so với đối chứng không chuyển gen Với mục tiêu tạo dòng ngơ có suất, chất lượng cao, chúng tơi tiến hành nghiên cứu, tách dòng gen Sh2 thiết kế vector phục vụ việc chuyển gen Sh2 vào số dòng ngơ trồng Việt Nam Trong báo giới thiệu số kết thu tách dòng gen Sh2 PCR từ dòng ngơ H14 xây dựng vector chuyển gen mang gen Sh2 Trình tự gen Sh2 tách dòng từ dòng ngơ H14 có độ tương đồng cao (99%) so với gen Sh2 công bố Ngân hàng Gen quốc tế (GenBank) có mã số NM_001127632.1 Gen Sh2 từ dòng ngơ H14 sau gắn thành cơng vào vector biểu pCambia1301 với promoter Ubiquitin (Ubi) để thiết kế vector chuyển gen mang gen Sh2: pCambia 1301-Ubi-Sh2 phục vụ cho chuyển gen Từ khóa: ADP-glucose pyrophosphorylase, dòng ngơ H14, gen Shrunken 2, tách dòng gen, vector chuyển gen MỞ ĐẦU Việc tăng suất trồng đặc biệt lương thực ngô, lúa, lúa mì v.v thách thức nhà chọn tạo giống trồng Hiện có hai hướng chủ yếu để tăng suất trồng, cải tiến phương thức canh tác sử dụng giống dựa vào nỗ lực nhà khoa học chọn giống Cho đến nay, nhà khoa học thường nghiên cứu tạo giống theo hướng như: nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen, di truyền phân tử tính trạng quan tâm, chọn lọc nhờ thị phân tử công nghệ gen Cây ngô trồng thu hạt nên tăng suất chủ yếu phụ thuộc vào yếu tố như: chiều dài bắp, số lượng hạt, khối lượng hạt Để ứng dụng công nghệ gen vào việc tăng suất ngơ cần nghiên cứu q trình liên quan đến suất như: trình quang hợp, trình tổng hợp tinh bột, hoạt động gen điều khiển trình tổng hợp sinh khối Nhiều nghiên cứu hóa sinh phân tử làm sáng tỏ vai trò enzyme q trình tổng hợp tinh bột Các nghiên cứu cho thấy, ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) enzyme đóng vai trò chìa khóa q trình điều khiển tổng hợp tinh bột hạt ngũ cốc [1, 2, 3, 4, 5, 7, 10] Enzyme AGPase có cấu trúc tứ phân gồm tiểu 122 phần nhỏ mã hóa gen Brittle (Bt2) tiểu phẩn lớn mã hóa gen Shrunken (Sh2) Chuyển gen Sh2 Bt2 hướng nghiên cứu nhằm tăng khả tổng hợp tinh bột, tăng suất trồng Hiện Trung Quốc có cơng bố việc chuyển thành công hai gen vào ngô làm tăng khối lượng hạt ngô: khối lượng 100 hạt tăng lên 15% so với dòng khơng chuyển gen hàm lượng tinh bột tăng đến 74% so với 65% không chuyển gen [6] Trong báo này, trình bày kết nghiên cứu tách dòng gen Sh2 từ dòng ngơ H14 thiết kế vector chuyển gen pCambia 1301-Ubi-Sh2 phục vụ cho chuyển gen tăng cường tổng hợp tinh bột ngô VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Vật liệu để nghiên cứu tách dòng gen Sh2 hạt (sau 10 ngày thụ phấn) dòng ngơ H14 Viện Nghiên cứu ngơ cung cấp Vector pBT phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp Chủng vi khuẩn E coli DH5α hãng Invitrogen cung cấp Đoạn gen Ubi phân lập phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh Nguyen Thị Thu, Le Hoang Duc, Nguyen Duc Thanh học công bố Genbank với mã số JX947345.1 Vector pCambia 1301 phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện công nghệ sinh học cung cấp Cặp mồi đặc hiệu để nhân gen Shrunken (Sh2) thiết kế phần mềm Primer [8] dựa trình tự gen Sh2 công bố Genbank với mã số NM_001127632.1 bổ sung thêm vị trí cắt enzyme giới hạn phục vụ cho nhận biết gắn gen vào vector biểu Mồi xuôi ZmSh2F: 5’-GCGGATCC GATATGCAGTTTGCACTTGC-3’ có gắn trình tự điểm cắt enzyme BamHI Mồi ngược ZmSh2R: 5’-GCGAGCTCCTATATGA CAGACCCATCG TTG-3’ có gắn trình tự điểm cắt enzyme SacI Đoạn mồi xi có chiều dài 28 nucleotide tỷ lệ GC 53,6% nhiệt độ nóng chảy 64,4oC Đoạn mồi ngược có chiều dài 30 nucleotide, tỷ lệ GC 53,3% nhiệt độ nóng chảy mồi 64,1oC Cặp mồi nhân đoạn gen có chiều dài lý thuyết 1,5 kb tương đương với chiều dài đoạn gen Sh2 Phương pháp RNA tổng số tách từ hạt ngơ dòng H14 phương pháp sử dụng Trizol Sản phẩm tách điện di kiểm tra gel agarose 1% đệm TBE 1X Tổng hợp cDNA từ RNA tổng số sử dụng kit RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (Fermentas) Nhân gen từ cDNA kỹ thuật PCR Thành phần phản ứng bao gồm dNTPs mM: µl, H2O: 9,7 µl, buffer PCR 10X: µl, cDNA (50 ng/µl): µl, Taq DNA u/µl: 0,1 µl, mồi ZmSh2F 50 ng/µl: 1µl, ZmSh2R 50 ng/µl: µl, MgCl2 25 mM: 1,2 µl Chu trình chạy PCR nhân gen thiết kế: 94oC: phút; 58oC: phút; 72oC: phút Đoạn DNA nhân gen tinh kit AccuPrep® Gel Purification (Bioneer) Đoạn gen sau gắn vào vector pBT tạo plasmid tái tổ hợp sử dụng T4 DNA ligase Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E Coli DH5α phương pháp sốc nhiệt Các dòng khuẩn chọn lọc PCR clony sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhân Sh2 Các vi khuẩn sau chọn lọc có chứa đoạn gen mục tiêu ni mơi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 mg/ml tách plasmid tái tổ hợp phương pháp mô tả Sambrook et al (1989) [9] Plasmid cắt kiểm tra enzyme cắt giới hạn BamHI SacI (theo hưỡng dẫn nhà sản xuất) Trình tự gen Sh2 từ dòng ngơ H14 xác định hãng Macrogen (Hàn Quốc) Kết đọc trình tự so sánh với trình tự Genbank sử dụng cơng cụ Blast nucleotide Gen Sh2 từ dòng ngơ H14 sau gắn với cấu trúc vector biểu pCambia1301 với promotor Ubiquitin (Ubi) tách dòng công bố Genbank với mã số JX947345.1 để tạo vector chuyển gen mang gen Sh2: pCambia1301-Ubi-Sh2 Để làm việc này, enzyme BamHI SacI sử dụng để cắt đồng thời vector tách dòng pBT-Sh2 vector pCambia 1301 gắn gen Sh2 vào vector pCambia 1301 T4 DNA ligase để tạo plasmid pCambia 1301-Sh2 biến nạp vào vi khuẩn E Coli DH5α nuôi mơi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50 mg/ ml Các dòng vi khuẩn kiểm tra có mặt đoạn gen Sh2 PCR clony Cấu trúc pCambia 1301-Sh2 sau gắn thêm promoter Ubi cho việc tạo cấu trúc biểu pCambia 1301-Ubi-Sh2 việc sử dụng enzyme BamHI PstI cắt đồng thời hai cấu trúc vector pCambia1301-Sh2 cấu trúc pBT-Ubi gắn pCambia 1301-Sh2 vơi promoter Ubi enzyme T4 DNA ligase để tạo vector tái tổ hợp pCambia 1301- Ubi- Sh2 phục vụ chuyển gen Cấu trúc biến nạp vào vi khuẩn E Coli DH5α Sau kiểm tra có mặt PCR clony cắt kiểm tra enzyme giới hạn PstI BamHI, cấu trúc pCambia 1301- Ubi- Sh2 chuyển vào dòng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens EHA105 C58 phương pháp xung điện để phục vụ cho mục đích chuyển gen KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tách dòng gen Sh2 cDNA tổng hợp từ RNA tổng số dòng ngơ H14 sử dụng để nhân gen Sh2 PCR với cặp mồi đặc hiệu ZmSh2F ZmSh2R Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1% (hình 1a) cho thấy, kết nhận đoạn gen có băng gọn 123 TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 122-128 rõ nét, kích thước phù hợp với tính tốn lý thuyết 1,5 kb Như vậy, kết luận bước đầu gen Sh2 nhân thành công; nhiệt độ bắt mồi cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho nhân gen Sh2 Sau gen Sh2 gắn vào vector tách dòng pBT biến nạp vào vi khuẩn E coli DH5, kết điện di sản phẩm clony PCR (hình 1b) cho thấy dòng khuẩn số cho băng gọn, rõ nét có kích thước tương ứng với đoạn gen mục tiêu 1,5 kb Kết điện di sản phẩm cắt plasmid sử dụng enzyme BamHI (hình 1c) cho thấy hai dòng khuẩn số cho băng gọn rõ nét: băng có kích thước khoảng 1,5 kb (tương ứng với kích thước lý thuyết đoạn gen Sh2) băng có kích thước khoảng kb (tương ứng với vector pBT) Do đó, kết luận dòng khuẩn số mang plasmid chứa đoạn gen có kích thước phù hợp với đoạn gen mong muốn gen Sh2 tách dòng thành cơng Hình (a): Điện di kiểm tra sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu nhân gen Sh2, M: DNA marker kb (Fermentas), 1: gen Sh2; (b): Điện di sản phẩm clony PCR với mồi đặc hiệu nhân gen Sh2, M: marker DNA kb, 1-7: Các mẫu khuẩn lạc lựa chọn đánh số thứ tự từ 1đến 7, +: đối chứng dương (mẫu nhân gen Sh2 từ cDNA tổng hợp); (c): Kết cắt kiểm tra có mặt gen Sh2 plasmid tái tổ hợp dòng khuẩn số 3, M: DNA marker kb, 2.1: sản phẩm cắt kiểm tra plasmid dòng khuẩn số 2, 3.1: sản phẩm cắt kiểm tra plasmid dòng khuẩn số Kết đọc trình tự đoạn gen Sh2 tách dòng (ký hiệu: Sh2-TD) cho thấy đoạn gen Sh2-TD có kích thước 1556 bp có độ tương đồng nucleotide tới 99% so với gen Sh2 có mã số NM_001127632.1 Ngân hàng Gen quốc tế - NCBI (bảng 1) Gen Sh2-TD có số sai khác số vị trí nucleotide (bảng 2) Tuy nhiên, kết so sánh trình tự acid amin suy diễn gen Sh2TD Sh2 (NM_001127632.1) cho mức độ tương đồng tới 99% Bảng Kết so sánh trình tự gen Sh2-TD gen Sh2 cơng bố Ngân hàng Gen với mã số NM_001127632.1 Mã số NM_001127632.1 Sh2 NM Sh2 61 NM Sh2 61 121 NM 121 124 Tên gen Zea mays Shrunken (Sh2) Mức độ so sánh 100% Mức độ tương đồng 99% MQFALALDTNSGPHQIRSCEGDGIDRLEKLSIGGRKQEKALRNRCFGGRVATTTQCILTS MQFALALDTNSGPHQIRSCEGDGIDRLEKLSIGGRKQEKALRNRCFGGRVA TTQCILTS MQFALALDTNSGPHQIRSCEGDGIDRLEKLSIGGRKQEKALRNRCFGGRVAATTQCILTS DACPETLHSQTQSSRKNYADANRVSAIILGGGTGSQLFPLTSTRATPAVPVGGCYRLIDI DACPETLHSQTQSSRKNYADANRVSAIILGGGTGSQLFPLTSTRATPAVPVGGCYRLIDI DACPETLHSQTQSSRKNYADANRVSAIILGGGTGSQLFPLTSTRATPAVPVGGCYRLIDI PMSNCFNSGINKIFVMSQFNSTSLNRHIHRTYLEGGINFADGSVQVLAATQMPEEPAGWF PMSNCFNSGINKIFVMSQFNSTSLNRHIHRTYLEGGINFADGSVQVLAATQMPEEPAGWF PMSNCFNSGINKIFVMSQFNSTSLNRHIHRTYLEGGINFADGSVQVLAATQMPEEPAGWF 60 60 120 120 180 180 Nguyen Thị Thu, Le Hoang Duc, Nguyen Duc Thanh Sh2 181 NM Sh2 181 241 NM Sh2 241 301 NM Sh2 301 361 NM Sh2 361 421 NM Sh2 421 481 NM 481 QGTADSIRKFIWVLEDYYSHKSIDNIVILSGDQLYRMNYMELVQKHVEDDADITISCAPV QGTADSIRKFIWVLEDYYSHKSIDNIVILSGDQLYRMNYMELVQKHVEDDADITISCAPV QGTADSIRKFIWVLEDYYSHKSIDNIVILSGDQLYRMNYMELVQKHVEDDADITISCAPV DESRASKNGLVKIDHTGRVLQFFEKPKGADLNSMRVETNFLSYAIDDAQKYPYLASMGIY DESRASKNGLVKIDHTGRVLQFFEKPKGADLNSMRVETNFLSYAIDDAQKYPYLASMGIY DESRASKNGLVKIDHTGRVLQFFEKPKGADLNSMRVETNFLSYAIDDAQKYPYLASMGIY VFKKDALLDLLKSKYTQLHDFGSEILPRAVLDHSVQACIFTGYWEDVGTIKSFFDANLAL VFKKDALLDLLKSKYTQLHDFGSEILPRAVLDHSVQACIFTGYWEDVGTIKSFFDANLAL VFKKDALLDLLKSKYTQLHDFGSEILPRAVLDHSVQACIFTGYWEDVGTIKSFFDANLAL TEQPSKFDFYDPKTPFFTAPRCLPPTQLDKCKMKYAFISNGCLLRECNIEHSVIGVCSRV TEQPSKFDFYDPKTPFFTAPRCLPPTQLDKCKMKYAFIS+GCLLRECNIEHSVIGVCSRV TEQPSKFDFYDPKTPFFTAPRCLPPTQLDKCKMKYAFISDGCLLRECNIEHSVIGVCSRV SSGCELKDSVMMGADTYETEEEASKLLLAGKVPVGIGRNTKIRNCIIDMNARIGKNVVIT SSGCELKDSVMMGADTYETEEEASKLLLAGKVPVGIGRNTKIRNCIIDMNARIGKNVVIT SSGCELKDSVMMGADTYETEEEASKLLLAGKVPVGIGRNTKIRNCIIDMNARIGKNVVIT NSKGIQEADHPEEGYYIRSGIVVILKNATINDGSVI 516 NSKGIQEADHPEEGYYIRSGIVVILKNATINDGSVI NSKGIQEADHPEEGYYIRSGIVVILKNATINDGSVI 516 240 240 300 300 360 360 420 420 480 480 Hình Kết so sánh trình tự acid amin suy diễn gen Sh2-TD (Sh2) Sh2 M_001127632.1 (NM) Bảng Vị trí sai khác trình tự nucleotide gen Sh2–TD gen Sh2 mang mã số NM_001127632.1 STT 10 11 12 Vị trí 156 753 777 987 990 1044 1143 1201 1260 1341 1365 1467 Sh2-TD A G C G C A A A G C C G Sh2 (NM_001127632.1) G A T A T T C G T A T T Bảng Vị trí sai khác trình tự acid amin gen Sh2 -TD gen Sh2 mang mã số NM_001127632.1 STT Vị trí thay đổi nucleotide 156 1201 Nucleotide gen Sh2-TD A A Nucleotide gen Acid amin Sh2 gen Sh2-TD (NM_001127632.1) G T (Threonin) G N (Asparagine) Dựa vào kết so sánh trình tự acid amin thấy có hai vị trí thay đổi nucleotide dẫn đến thay đổi acid amin (hình 2, bảng 3) Từ kết khẳng định tách dòng thành cơng gen Sh2 từ dòng Acid amin gen Sh2 (NM_001127632.1) A (Alanine) D (Aspartate) ngơ H14 Trình tự gen Sh2-TD công bố Genbank với mã số JX462603 Thiết kế vector chuyển gen Sau tách dòng, gen Sh2-TD gắn với vector biểu pCambia1301 với 125 TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 122-128 promoter Ubi để tạo vector chuyển gen mang gen Sh2-TD (hình 3) Tồn cấu trúc pCambia 1301-Ubi-Sh2 chuyển vào vi khuẩn E Coli DH5α A tumerfaciens cho mục đích chuyển gen vào ngơ Kết kiểm tra có mặt gen Sh2-TD dòng vi khuẩn E coli (hình 4) biến nạp cấu trúc pCambia 1301-Ubi-Sh2 PCR colony với mồi đặc hiệu gen Sh2 cho thấy plasmid E coli có băng với kích thước 1,5 kb tương ứng với kích thước gen Sh2 (hình 4a) Khi cắt kiểm tra có mặt gen Sh2-TD enzyme cắt giới hạn BamHI SacI (hình 4c) cho thấy dòng khuẩn 1, cho băng: băng có kích thước 10 kb (tương ứng với kích thước vector pCambia 1301), băng có kích thước khoảng 1,5 kb (tương ứng với kích thước gen Sh2) Như vậy, kết luận dòng khuẩn mang gen Sh2-TD Hình Cấu trúc vector chuyển gen pCambia 1301-Ubi-Sh2 Hình Kết kiểm tra có mặt gen Sh2-TD plasmid tái tổ hợp pCambia 1301-Sh2; (a): Kết chọn lọc dòng khuẩn chứa gen Sh2 PCR clony (M: DNA marker kb (Fermentas); 1-3: dòng khuẩn từ đến 3); (b): Kết tách plasmid dòng khuẩn chứa gen Sh2-TD (M: DNA marker kb; 1-3: plasmid dòng khuẩn từ đến 3); (c): Kết cắt kiểm tra có mặt gen Sh2-TD plasmid pCambia 1301-Ubi-Sh2 (M: DNA marker kb; 1-3: dòng khuẩn từ 1-3) Hình Kết kiểm tra có mặt gen Ubi vi khuẩn E Coli DH5α; (a): Kết kiểm tra có mặt gen Ubi PCR clony với mồi đặc hiệu nhân gen Ubi: (K3 đến K10: dòng khuẩn số đến số 10; M: DNA marker kb; (b): Kết cắt kiểm tra có mặt gen Ubi plasmid pCambia 1301-Ubi-Sh2 (M: DNA marker kb; 8, 9,10: dòng khuẩn 8, 10; 11: plasmid nguyên vẹn đối chứng) 126 Nguyen Thị Thu, Le Hoang Duc, Nguyen Duc Thanh Tương tự, kết kiểm tra có mặt gen Ubi dòng vi khuẩn E coli (hình 4a) biến nạp cấu trúc pCambia 1301-UbiSh2 PCR clony với mồi đặc hiệu gen Ubi cho thấy plasmid E coli mang băng có kích thước giống với kích thước đoạn gen Ubi (hình 5a) Sự có mặt gen Ubi kiểm tra cắt plasmid pCambia 1301Ubi-Sh2 với enzyme PstI BamHI dòng khuẩn lạc 8, 10 (hình 5c); kết cho hai băng có kích thước khoảng kb (tương ứng với kích thước đoạn gen Ubi) 10 kb (tương ứng với kích thước vector pCambia 1301) Các kết hình hình cho thấy, dòng khuẩn E coli DH5α kiểm tra mang plasmid có hai gen Sh2-TD Ubi Kết kiểm tra có mặt gen Sh2-TD Ubi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sau biến nạp cấu trúc pCambia 1301-Ubi-Sh2 sử dụng enzyme BamHI, SacI PstI cắt đồng thời (hình 6) cho thấy, plasmid mang vector chuyển gen pCambia 1301-Ubi-Sh2 chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefacien EHA105 C58 đề mang gen Sh2-TD promoter Ubi Trên hình thấy rõ băng tương ứng với kích thước pCambia 1301, gen Ubi Sh2 tương ứng 10 kb, kb 1,5 kb Từ kết tách dòng gen Sh2 thiết kế cấu trúc vector chuyển gen đến số kết luận sau: Đã tách dòng thành cơng gen Sh2 từ dòng ngơ H14 Gen Sh2 phân lập có mức tương đồng nucleotide với trình tự cơng bố Ngân hang Gen quốc tế lên tới 99% Trình tự đăng ký Ngân hang Gen quốc tế với mã số JX462603 Đã thiết kế thành công vector biểu pCambia 1301-Ubi-Sh2 Cấu trúc vector chuyển gen hoàn chỉnh pCambia 1301-Ubi-Sh2 biến nạp thành công vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefacien EHA105 C58 Kết thu nghiên cứu góp phần quan trọng nghiên cứu chuyển gen tăng cường tổng hợp tinh bột vào dòng ngơ Lời cảm ơn: Cơng trình thực khn khổ đề tài “Nghiên cứu tạo dòng ngơ bố mẹ tăng cường khả tổng hợp tinh bột công nghệ gen” thuộc Chương trình Trọng điểm phát triển ứng dụng Cơng nghệ Sinh học lĩnh vực Nông nghiệp phát triển nông thôn đến năm 2020 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bhave M R., Lawrence S., Barton C., Hannah L C., 1990 Identification and molecular characterization of shrunken-2 cDNA clones of maize Plant cell, 2(6): 581-588 Cobb B G., Hannah L.C., 1998 Shrunken-1 encoded sucrose synthase is not required for sucrose synthesis in the Maize Endosperm1 Plant Physiol., 88: 1219-1221 Hình Kết cắt kiểm tra có mặt gen Ubi Sh2 cấu trúc pCambia 1301-UbiSh2 biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefacien EHA 105 sử dụng enzyme BamHI, SacI PstI (M: DNA marker kb (Fermentas); 8, 9, 10: dòng khuẩn 8, 10; 11: plasmid nguyên vẹn đối chứng) KẾT LUẬN Denyer K., Dunlap F., Thorbjrnsen T., Keeling P., Smith A M., 1996 The major form of ADP-Glucose pyrophosphorylase in Maize endosperm 1s extra-plastidial Plant Physiol., 11 (2): 779-785 Tiessen A., Hendriks J H., Stitt M., Branscheid A., Gibon Y., Farré E M., Geigenberger P., 2002 Starch synthesis in potato tubers is regulated by posttranslational redox modification of ADPglucose pyrophosphorylase: a novel regulatory mechanism linking starch 127 TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 122-128 synthesis to the sucrose supply Plant cell, 14(9): 2191-213 James M G., Denyer K., Myers A M., 2003 Starch synthesis in the cereal endosperm Plant Biol., 6: 215-222 Li N., Zhang S., Zhao Y., Li B., Zhang J., 2011 Over- expression of AGPase genes enhances seed weight and starch content in transgenic maize Planta, 233: 241-250 Martinl C., Smith A M., 1995 Starch Biosynthesis The Plant Cell, 7: 971-985 Rozen S., Skaletsky H J., 2000 Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386 Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis T., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition) Cold Spring Harbor Laboratory, NY 10 Shannon J C., Creech R G., Loerch J D., 1970 Starch synthesis studies in Zea mays Plant Physiol., 45: 163-168 CLONING SHRUNKEN (Sh2) GENE FROM H14 MAIZE CULTIVAR AND CONSTRUCTING TRANSFORMATION VECTOR pCAMBIA 1301-UBI-SH2 Nguyen Thị Thu, Le Hoang Duc, Nguyen Duc Thanh Institute of Biotechnology, VAST SUMMARY The Shrunken (Sh2) gene encodes the large subunit of endosperm ADP-glucose pyrophosphorylase – one of the enzymes that regulate the starch biosynthetic pathway This gene had been transferred, successfully, to maize plant The transgenic maize plants have higher starch content than that of wild type In this article, we present the results on cloning the Sh2 gene by PCR from H14 maize cultivar and constructing transformation vector pCambia1301-Ubi-Sh2 The cloned Sh2 sequence had high similarity (99%) with sequence of Sh2 gene in Genbank with assesssion number NM_001127632.1 The sequence of Sh2 gene from H14 maize cultivar was submited to the GenBank with assession number JX462603 The gene was, then, successfully, inserted into expression vector pCambia1301 along with Ubiquitin promoter to construct a transformation vector pCambia 1301-Ubi-Sh2, that will be used for genetic engineering of starch in maize Keywords: ADP-glucose pyrophosphorylase, cloning, H14 maize cultiva, Shrunken gene, transformation vector Ngày nhận bài: 25-5-2013 128 ... 99% Bảng Kết so sánh trình tự gen Sh2-TD gen Sh2 cơng bố Ngân hàng Gen với mã số NM_001 127 6 32. 1 Mã số NM_001 127 6 32. 1 Sh2 NM Sh2 61 NM Sh2 61 121 NM 121 124 Tên gen Zea mays Shrunken (Sh2) Mức độ... (NM_001 127 6 32. 1) A (Alanine) D (Aspartate) ngơ H14 Trình tự gen Sh2-TD công bố Genbank với mã số JX4 626 03 Thiết kế vector chuyển gen Sau tách dòng, gen Sh2-TD gắn với vector biểu pCambia1 301 với 125 ... thước gen Sh2) Như vậy, kết luận dòng khuẩn mang gen Sh2-TD Hình Cấu trúc vector chuyển gen pCambia 1301-Ubi-Sh2 Hình Kết kiểm tra có mặt gen Sh2-TD plasmid tái tổ hợp pCambia 1301-Sh2; (a): Kết