Bài viết tiến hành tách dòng, biểu hiện và tinh chế Protein tái tổ hợp hFGF-10 ở E.coli để nghiên cứu các đặc tính của hFGF-10 tái tổ hợp trên các dòng tế bào.
25 (2): 25-28 6-2003 Tạp chí Sinh học Tách dòng biểu yếu tố sinh trởng nguyên bào sợi 10 cđa ng−êi (hFGF-10) ë E coli Ngun bÝch nhi ViƯn C«ng nghƯ sinh häc Masashi Suzuki ViƯn C«ng nghƯ sinh học Nhân chủng học quốc gia Nhật Bản Nhóm gien protein yếu tố sinh trởng nguyên bào sợi-Fibroblast Growth Factor (FGF) đóng vai trò quan trọng trình sinh trởng, biệt hóa tế bào, phát triển Chúng có tác dụng nh mitogien tham gia vào trình tạo mạch máu, làm lành vết thơng, sửa chữa mô Các polypeptit có 30-60% thành phần axit amin, exon intron có cấu trúc tơng tự vùng gien m hóa protein có hoạt lực với glycosaminoglycan heparin [1,2,3] FGF-10 thành viên thứ 10 gia đình FGF lần đợc tách chiết từ phôi chuột cống phơng pháp homology-PCR Yamasaki cs 1996 [4] cADN cña FGF-10 chuét cèng m hãa cho 215 axit amin (khoảng 24 kDa) với đầu N kỵ nớc, hoạt động nh signal peptit mARN FGF-10 đợc biểu nhiều phổi hFGF-10 ngời cADN lần đợc phân tách từ phổi phơng pháp RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) năm 1997 Emoto vµ cs [5] cADN cđa hFGF-10 m hãa cho mét protein gåm 208 axit amin cã tr×nh tù cã tính tơng đồng cao với FGF-10 chuột cống (95,6%) hFGF-10 nh FGF-10 chuột cống có đoạn tín hiệu trình tự đầu N (khoảng 40 axit amin đầu) Chúng đ tách dòng, biều tinh chế protein tái tổ hợp hFGF-10 E.coli để nghiên cứu đặc tính hFGF-10 tái tổ hợp dòng tế bào I phơng pháp nghiên cứu Tách dòng cADN cđa hFGF-10 ARN tỉng sè cđa n o ng−êi (Toyobo) đợc sử dụng làm mẫu cho phản ứng RT-PCR Phản ứng phiên m ngợc RT (reverse transcription) đợc tiến hành nh sau: hỗn hợp phản ứng bao gồm đệm RT, måi ngÉu nhiªn, DTT (dithio threitol), dNTP, chÊt øc chÕ ARN aza, MMLV (Moloney Murin leukemia virus) transcriptaza vµ ARN n o đợc ủ 37C 75 phút, sau ®ã pha lo ng b»ng n−íc cÊt S¶n phÈm thu đợc phản ứng RT (cADN) đợc sử dụng làm mẫu để chạy phản ứng PCR Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm đệm PCR, dNTPs, sản phẩm RT, mồi xuôi, mồi ngợc enzym PFU polymeraza Chơng trình chạy PCR: 94C phút, 35 chu trình : 94°C 45 gi©y, 55°C 45 gi©y, 72°C phút lần kéo dài cuối 72C 10 phút Cặp mồi đợc thiết kế để câu toàn gien hFGF -10 cADN với vị trí enzym hạn chế Sal I Bam HI định vị đầu 5'của chúng Mồi xuôi: 5'- CCC GTC GAC CAT TGG AAA TGG ATA CTG ACA C- 3' Måi ng−ỵc: 5'- CGC GGA TCC ACT ATG AGT GTA CCA CCA TTG G -3' S¶n phÈm cđa phản ứng RT-PCR đợc kiểm tra điện di gel agaroza 1% Đoạn ADN thu đợc đợc cắt khái gel agaroza, tinh chÕ b»ng kit Qia Quick (Qia Gen), sau đợc gắn vào vectơ tạo dòng pCR Script (Stragene) để kiểm tra trình tự đoạn cADN đợc đối 25 chiếu với trình tự hFGF-10 Ngân hàng gien DDBJ Trình tự đoạn gien đợc xác định máy ABI PRISM 310 (Perkin Elmer) Biểu protein tái tổ hợp hFGF-10 E coli Để biểu hFGF-10 protein E.coli, đoạn cADN m hóa cho protein hFGF-10 đ loại đoạn trình tự tín hiệu (axit amin từ 40-208) đợc nhân lên sử dụng hFGF-10 cADN làm mẫu mồi xuôi 5'-ATC ATA TGG CCC TTG GTC AGG CAC TG 3' với vị trí enzym hạn chế NdeI đầu 5' sử dụng mồi ngợc Phản ứng PCR đợc tiến hành điều kiện tơng tự đ mô tả Sản phẩm phản ứng PCR, sau đợc tinh chế QiaQuick kit, đợc gắn vào vectơ tách dòng PCR TRAP (GenHunter Corporation) để kiểm tra trình tự đoạn cADN Tiếp theo, đoạn cADN đợc thuỷ phân enzym hạn chế NdeI BamHI đợc gắn vào vị trí NdeI/BamHI đ đợc cắt tơng ứng vectơ biểu pET-3C với T7 promotơ để biểu protein tái tổ hợp hFGF-10 Plasmit ADN chứa đoạn hFGF-10 đợc biến nạp vµo tÕ bµo BL21(DE3)pLysS (E.coli) TÕ bµo E.coli cã chøa plasmit tái tổ hợp đợc nuôi qua đêm 37C m«i tr−êng láng Luria - Bertani (LB) chøa 50ug/ml ampixillin chloramphenicol Dịch nuôi cấy đợc pha lo ng 100 lần môi trờng LB bổ sung ampixillin chloramphenicol đợc ủ lắc 37C đến OD 600nm dịch nuôi cấy đạt 0.3 Thêm IPTG (isopropyl-1thio--D-galactopyranoside) vào dịch nuôi cấy tới nồng độ cuối 1mM nuôi tiếp 37C Các tế bào đợc thu hoạch ly tâm, cặn tế bào đợc hòa vào ®Öm GET (glucoza 1%, EDTA 10mM, Tris-HCl 25mM) chøa chÊt ức chế hoạt động proteinaza, tế bào đợc phá vỡ chu trình làm đông lạnh 70C, sau làm tan nhiệt độ phòng lần liên tiếp, đợc nghiền máy siêu âm ly tâm 15000 rpm/20 phút 4C Dịch đợc bảo quản -80C đến lúc sử dụng II Kết thảo luận Tách dòng hFGF-10 cADN tõ ARN tỉng sè cđa n·o ng−êi cADN cđa hFGF-10 đợc phân tách nhân lên phản ứng RT-PCR tõ ARN tỉng sè cđa n o ng−êi lµ đoạn gien có kích thớc khoảng 630 bp (hình 1) FGF-10 cADN Hình Điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR gelagaroza 1% nhuộm ethidium bromit Ghi chó: GiÕng 1: Marker ADN bËc thang 123 bp, giÕng 2: hFGF-10 cADN, giÕng 3: Marker λ/ HindIII Đoạn cADN đợc tinh chế gắn vào PCR Blue Script cloning vectơ để kiểm tra trình tự Kết cho thấy đoạn cADN gien hFGF-10 đối chiếu với số liệu Ngân hàng gien quốc tế có số đăng ký AB 002097 DDBJ (hình 2) 26 a t g t g g a a a t g g a t a c t g a c a c a t t g t g c c t c a g c c t t t c c c c a c c t g c c cg g c t g c t g c t g c t gctgctttttgttgctgttcttggtgtcttccgtccctgtcacctgccaagcccttggtcaggaca tggtgtcaccagaggccaccaactcttcttcttcctcctcttctcctctccttccagcgcgggaag g c a t g t g c t g a g c t c a a t c a c c t t c a a g g a g a t g t c c g c t g g a g a a g c t a tt t c t c t t t c a c c a a g t a c t t t c t c a a g a t t g a g a a g a a c g g g a a g g t c a g c g g g a c c a a g a ag g a g a a c t g c c c g t a c a g c a t c c t g g a g a t a a c a t c a g t a g a a t c g g a g t t g t t g c c g t c aa g c c a t t a a c a g c a a c t a t t a c t t a g c c a t g a a c a a g a a g g g g a a a c t c t a t g g c t c a a a ag a a t t t a a c a a t gactgtaagctgaaggagaggatagaggaaaatggatacaatacctatgcatcatttaactgg c a g c a t a a t g g g a g g c a a a t g t a t g t g g c a t t g a a t g g a a a a g g a g c t c c aa g g a g a g g a c a g a a a a c a c g a a g g a a a a a c a c c t c t g c t c a c t t t c t t c c a a t g g t g g t a c ac t c a t a g H×nh Tr×nh tù gien cđa h-FGF-10 BiĨu hiƯn cđa protein tái tổ hợp hFGF-10 E coli Để biểu protêin tái tổ hợp hFGF-10, vectơ biểu pET-3C đ đợc thiết kế để gắn đoạn gien hFGF-10 với vị trí cắt enzym hạn chế NdeI/BamHI Cặp mồi FGF-10, trừ đoạn tín hiệu peptit, đợc thiết kế để câu đoạn gien hFGF-10 đ loại đoạn tín hiệu peptit (khoảng 120 nucleotit m hóa cho 40 axit amin đầu N protêin tái tổ hợp hFGF-10) gắn vị trí cắt enzym NdeI/BamHI tơng ứng Đoạn cADN hFGF-10 đ loại đoạn tín hiệu peptit (đợc gắn vào vectơ tách dòng PCR TRAP để kiểm tra trình tự gien, sau đợc thủy phân NdeI BamHI đợc gắn vào vị trí tơng ứng NdeI/BamHI vectơ biểu pET-3C biến nạp vào tế bào khả biến GH (GenHunter) Các khuẩn lạc đợc kiểm tra đoạn gien đợc chèn vào phân tích khuẩn lạc sử dụng phản ứng PCR Các khuẩn lạc có chứa đoạn gien hFGF-10 đợc nuôi môi trờng LB qua đêm, thu tế bào để tách ADN plasmit ADN plasmit có chứa đoạn gien chèn đợc biến nạp vào tế bào BL21(DE3)pLysS Các tế bào đợc nuôi nh đ mô tả phơng pháp nghiên cứu Sự biểu protêin tái tổ hợp đợc tiến hành dịch nuôi cấy đạt OD 600nm xấp xỉ 0.3 điều kiện nuôi cấy lắc 37C, thêm IPTG (nồng độ cuối mM) vào dịch nuôi cấy tiếp tục nuôi tiếp hai nhiệt độ 37C 30C Sau đó, tế bào đợc thu hoạch ly tâm, phân giải đệm GET kiểm tra biểu protêin tái tổ hợp điện di SDS-PAGE (hình 3) kDa 97,4 66,0 45,0 31,0 21,5 FGF-10 14,5 Hình Sự biểu protêin tái tổ hợp hFGF-10 E.coli gel polyacrylamit 12% Ghi chú: Giếng 1: dịch chiết tế bào không cảm ứng IPTG; giếng 2: dịch chiết tế bào trớc cảm ứng IPTG; giếng 3: dịch chiết tế bào sau cảm ứng IPTG nuôi 37C; giếng 4: dịch chiết tế bào sau cảm ứng IPTG nuôi 30C Qua hình 3, quan sát thấy giếng 4, phổ protêin dịch chiết tế bào xuất băng đậm có kích thớc khoảng 20 kDa băng dịch chiết tế bào nuôi cấy đối chứng c¶m øng b»ng IPTG (giÕng 1) còng nh− tr−íc c¶m øng b»ng IPTG (giÕng 2) Nh− vËy cã mét protein tái tổ hợp kích thớc khoảng 20 kDa đ đợc sinh sau cảm ứng với IPTG Sự biểu protein điều kiện nhiệt độ 30oC 37C tơng tự nh 27 III Kết luận tài liệu tham khảo Qua kết đ trình bày trên, xin tóm tắt lại nh− sau: Beer H D et al., 1997: Oncogene, 15 (18): 2211-2218 Asada M et al., 1999: Growth Factors, 16: 293-303 Yoneda A et al 1999: Biotechniques, 27:576-590 Yamasaki M et al., 1996: J Biol Chem., 271: 15918-15921 Emoto H et al., 1997: J Biol.Chem., 272 (37): 15918-15921 Đ tách đợc gien hFGF-10 từ cADN đợc tổng hợp từ ARN n o ngời dài 624 bp, có trình tự khớp với trình tự đ đăng ký ngân hàng gien AB 002097 DDBJ Đ thiết kế vectơ biểu pET-3C để gắn gien hFGF-10 biểu thành công protêin tái tổ hợp hFGF-10 E.coli Protein tái tổ hợp hFGF-10 có kÝch th−íc kho¶ng 20 kDa CLONING and EXPRESSION OF the HUMAN FIBROBLAST GROWTH FACTOR 10 (hFGF-10) IN E COLI Nguyen Bich Nhi, Masashi Suzuki Summary Full length hFGF-10 cDNA (624 bp - 208 amino acids) was amplified from the human brain total RNA by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and cloned into the pCR Script cloning vector for the verification of the DNA sequence as hFGF-10 (accession number AB 002097 in DDBJ and GenBank Nucleotide Sequence Databases) For the expression of hFGF-10 in E.coli, the cDNA encoding hFGF-10 (amino acids 40-208 eliminating the N-terminal sequence) was amplified and cloned into the pET-3C expression vector with cloning sites NdeI/BamHI and transfected into the BL21(DE3)pLysS cells E.coli cells bearing the recombinant plasmid were grown in LB medium containing ampicillin and chloramphenicol until OD 600 nm reached 0.3 and the expression of the hFGF-10 was induced by adding IPTG and followed by incubation at 37°C or 30°C for 3h Cells were centrifuged, resuspended in GET buffer and lysed by sonication The supernatants were cleared by the centrifugation and analysed by SDS-PAGE The results showed that the hFGF-10 recombinant protein was produced and its size was about 20kDa Ngµy nhËn bµi: 12-3-2002 28 ... h-FGF -10 Biểu protein tái tổ hợp hFGF -10 E coli Để biểu protêin tái tổ hợp hFGF -10, vectơ biểu pET-3C đ đợc thiết kế để gắn đoạn gien hFGF -10 với vị trí cắt enzym hạn chế NdeI/BamHI Cặp mồi FGF -10, ... gien hFGF -10 biểu thành công protêin tái tổ hợp hFGF -10 E.coli Protein tái tổ hợp hFGF -10 có kích thớc khoảng 20 kDa CLONING and EXPRESSION OF the HUMAN FIBROBLAST GROWTH FACTOR 10 (hFGF -10) IN... thảo luận Tách dòng hFGF -10 cADN từ ARN tổng số não ngời cADN hFGF -10 đợc phân tách nhân lên phản ứng RT-PCR từ ARN tổng số n o ngời đoạn gien có kích thớc khoảng 630 bp (hình 1) FGF -10 cADN Hình