Bài viết nghiên cứu chuyển và biểu hiện gien yếu tố sinh trưởng nguyên bào sợi 10 người (HFGF-10) ở tế bào động vật bậc cao. Để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
25(4): 37-41 12-2003 Tạp chí Sinh học Chuyển Biểu gien yếu tố sinh trởng nguyên bào sợi 10 ngời (hFGF-10) tế bào động vật bậc cao nguyễn bÝch nhi ViƯn C«ng nghƯ sinh häc Masashi Suzuki ViƯn nghiên cứu quốc gia Sinh học Công nghệ ngời, Nhật Bản Các yếu tố sinh trởng nguyên bào sợi Fibroblast growth factors (FGFs) polypeptit có hoạt tính gây phân bào mạnh, đợc đặc trng lực cao heparin Các thành viên nhóm FGF đóng vai trò quan trọng nhiều trình sinh lý nh trình sinh trởng tế bào, trình biệt hóa tế bào, hình thành mô, mạch máu, trình sửa chữa làm lành vết thơng, [7] Gien hFGF-10 thành viên thứ 10, đợc tách lần Emoto vµ cs [4] tõ phỉi cADN cđa gien hFGF-10 m hãa cho mét protein hFGF-10 cã chøa 208 axÝt amin, có tơng đồng cao với FGF-10 chuột cống (95.6%) Còng nh− FGF-10 cđa cht cèng, FGF-10 cđa ng−êi có đầu N tận có tính kỵ nớc cao (khoảng 40 axít amin) hoạt động nh tín hiệu trình tự [4, 10] Nhiều thành viên nhãm gien FGF cã chøa tÝn hiƯu tr×nh tù m hóa cho protein tiết Một sốthành viêncủa nhóm FGF nh− FGF-5 [2, 3], FGF-7 [5], FGF-9 [6], FGF-9 [9] có chứa vị tríN- glycosyl, số thành viên FGF đ đợc tinh chế dạng glycosyl Tuy nhiên, tợng glycosyl hóa cha đợc nghiên cứu Để tìm hiểu chức FGF-10 biến đổi mạch cacbohydrat, đ thiÕt kÕ mét hƯ thèng biĨu hiƯn cđa FGF10 ë tế bào động vật sử dụng vectơ biểu pcADN 3.1(-)Myc-His I phơng pháp nghiên cứu Thiết kế vectơ biểu pcADN3.1(-)Myc-His (VersionB) Đoạn FGF-10 ngời cADN đ đợc tách nhân lên từ ARN tổng số n o ng−êi (Toyobo) b»ng ph¶n øng RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) sử dụng oligonucleotit tổng hợp Vectơ pcADN3.1(-) Myc-His Version B (Invitrogen) đợc thiết kế để sản sinh protein tái tổ hợp tế bào động vật đ đợc sử dụng để gắn đoạn hFGF-10 cADN vào vị trí cắt enzym hạn chế Xho//HindIIIvới đầu C tận chứa đuôi polyhistidin gắn kim loại (His tag) đoạn myc (c-myc) epitop ADN plasmit chứa toàn gien hFGF10 đ đợc sử dụng làm mẫu cho phản ứng PCR với cặp mồi 5'-CCC CTC GAG ATG AAA TGG ATA CTG ACA C-3' vµ 5'-CCC AAG CTT GAG TGA CCA CCA TTG GAA G-3' với vị trí cắt enzym hạn chế XhoI HindIII định vị đầu 5' Sản phẩm phản ứng PCR đợc cắt từ agaroza gel, sau ®ã sư dơng QiaQuick PCR kit (QiaGen) ®Ĩ tinh gắn vào vectơ pCR Script (Stratagene) để kiểm tra trình tự đoạn cADN Tiếp theo, vectơ pCR Script có chứa đoạn hFGF-10 cADN đợc thủy phân enzym hạn chế XhoI HindIII (TaKaRa, Nhật Bản) đợc gắn vào vị trí tơng ứng XhoI/HindIII vectơ phản ứng gắn kết (ligation reaction) Hỗn hợp phản ứng gắn đợc biến nạp vào E.coli Các khuẩn lạc chứa đoạn hFGF-10 cADN đợc tuyển chọn kiểm tra trình tự máy xác định trình tự ABI PRISM( Perkin Elmer) để khẳng định gien hFGF-10 (theo trình tự đ đăng ký Ngân hàng liệu gien số AB 002097) đ đợc gắn vào vị trí với đầu Ctận peptit 37 Nuôi tế bào: Tế bào COS-1 COS-7 đợc mua từ Ngân hàng gien Riken (Tsukuba, Ibaraki, Japan) Các tế bào đợc nuôi ổn định môi trờng DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) chøa 10% FBS (Fetal Bovine Serum) ë 37°C vµ 5% CO2 Chun gien TÕ bµo COS-1 COS-7 đ đợc chuyển gien hFGF-10 cADNsử dụng Lipofectamin 2000 (LF 2000) (Gibco BP) vµ SuperFect (SF) (Qiagen) a) Sù chun gien hFGF-10 vµo tÕ bµo COS-1 vµ COS-7 sử dụng LF2000 Vào hôm trớc ngày chuyển gien, tế bào đợc thủy phân trypsinaza, đếm cấy vào đĩa có đờng kính 60 mm, đĩa có ì105 tế bào để cho chúng phủ 90-95% mặt đáy đĩa vào ngày chuyển gien Các tế bào đợc nuôi bình thờng môi trờng DMEM cã bæ sung 10% FBS Cho ug ADN plasmit có chứa gien hFGF-10 vào 500 ul DMEM không bổ sung FBS 33.6 ul LF 2000 đ đợc pha lo ng 500 ul DMEM vµ đ vòng phút nhiệt độ phòng ADN đ đợc pha lo ng phối hợp với LF 2000 đ pha lo ng hỗn hợp đợc ủ nhiệt độ phòng phút để tạo phức liên kết ADN - LF 2000 Hút loại môi trờng nuôi cấy cũ từ đĩa, cho ml DMEM 1ml ADN-sLF 2000 vào đĩa, nuôi tiếp tủ nu«i cÊy CO2 ë 37°C 4-5 giê DMEM chøa 20% FBS đợc cho vào cho nồng độ cuối đĩa 10% FBS Các tế bào đợc thu hoạch sau 24 48 b) Sự chun gien hFGF-10 vµo tÕ bµo COS-1 vµ COS-7 sư dụng SF Trớc ngày chuyển gien, tế bào đợc thủy phân trypsinaza, đếm cấy vào đĩa có đờng kính 60 mm, đĩa có ì 105 tế bào cho chúng phủ 80% mặt đáy đĩa vào ngày chuyển gien môi trờng DMEM có bổ sung 10% FBS Đối với đĩa, ug ADN đợc pha vào 150 ul DMEM 30 ul SF đợc cho vào dung dịch ADN hỗn hợp đợc ủ nhiệt độ phòng phút, sau thêm 1ml DMEM chứa 10% FBS Môi trờng nuôi cấy cũ đợc hút loại bỏ từ đĩa, tế bào đợc rửa đệm PBS, sau cho hỗn hợp 38 ADN-SF vào đĩa Các tế bào đợc ủ tủ nuôi cấy 37C, 5% CO2 2-3 Sau loại bỏ môi trờng chứa phần lại phức hợp ADN-SF, tế bào đợc rửa đệm PBS thêm 5ml môi trờng DMEM với 10% FBS ủ tiếp 24 48 đến thu hoạch c) Phân tích biểu protein tái tổ hợp hFGF-10 tế bào COS-1 COS-7 Để xác định protein hFGF-10 bên tế bào, tế bào đợc rửa đệm PBS lạnh (không chứa Ca, Mg) hai lần, sau đợc phân giải đệm RZPA (20 mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.1% deoxycholat, 0.1% SDS, mM NaVO4) 30 phút 4C Dịch phân giải tế bào đợc ly tâm 15000 rpm 20 phút 4C, dịch dịch chiết tế bào đợc bảo quản -20C Để xác định protein hFGF-10 đợc tiết từ tế bào vào môi trờng nuôi cấy, môi trờng nuôi cấy đợc ly tâm 3000 rpm phút 4C, dịch đợc ly tâm tiếp 15000 rpm 10 ë 4°C LÊy dÞch đ với nhựa Ni-NTA qua đêm 4C, nhồi nhựa vào cột, rửa đệm phosphate 50mM, pH8.0, 300mM NaCl, 10 mM Imidazol Dịch rửa đợc đo OD280nm đến đạt xấp xỉ Protein hFGF-10 đợc ®Öm phètphat 50 mM, pH = 8.0, M NaCl, M Imidazol Dịch protein đợc bảo quản -20C sử dụng Các mẫu dịch chiết tế bào dịch chiết từ môi trờng nuôi cấy đợc biến tính 2mercaptoethanol đợc chạy SDS-PAGE 12% gel Các protein tách đợc chuyển sang màng nitroxelluloza (Schleicher & Schuell, Germany), sau đợc ủ với 5% skim milk, nhuộm với monoclonal antihistidin antibody đợc xác định với HRP- conjugated secondary antibody againts mouse IgG đợc hiển thị với ECL kit (Amersham) Thủy phân liên kết N-glycosidaza N-glycosidaza F (PNGaza, peptit-N4 axêtyl-glucosaminyl) asparagin amidaza (Boehringer Mannheim) đ đợc sử dụng để thủy phân protein glycosylated hFGF-10 mẫu dịch phân giải tế bào môi trờng nuôi cấy.Các mẫu sau đợc thêm SDS đến nồng độ cuối 0.1%, đợc đun 95C phút, làm lạnh, thêm NP-40 cho nồng độ đạt 1% thêm N-glycosidaza (2 Units/10ug glycoprotein) Các hỗn hợp đợc ủ 37C qua đêm, sau dịch thủy phân enzym đợc chạy SDS-PAGE phân tích Western - Blotting nh đ đợc mô tả II Kết Quả thảo luận 31.0 BiĨu hiƯn cđa hFGF-10 myc-his ë tÕ bµo COS-1 COS-7 sử dụng LF-2000 Các tế bào đ đợc chuyển gien môi trờng nuôi cấy đợc thu hoạch sau 24 giê (1 ngµy) vµ 48 giê (2 ngµy) Dịch tế bào môi trờng nuôi cấy đợc xử lý nhựa Ni-NTA đợc phân tích phơng pháp WesternBlotting sử dụng kháng thể kháng histidin Kết đợc biểu thị hình 1 456 78 21.5 14.5 H×nh BiĨu hiƯn cđa hFGF-10 myc-his ë dịch tế bào COS-1, COS-7 tách chiết từ môi trờng nuôi cấy Ghi chú: Các protein đ đợc phân tách SDS-PAGE, sau đợc chuyển sang màng nitroxelluloza đợc ủ với kháng thể đơn dòng kháng histidin Markơ có lợng phân tử thấp (kDa) Giếng 1, 2: dịch tế bào COS-1 sau ngày, ngày chuyển gien Giếng 3, dịch tế bào COS-7 sau ngµy chun gien GiÕng 5, 6: môi trờng nuôi cấy tế bào COS-1 đợc thu hoạch ngµy, ngµy sau chun gien GiÕng 7, 8: môi trờng nuôi cấy tế bào COS-7 sau 1, ngày chuyển gien Từ kết nhận đợc hình 1, thấy hai loại mẫu phân tích mẫu dịch tế bào (giếng 1, 2, 3, 4) mẫu môi trờng nuôi cấy đ đợc xử lý (giếng 5, 6, 7, 8) phát băng bắt màu với kháng thể kháng histidin tơng ứng với số dạng đợc tiết FGF-10 Điều chứng tỏ gien tái tổ hợp hFGF-10 đ đợc chuyểnsang tế bào COS1, COS-7 đợc biểu dới dạng protein có khả tiếtđ đợc tổng hợp tế bào tiết vào môi trờng nuôi cấy Các kết cho thấy biểu gien hFGF-10 tế bào COS-1 mạnh tế bào COS-7 điều kiện tơng ứng Trong dịch tế bào hai loại COS-1 COS-7, quan sát thấy có ba băng, số có hai băng đậm Băng vị trí tơng ứng với protein có kích thớc khoảng 32-33 kDa, dạng glycolysed hFGF-10 myc-his Băng nhận hFGF-10 myc-his tái tổ hợp ( dạng thờng gặp) với trọng lợng phân tử khoảng 27 kDa (trọng lợng phân tử toàn gien hFGF-10 xấp xỉ 24 kDa, thêm đuôi myc-his xấp xỉ kDa, tổng cộng khoảng 27 kDa) Băng dới hFGF-10 myc-his đoạn tín hiệu trình tự tơng ứng với trọng lợng phân tử khoảng 22-23 kDa (đoạn gien hFGF-10 loại bá tÝn hiƯu tr×nh tù m hãa cho mét polypeptit có trọng lợng xấp xỉ 19-20 kDa, cộng thêm đoạn đuôi myc-his kDa từ vectơ pcADN) Chúng cßn kiĨm tra sù biĨu hiƯn cđa hFGF-10 sư dơng hai môi trờng nuôi cấy có điều kiện DMEM có bổ sung 0.1%và 10% FBS Các kết nhận đợc cho thấy biểu hFGF10 đợc nuôi cấy m«i tr−êng DMEM cã bỉ sung 0.1% FBS thÊp môi trờng có bổ sung 10% FBS (các kết không trình bày) Sự biểu FGF-10 dịch tế bào sau ngày chuyển gien cao sau hai ngày chuyển gien Ngợc lại, môi trờng nuôi cấy đ đợc xử lý nhựa Ni-NTA, nồng độ 39 FGF-10 ngày sau chuyển gien thấp hai ngày sau chuyển gien Tỷ số nồng độ FGF-10 dịch tế bào môi trờng nuôi cấy thời điểm ngày sau chuyển gien đợc ớc lợng xấp xỉ 3:1, thời điểm hai ngày sau chuyển gien tơng ứng khoảng 1:1 Các kết FGF-10 đ đợc tiết từ tế bào vào môi tr−êng thêi gian nu«i cÊy Trong m«i tr−êng nu«i cấy, biểu hFGF-10 có hai băng phía tơng ứng với băng có kích thớc 32 kDa 22 kDa dịch tế bào Các kết 31.0 biểu cđa FGF-10 ë tÕ bµo COS-1 vµ COS-7 FGF-10 tiÕt số dạng khác Biểu cđa hFGF-10 myc-his ë tÕ bµo COS-1 vµ COS-7 sư dụng Super Fect (SF) Kết tơng tự nhận đợc sử dụng tác nhân chuyển gien SF để chuyển gien hFGF-10 vào tế bào COS-1 COS-7 (hình 2) Từ kết sử dụng hai loại tác nhân LF 2000 SF để chun FGF-10 vµo tÕ bµo COS-1 vµ COS-7 234 678 21.5 14.5 H×nh Sù biĨu hiƯn cđa hFGF-10 myc-his ë tÕ bµo COS-1 vµ COS-7 sư dơng Super Fect phản ứng hóa miễn dịch với antihistidin monoclonal antibody Ghi chus: Markơ protein có trọng lợng phân tử thấp (kDa) Giếng 1, 2: dịch tế bào COS-1 ngày, ngày sau chuyển gien Giếng 3, 4: dịch tế bào COS-7 ngày, ngày sau chuyển gien Giếng 5, 6: môi trờng nuôi cấy tế bào COS-1 thời điểm ngày, ngày sau chuyển gien Giếng 7, 8: môi trờng nuôi cấy tế bào COS-7 thời điểm ngµy, ngµy sau chun gien Gien hFGF-10 đợc biểu phần dới dạng glyccosyl Để khẳng định băng (32 kDa) thuộc dạng glycosyl gien hFGF-10, đ tiến hành thủy phân glycoprotein 31.0 dịch tế bào dịch môi trờng nuôi cấy đ xử lý nhựa Ni-NTA enzym Nglycosidaza điều kiện đ mô tả phần phơng pháp nghiên cứu Dịch thủy phân enzym đợc sử dụng để phân tích Western-Blotting Kết nhận đợc hình 23 45 21.5 14.5 Hình Sự thủy phân N-glycosidaza dịch tế bào môi trờng nuôi cấy tế bào COS-1 đ đợc chuyển gien hFGF-10 sử dụng tác nhân LF 2000 Ghi chú: Protein chuẩn có trọng lợng phân tử thấp (kDa) Giếng 1, 2: mẫu dịch tế bào đợc thu hoạch thời điểm ngày, ngµy sau chun gien GiÕng 3, 4: mÉu dịch tế bào đợc thu hoạch ngày, ngày sau thủy phân N-glycosidaza Giếng 5: mẫu môi trờng nuôi cấy trớc thủy phân enzym Giếng 6, 7: mÉu m«i tr−êng nu«i cÊy sau thđy phân N-glycosidaza 40 Qua hình nhận thấy, dịch tế bào môi trờng nuôi cấy mẫu sau đợc thủy phân N-glycosidaza, băng tơng ứng với kích thớc khoảng 32 kDa bị biến băng thứ tơng ứng với kích thớc 27 kDa đợc dày lên Nh khẳng định băng phía 32 kDa dạng glycosyl gien hFGF-10 đ bị N-glycosidaza thủy phân để biến thành hFGF-10 Nh hFGF-10 đợc biểu tế bào động vật dới dạng glycosyl không glycosyl Các kết nhận đợc từ tác giả khác [4-11] chứng minh số thành viên FGF biểu dạng glyccosyl (FGF-6, FGF-16, ) Tài liệu tham khảo Asada M et al., 1999: Growth Factor, 16: 293-303 Bates B et al., 1991: Mol.Cell Biol., 11: 1840-1845 Clements D A et al., 1993: Oncogene, 8: 1311-1316 Emoto H et al., 1997: J Biol Chem., 272(37): 23191-23194 Hsu Y R et al., 1998: Protein Expr.Purf., 12: 189-200 MacArthur C A et al., 1995: Cell Growth Differ, 6: 817-825 III kết luận Sử dụng tác nhân chuyển gien Lipogectamin 2000 (LF 2000) Super Fect (SF), đ chuyển đợc gien hFGF-10 vµo tÕ bµo COS-1 vµ COS-7 Sù biĨu hiƯn cđa gien hFGF-10 ë tÕ bµo COS-1 vµ COS-7 sử dụng LF-2000 SF dịch tế bào môi trờng nuôi cấy có giống Trong dịch tế bào môi trờng nuôi cấy hFGF-10 tái tổ hợp đợc biểu dạng glycosyl không glycosyl hóa Trong dịch tế bào, có thêm dạng hFGF-10 tái tổ hợp thiếu đoạn signal sequence McKeehan W L., Wang F., Kan M., 1998: Prog Nucleic Acid Res Mol Biol., 59: 135-176 Revest J M., DeMoerlooze L., Dickson C., 2000: J Biol Chem., 275: 8083-8090 Santos-Ocampo S et al., 1996: J.Biol Chem., 19: 1726-1731 10 Yamasaki M et al., 1996: J Biol Chem., 271: 15918-15921 11 Yoneda A et al., 1999: Biotechniques, 27: 576-590 Transfection and expresion of the human fibroblast growth factor –10 (hFGF-10) in mammalian cells Nguyen Bich Nhi, Masashi Suzuk SUMMARY We have constructed a pcDNA 3.1.(-)Myc-His Version B vector for expression of the hFGF-10 recombinant proteins in the COS-1 and COS-7 cells LipoFectamin 2000 (LF-2000) and SuperFect (SF) were used for transient transfection The expression of hFGF-10 recombinant proteins in COS-1 and COS-7 cells was analysed by SDS-PAGE following Western-Blotting analysis using anti-histidine antibody The results showed that hFGF-10 proteins were secreted and expressed inseveral glycosylated and non-glycosylated forms in the cells and in the culture medium Ngµy nhËn bµi: 12-3-2003 41 ... LF2000 Vào hôm trớc ngày chuyển gien, tế bào đợc thủy phân trypsinaza, đếm cấy vào đĩa có đờng kính 60 mm, đĩa có 105 tế bào để cho chúng phủ 90-95% mặt đáy đĩa vào ngày chuyển gien Các tế bào. .. Trớc ngày chuyển gien, tế bào đợc thủy phân trypsinaza, đếm cấy vào đĩa có đờng kính 60 mm, đĩa có ì 105 tế bào cho chúng phủ 80% mặt đáy đĩa vào ngày chuyển gien môi trờng DMEM có bổ sung 10% FBS... FGF -10 Điều chứng tỏ gien tái tổ hợp hFGF -10 đ đợc chuyểnsang tế bào COS1, COS-7 đợc biểu dới dạng protein có khả tiếtđ đợc tổng hợp tế bào tiết vào môi trờng nuôi cấy Các kết cho thấy biểu gien