Nghiên cứu sự biểu hiện một số OXA β lactamase của acinetobacter baumannii kháng carbapenem phân lập ở khu vực đông nam bộ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN TUẤN ANH NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN MỘT SỐ OXA β-lactamase CỦA Acinetobacter baumannii KHÁNG CARBAPENEM PHÂN LẬP Ở KHU VỰC ĐÔNG NAM BỘ Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số chuyên ngành: 62 42 30 15 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC TP Hồ Chí Minh – Năm 2018 Cơng trình hồn thành tại: Công ty TNHH CNSH Khoa Thương; Bộ môn Di truyền - Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM; Đơn vị Nghiên cứu lâm sàng Đại học Oxford (OUCRU) – Bệnh viện Bệnh nhiệt đới TP HCM Người hướng dẫn khoa học: HDC: PGS TS Hồ Huỳnh Thùy Dương HDP: TS BS Nguyễn Văn Vĩnh Châu Phản biện 1: PGS TS Trần Cát Đông Phản biện 2: TS Lê Thị Thúy Ái Phản biện 3: TS Đặng Thanh Dũng Phản biện độc lập 1: TS Nguyễn Đình Thắng Phản biện độc lập 2: TS Nguyễn Thanh Thùy Nhiên Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp sở đào tạo họp trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM vào hồi …… …… ngày …… tháng …… năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tổng hợp Quốc gia Tp.HCM Thư viện trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHCM ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm khuẩn bệnh viện thách thức lĩnh vực chăm sóc sức khỏe giới Nhiều vi khuẩn có khả nguyên nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện ngày có nhiều báo cáo tình trạng kháng thuốc vi khuẩn Hiện nay, vi khuẩn Acinetobacter baumannii, khả kháng với nhiều loại kháng sinh, tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện hàng đầu thách thức lớn cho lĩnh vực y tế tồn cầu Đối với Thế giới nói chung Việt Nam nói riêng, vi khuẩn Acinetobacter baumannii xem tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến với nhiều nghiên cứu cho thấy tỉ lệ kháng carbapenem vi khuẩn mức cao Chúng thực đề tài “Nghiên cứu biểu số OXA β-lactamase Acinetobacter baumannii kháng carbapenem phân lập khu vực Đông Nam Bộ” với mục tiêu sau: Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu nhằm tìm hiểu chế kháng carbapenem liên quan đến biểu số gene blaOXA có hoạt tính carbapenemase số chủng A baumannii lâm sàng thu thập khu vực Đông Nam Bộ Mục tiêu cụ thể Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh chủng A baumannii lâm sàng thu thập từ bệnh viện khu vực Đông Nam Bộ khoảng thời gian 2012-2014 Nghiên cứu dịch tễ học phân tử chủng A baumannii lâm sàng diện số gene blaOXA phổ biến vi khuẩn Đánh giá mối liên hệ mức độ biểu gene blaOXA tính kháng imipenem số chủng A baumannii lâm sàng Chương – TỔNG QUAN TÀI LIỆU TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình kháng kháng sinh 1.1.1 Trên giới Tại Hoa Kỳ, tỉ lệ A baumannii kháng carbapenem tăng gấp đôi qua năm: từ 20,6% năm 2002 lên 49,2% năm 2008 (Hình 1.1) Trong 91,2% chủng A baumannii kháng carbapenem Ở nước Châu Âu khác, tỷ lệ kháng cao tìm thấy Hy Lạp với tỷ lệ A baumannii kháng carbapenem lên đến 90% số đơn vị chăm sóc đặc biệt Năm 2015, báo cáo nghiên cứu Ý cho thấy tỷ lệ kháng carbapenem lên tới 100% Châu Mỹ la tinh khu vực có tỷ lệ Acinetobacter baumannii kháng với meropenem, imipenem, ceftazidime, piperacillin/tazobactam, ciprofloxacin hay gentamicin cao giới Khơng có quốc gia khơng xuất chủng đa kháng Tại Australia, ghi nhận gia tăng đáng kể tỷ lệ kháng A baumannii trước (27%) sau tháng năm 2003 (≥ 75%) Tại châu Á, nghiên cứu dịch tễ học lâm sàng đơn vị chăm sóc đặc biệt Ấn Độ cho thấy tỷ lệ A baumannii đa kháng đa thuốc 92%, vượt xa hai đối tượng lại P aeruginosa (35%) E coli (5%) Ở Đài Loan, A baumannii tác nhân phổ biến gây nhiễm khuẩn bệnh viện Trong đó, tỷ lệ kháng carbapenem A baumannii lên tới 62,5% Năm 2012, báo cáo nghiên cứu khác thực quốc gia khu vực Châu Á – Thái Bình Dương cho thấy có đến quốc gia có tỷ lệ A baumannii kháng carbapenem cao, có Thái Lan (76,3%), Singapore (90,5%) Việt Nam (89,5%) 1.1.2 Ở Việt Nam Các nghiên cứu Việt Nam A baumannii cho thấy kết tương tự so với giới phát triển tính kháng mức độ kháng kháng sinh Các kết nghiên cứu năm gần cho thấy tỷ lệ kháng carbapenem A baumannii cao, từ 80-90% chủng khảo sát 1.2 Nhóm kháng sinh β-lactam Nhóm kháng sinh β-lactam chiếm khoảng 50% kháng sinh sử dụng khắp giới, nhóm kháng sinh quan trọng việc chống nhiễm khuẩn người 1.2.1 Lịch sử hình thành phát triển Penicillin kháng sinh thuộc nhóm β-lactam phát Cephalosporin C kháng sinh cephalosporin phát Kháng sinh β-lactam bán tổng hợp ampicillin Gần carbapenem kháng sinh β-lactam đơn vòng monobactam Tuy nhiên, số lượng kháng sinh cấp phép đưa vào sử dụng ngày theo thời gian (Hình 1.2) Ngược lại, ngày có nhiều báo cáo tình trạng kháng kháng sinh vi khuẩn 1.2.2 Phân loại Ngày nay, kháng sinh nhóm β-lactam phân thành nhóm lớn penicillin, cephalosporin, monobactam carbapenem (Bảng 1.1) 1.2.3 Cơ chế tác động Nhóm kháng sinh β-lactam hoạt động nhằm kìm hãm tổng hợp vách tế bào vi khuẩn 1.2.4 Đơi nét kháng sinh carbapenem Kháng sinh carbapenem có cấu trúc tương tự penicillin nguyên tố lưu huỳnh thay nguyên tố cacbon (Hình 1.4) Carbapenem hoạt động theo chế giống β-lactam khác Yếu tố ưu việt tính kháng khuẩn hiệu carbapenem khả gắn với nhiều PBP khác 1.3 Hệ enzyme β-lactamase Có 1000 loại β-lactamase vi khuẩn Gram (-) Sản xuất βlactamase chế kháng kháng sinh chủ yếu vi khuẩn Các enzyme thường tập trung vùng chu chất, phân hủy kháng sinh β-lactam, ngăn cản kháng sinh tiếp cận với PBP Hệ thống phân loại Ambler chia β-lactamase thành lớp, đặt tên từ A đến D, dựa tương đồng trình tự amino acid 1.3.1 β-lactamase lớp A β-lactamase lớp A serine carbapenemase, có khả giảm nhạy cảm vi khuẩn với tất β-lactam bao gồm penicillin, cephalosporin, monobactam, cefamycin, ceftazidime, imipenem, meropenem, ertapenem, cefotaxime aztreonam 1.3.2 β-lactamase lớp B Các β-lactamase lớp B metallo-β-lactamase (MBL), có khả ly giải gần tất kháng sinh nhóm β-lactam ngoại trừ monobactam khơng bị ức chế clavulanic acid, tazobactam sulbactam 1.3.3 β-lactamase lớp C β-lactamase lớp C, AmpC β-lactamase có hoạt tính carbapenemase Khi AmpC β-lactamase kết hợp với giảm nhạy cảm porin hoạt động bơm đẩy (efflux bump), tính kháng đặc biệt gia tăng đến mức có ý nghĩa lâm sàng 1.3.4 β-lactamase lớp D Nhóm β-lactamase lớp D cịn gọi oxacillinase (blaOXA) Chúng có hoạt tính kháng yếu với carbapenem, biểu gene blaOXA carbapenemase gia tăng nhân tố điều hòa biểu gene vùng thượng nguồn 1.4 Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii diện phổ biến toàn cầu trở thành nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện, liên quan đến khả kháng nhiều loại kháng sinh Carbapenem xem loại thuốc nằm phác đồ “cứu vãn” điều trị A baumannii đa kháng thuốc Tuy nhiên, tỷ lệ kháng gia tăng carbapenem vi khuẩn A baumannii báo cáo giới 1.4.1 Phân loại, mô tả tầm quan trọng Acinetobacter baumannii vi khuẩn Gram (-) hội, khơng lên men đường, thường tìm thấy đất nước, diện da người khỏe mạnh, đặc biệt nhân viên y tế Có nhiều loại Acinetobacter tất chúng có khả gây bệnh cho người, A baumannii gây nên 80% trường hợp nhiễm A baumannii nguy hiểm chỗ có khả kháng lại tất loại kháng sinh β-lactam (penicillin, cephalosporin, carbapenem), tetracycline, aminoglycoside, fluoroquinolone 1.4.2 Bộ gene Acinetobacter baumannii A baumannii AYE có kích thước gene 3.9 Mb, chứa “đảo kháng thuốc” (resistance island) dài 86 kb, vùng “đảo” lớn phát từ trước tới nay, chứa 45 gene kháng thuốc liên quan đến nhiều lớp kháng sinh khác gene khác liên quan đến tính ổn định gene integrase, transposase trình tự chèn Điều cho thấy tính linh động vùng “đảo kháng thuốc” khả tiếp thu nhanh chóng gene kháng chủng A baumannii AYE 1.4.3 Cơ chế kháng kháng sinh Acinetobacter baumannii Biến đổi kháng sinh sản xuất enzyme β-lactamase: A baumannii có khả tiết β-lactamase để kháng lại kháng sinh nhóm β-lactam, đặc biệt oxacillinase hay OXA carbapenemase Carbapenemase nhóm enzyme β-lactamase quan trọng A baumannii, giúp chúng trở thành chủng đa kháng kháng sinh mở rộng (extended drug resistance, XDR) Sự biểu vượt mức gene blaOXA liên quan đến diện trình tự gắn chèn (insertion sequence, IS) gene blaOXA khác phổ biến trình tự chèn khác Và chế khác chế tiếp thu gene kháng mới, thay đổi tính thấm màng, bơm đẩy kháng sinh, đột biến điểm, biến đổi màng tế bào Giữa chế kháng giúp A baumannii kháng đa thuốc đa thuốc mở rộng chế sản xuất enzyme β-lactamase chế quan trọng Trong đó, oxacillinase (OXA) ln diện A baumannii chế kháng carbapenem phổ biến vi khuẩn Vì thế, đối tượng nghiên cứu 1.4.4 Xu hướng nghiên cứu giới Acinetobacter baumannii liên quan đến đề tài Các nghiên cứu giới có liên quan đến đề tài A baumannii tập trung vào số hướng điển nghiên cứu dịch tễ học phân tử chủng A baumannii đa kháng thuốc chế kháng thuốc chúng, liên quan đến vai trị trình tự chèn q trình điều hịa biểu blaOXA, vai trò bơm đẩy kháng sinh, … Chương – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.1.1 Chủng vi khuẩn Chủng A baumannii ATCC 19606 163 chủng A baumannii lâm sàng (Phụ lục 2) 2.1.2 Môi trường nuôi cấy Môi trường Luria-Bertani (LB), môi trường Nutrient Agar (NA), môi trường Mueller-Hinton (MH) Agar 2.1.3 Mồi mẫu dò Mồi mẫu dò cho phản ứng PCR sử dụng nghiên cứu trình bày Bảng 2.1 2.1.4 Thiết bị dụng cụ Thiết bị, dụng cụ vật liệu tiêu hao dùng nghiên cứu phổ biến phịng thí nghiệm sinh hóa, vi sinh sinh học phẩn tử 2.1.5 Hóa chất Hóa chất dùng nghiên cứu bao gồm: PCR real-time PCR, hóa chất điện di, hóa chất giải trình tự gene, hóa chất điện di mao quản phân tích đoạn, hóa chất tách chiết protein, hóa chất định lượng protein, hóa chất định hoạt tính enzyme β-lactamase, que thử E-test cho kháng sinh imipenem, oxacillin, 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phương pháp thu mẫu, bảo quản tăng sinh vi khuẩn Thu mẫu: Tổng cộng 163 chủng Acinetobacter baumannii phân lập từ bệnh phẩm bệnh viện khu vực phía nam khoảng thời gian 2012 đến 2014 bao gồm bệnh viện Đại học Y Dược (ĐHYD), bệnh viện Đồng Nai (ĐN) bệnh viện Thống Nhất Đồng Nai (TNĐN) Bảo quản: Khuẩn lạc đơn bảo quản mơi trường LB có 30% glycerol -80oC Tăng sinh: Khuẩn lạc đơn A baumannii chuyển vào ống nghiệm chứa mL môi trường LB lỏng khử trùng, nuôi cấy lắc tăng sinh 37oC, 120 rpm đến mật độ đạt đơn vị McFarland chuẩn (McFarland standard) để thực thí nghiệm 2.2.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu số kháng sinh sử dụng Nồng độ ức chế tối thiểu imipenem (MICimp) xác định phương pháp E-test (bioMerieux) cho tất chủng A baumannii nghiên cứu Chủng A baumannii có MICimp ≥ μg/mL xem chủng kháng ≤ μg/mL xem nhạy với imipenem (CLSI, 2014) 2.2.3 Phương pháp tách chiết DNA DNA gene A baumannii tách chiết theo nguyên tắc hấp phụ đặc hiệu lên pha rắn (màng silica) Chất lượng DNA tách chiết được đánh giá dựa tỷ số OD260/280 pha loãng tới nồng độ 25 ng/μL cho tất mẫu trước tiến hành phản ứng PCR 2.2.4 Các phương pháp PCR Phương pháp real-time PCR phát gene blaOXA: Các cặp mồi đặc hiệu cho gene blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51, blaOXA-58 16S rRNA (Bảng 2.1) thiết kế đánh giá Hỗn hợp chương trình cho phản ứng multiplex real-time PCR sử dụng mẫu dò Taq-Man tối ưu hóa để phát blaOXA-23, blaOXA-51, blaOXA58 16S rRNA Phương pháp PCR xác định diện vị trí số trình tự chèn: Các cặp mồi sử dụng phản ứng PCR đặc hiệu với trình tự chèn trình bày Bảng 2.1 Đồng thời, vị trí trình tự chèn (nếu có) xác định tương đối so với gene blaOXA cách dựng đồ sản phẩm PCR (PCR mapping) Phương pháp duplex real-time PCR: cho phép nhân đồng thời cDNA gene mục tiêu (blaOXA-23, blaOXA-51 blaOXA-58) gene đối chứng (16S rRNA) phản ứng sử dụng mồi/mẫu dò đặc hiệu cho tác nhân đích, khơng có cạnh tranh (ức chế lẫn nhau) mồi/mẫu dò Mức độ biểu tương đối gene blaOXA-23/-51/-58 tính tốn dựa biểu gene 16S rRNA phương pháp 2-ΔΔCt 2.2.5 Phương pháp giải trình tự gene Phương pháp giải trình tự gene sử dụng để khẳng định trình tự gene blaOXA nghiên cứu, vị trí thượng nguồn trình tự chèn diện so với gene blaOXA tương ứng, xác định số đơn vị lặp lại gene phương pháp MLVA xác định trình tự đặc trưng gene giữ nhà phương pháp MLST 2.2.6 Phương pháp tách chiết RNA phản ứng phiên mã ngược RNA tách chiết theo nguyên tắc dựa hòa tan khác RNA, DNA protein dung môi hữu (phenol, chloroform) nước Sau đó, RNA xử lý với enzyme DNase I để loại bỏ hoàn toàn DNA, tiếp tục đánh giá chất lượng dựa tỷ số OD260/280 Tình trạng hoàn toàn DNA gene khẳng định phản ứng realtime PCR nhân gene blaOXA-51 16S rRNA mẫu RNA xử lý chưa qua phản ứng phiên mã ngược RNA tinh phiên mã ngược thành cDNA, dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng duplex real-time PCR sau Phương pháp định lượng tương đối 2-ΔΔCt Phương pháp định lượng tương đối cho phép định lượng mức độ biểu gene mục tiêu mẫu khác so với mẫu hiệu chuẩn thơng qua trung gian gene đối chứng, tính cơng thức 2ΔΔCt Trong đó: ∆∆C = ∆Ct ụ ê − ∆Ct ệ ẩ Ở mẫu khảo sát (cảm ứng): ∆Ctmục tiêu = CtblaOXA – Ct16S rRNA Ở mẫu hiệu chuẩn (không cảm ứng): ∆Cthiệu chuẩn = CtblaOXA – Ct16S rRNA 2.2.7 2.2.8 Phương pháp tách chiết định lượng nồng độ protein Trong nghiên cứu này, phương pháp định lượng protein theo Bradford (1976) ứng dụng để xác định hàm lượng protein tổng sau tách chiết từ dịch hay chu chất mẫu vi khuẩn A baumannii nuôi cấy Phần dịch (phân đoạn ngoại bào) thu nhận sau ly tâm dịch nuôi cấy vi khuẩn tủa với ethanol tuyệt đối Phân đoạn chu chất thu hồi từ cặn tế bào sau phá màng tế bào với chloroform Chương – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết đề tài bao gồm hai nội dung Nội dung thứ liên quan đến việc xây dựng kiểm tra hiệu quy trình thực nghiệm nội dung thứ hai bao gồm nghiên cứu kháng kháng sinh, dịch tễ học phân tử gene kháng chế kháng carbapenem vi khuẩn A baumannii lâm sàng PHẦN 1: XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG CÁC QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI 3.1 Xây dựng quy trình multiplex real-time PCR phát Acinetobacter baumannii gene blaOXA Phản ứng xây dựng nhằm nhân phát đồng thời sản phẩm tương ứng gene blaOXA phản ứng realtime PCR 3.1.1 Tối ưu điều kiện phản ứng monoplex real-time PCR DNA tổng hợp nhân tạo đoạn gene tương ứng với nồng độ nhau: 2x102, 2x104, 2x106 2x108 sao/µL sử dụng Kết cho thấy phản ứng monoplex real-time PCR tối ưu với gene blaOXA với nhiệt độ lai tối ưu chọn 60,0oC Đây điều kiện sở để đánh giá phản ứng multiplex PCR sau 3.1.2 Tối ưu điều kiện phản ứng multiplex real-time PCR Để cho thuận tiện việc phát đồng thời gene blaOXA A baumannii, chúng tơi kết hợp mồi/mẫu dị phát blaOXA23, blaOXA-51, blaOXA-58 16S rRNA phản ứng Kết Bảng 3.7 cho thấy phản ứng multiplex real-time PCR đạt điều kiện tối ưu Hơn nữa, giá trị Ct nồng độ mẫu phản ứng multiplex realtime PCR gần tương đương với phản ứng monoplex real-time PCR phát gene tương ứng (Bảng 3.1và Bảng 3.2) Vì thế, phản ứng multiplex real-time PCR cho tối ưu thành công để phát đồng thời gene blaOXA A baumannii phản ứng 10 3.1.3 Độ đặc hiệu kỹ thuật Quy trình xây dựng đặc hiệu với gene blaOXA 16S rRNA A baumannii 3.1.4 Độ nhạy kỹ thuật Quy trình có khả phát xác gene blaOXA-23, blaOXA-51, blaOXA-58 đặc trưng A baumannii với độ nhạy (4-6 sao/phản ứng) 3.2 Kiểm tra hiệu hoạt động phương pháp MLVA Phương pháp MLVA đánh giá lại điều kiện phịng thí nghiệm Kết cho thấy để nhân locus MLVA, tức vùng gene khác nhau, cần dùng phản ứng multiplex PCR, thay bình thường phải dùng phản ứng monoplex PCR Sản phẩm phản ứng multiplex PCR từ chủng A baumannii lâm sàng, điện di mao quản (Hình 3.7) để xác định kích thước xác giải trình tự để xác định số lần lặp lại đoạn gene tương ứng với locus (Phụ lục 16) Trên sở đó, tương quan kích thước số lần lặp lại locus chủng lại xác định Tổ hợp số lần lặp lại locus khác chủng cho biết đặc điểm di truyền đặc trưng chủng (Phụ lục 3) Trên sở này, phân lồi MLVA (Hình 3.15) xây dựng để đánh giá mối liên hệ di truyền chủng A baumannii thu thập 3.3 Kiểm tra hiệu hoạt động phương pháp MLST Kết kiểm tra cho thấy điều kiện phản ứng PCR phù hợp để nhân gene giữ nhà locus Các sản phẩm nhân giải trình tự Kết giải trình tự locus 23 chủng trình bày Phụ lục Các kiểu allele cho locus tổ hợp MLST chủng tương ứng (Bảng 3.26) xác định chương trình tích hợp sở liệu MLST (Oxford) A baumannii Từ đó, mối liên hệ di truyền chủng A baumannii phân tích 3.4 Xây dựng phản ứng duplex real-time RT-PCR nghiên cứu biểu gene blaOXA-23/-51/-58 Chúng sử dụng phản ứng duplex real-time RT-PCR để nghiên cứu biểu gene blaOXA-23/-51/-58 Phản ứng có hai bước, bước phản ứng phiên mã ngược, biến đổi RNA thành cDNA bước 11 phản ứng duplex real-time PCR, nhân cDNA hai gene 16S rRNA blaOXA-51/-23/-58 phản ứng Kết tối ưu phản ứng duplex real-time PCR trình bày sau Để kết nghiên cứu biểu gene blaOXA xác, trước tiến hành bước 1, RNA tách chiết cần phải xử lý DNase, để làm DNA gene Hơn nữa, phản ứng duplex real-time PCR cần chứng minh phù hợp để nghiên cứu biểu gene blaOXA23/-51/-58 theo phương pháp 2-∆∆Ct hệ số góc phương trình tương quan giá trị ∆Ct log[cDNA] nằm khoảng giá trị từ -0,1 đến 0,1 [66] 3.4.1 Khảo sát lượng enzyme DNase sử dụng Kết Bảng 3.10 cho thấy hàm lượng enzyme sử dụng µL/phản ứng xử lý, DNA tồn dư mẫu bị phân hủy hoàn tồn 3.4.2 Tối ưu hóa phản ứng real-time PCR có cặp mồi/mẫu dò Phản ứng monoplex real-time PCR phát gene blaOXA tối ưu để làm sở tối ưu phản ứng duplex real-time PCR sau Kết Bảng 3.11 cho thấy phản ứng real-time PCR phát blaOXA23, blaOXA-51 đạt điều kiện tối ưu Kết Bảng 3.12 cho thấy thành phần phản ứng với AptaTaq 1,5X điều kiện tốt gene 16S rRNA, AptaTaq 2X điều kiện tốt phản ứng nhân gene blaOXA-58 3.4.2 Tối ưu hóa phản ứng duplex real-time PCR O23/16S, O51/16S O58/16S Các phản ứng duplex real-time PCR O23/16S, O51/16S O58/16S tối ưu Kết cho thấy nồng độ enzyme AptaTaq 2X, phản ứng real-time PCR O23/16S đạt chuẩn (Bảng 3.15) phản ứng real-time PCR O51/16S đạt chuẩn (Bảng 3.16) Tại nồng độ mồi/mẫu dò 300/150 nM, phản ứng real-time PCR O58/16S đạt chuẩn (Bảng 3.17) 3.4.3 Đánh giá phản ứng duplex real-time RT-PCR nghiên cứu biểu gene blaOXA-23/-51/-58 Chứng minh hiệu phản ứng duplex real-time PCR tối ưu sử dụng để tính biểu tương đối gene blaOXA-23/-51/-58 theo phương pháp 2-∆∆Ct, tiến hành pha loãng mẫu cDNA xác 12 định nồng độ (từ mẫu vi khuẩn A baumannii có mang gene blaOXA-23/51/-58) thành nồng độ Các mẫu pha loãng chạy phản ứng duplex real-time PCR Kết thu phương trình tương quan giá trị ∆Ct (giữa 16S rRNA blaOXA-23/-51/-58) giá trị log[cDNA] (Hình 3.9) Kết chi tiết trình bày Phụ lục 17 Phương trình tương quan ∆Ct (16S rRNA blaOXA-23; 16S rRNA blaOXA-51; 16S rRNA blaOXA-58) giá trị Log[cDNA] có giá trị hệ số góc 0,0513; 0,0669 0,0623 < 0,1 Như vậy, phản ứng duplex real-time PCR blaOXA-51/-23/-58 16S rRNA sử dụng để ước lượng biểu tương đối gen blaOXA-51/-23/-58 phương pháp 2-∆∆Ct 3.5 Xây dựng quy trình cảm ứng biểu gene blaOXA Chúng nghiên cứu biểu gene blaOXA-23/-51/-58 điều kiện cảm ứng kháng sinh oxacillin, chất enzyme oxacillinase gene mã hóa 3.5.2 Khảo sát đường cong tăng trưởng A baumannii Để xác định thời điểm cảm ứng (giữa pha log) điều kiện phịng thí nghiệm, đường cong tăng trưởng A baumannii khảo sát Dựa vào kết Hình 3.10 chúng tơi chọn thời điểm cảm ứng kháng sinh giá trị McFarland chuẩn (giữa pha log) thời điểm thu nhận sinh khối tế bào giá trị McFarland chuẩn (cuối pha log) 3.5.3 Khảo sát nồng độ kháng sinh cảm ứng Dựa vào kết thí nghiệm, chúng tơi chọn nồng độ oxacillin µg/mL để quan sát biểu gene blaOXA-51 blaOXA khác nghiên cứu 3.5.4 Khảo sát nguồn thu nhận protein Dựa vào kết thí nghiệm, chúng tơi định thu nhận protein từ chu chất dịch cho thí nghiệm sau đánh giá hoạt tính β-lactamase chủng A baumannii lâm sàng PHẦN 2: CÁC NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHÍNH Trong nội dung này, đặc điểm kháng kháng sinh chủng A baumannii lâm sàng, diện yếu tố di truyền liên quan đến tính kháng kháng sinh, mối liên hệ di truyền chủng, biểu 13 gene blaOXA chủng A baumannii thu thập từ bệnh viện miền Nam đặc biệt hoạt tính β-lactamase số chủng A baumannii mang gene blaOXA-58 phân tích 3.6 Thơng tin mẫu Acinetobacter baumannii kháng sinh đồ 163 chủng A baumannii thu thập từ bệnh viện định danh lại diện gene 16S rRNA blaOXA-51, sử dụng tiếp cho phân tích sâu Bộ chủng bao gồm 38 chủng từ bệnh viện ĐHYD, 45 chủng từ bệnh viện ĐN 80 chủng từ bệnh viện TNĐN Dựa vào định nghĩa, 163 chủng A baumannii có 120 chủng XDR, bao gồm 27/38 (71,1%) từ bệnh viện ĐHYD, 38/45 (84,4%) từ bệnh viện ĐN 55/80 (68,8%) từ bệnh viện TNĐN Khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê tỷ lệ XDR bệnh viện (p = 0,148) Số lượng chủng kháng imipenem cao từ bệnh viện ĐHYD, ĐN TNĐN với tỷ lệ 84,2% (32/38), 84,4% (38/45) 77,5% (62/80) Tỷ lệ không khác biệt mặt thống kê (p = 0,539), thể Bảng 3.22 Khi so sánh nhóm XDR khơng-XDR tính nhạy/kháng kháng sinh cho thấy số đặc tính Đối với imipenem, hầu hết chủng XDR kháng, có 3/120 chủng nhạy (p = 0,318) Cịn chủng KhơngXDR 15/43 chủng kháng imipenem, lại nhạy (p = 0,117) Riêng với tính kháng carbapenem, 120 chủng XDR, có 117 (97,5%) kháng imipenem (Bảng 3.23) Ba chủng nhạy với imipenem, kháng meropenem Tính kháng imipenem cao (> 32 μg/mL) xác định 109/120 (90,8%) chủng kháng imipenem / XDR Đối với 43 chủng không-XDR, 28 (65,1%) chủng nhạy có 15 (34,9%) chủng kháng với imipenem (Bảng 3.23) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê tỷ lệ XDR không-XDR hai mức độ imipenem khảo sát 32 µg/mL, có p