Bài viết sử dụng hai giống đậu xanh KP11 và MN93 làm nguyên liệu để tách dòng và so sánh trình tự Nucleotit của gien Phốtpho-lipaza và nghiên cứu cây đậu xanh, cũng như góp phần gắn thời gian chọn các giống đậu xanh phục vụ sản xuất.
28(4): 74-82 12-2006 Tạp chí Sinh học Tách dòng gien m· hãa phèTpho-liPAZA C3 ë hai gièng ®Ëu xanh Vigna radiata (L.) Wilczek KP11 vµ MN93 Ngun Vò Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu Đại học Thái Nguyên Phạm Thị Vân, Lê Trần Bình Viện Công nghệ sinh học Đậu xanh Vigna radiata (L.) Wilczek mặt hàng nông sản xuất với nhiều u điểm quan trọng hệ thống sản xuất lơng thực thực phẩm [1] Cây đậu xanh chịu hạn, chịu úng Việc nghiên cứu mối quan hệ gien với khả chống chịu điều kiện ngoại cảnh bất lợi đậu xanh đợc đề cập đến Trong nghiên cứu này, sử dụng hai giống đậu xanh KP11 MN93 làm nguyên liệu để tách dòng so sánh trình tự nucleotit gien phốtpho-lipaza C3 (PLC3) nhằm đa phơng pháp sinh học phân tử vào nghiên cứu đậu xanh, nh góp STT Ký hiƯu måi F1 F2 F3 phÇn rót ngắn thời gian chọn giống đậu xanh phục vụ sản xuất I phơng pháp nghiên cứu Vật liệu Hai giống đậu xanh KP11 MN93 Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp Véctơ tách dòng pTZ57R/T hãng Fermentas cung cấp Các loại hóa chất, dụng cụ thiết bị phục vụ cho thí nghiệm sinh học phân tử Ba cặp mồi PLC3 ký hiệu F1, F2, F3 cã tr×nh tù nh− sau: Tr×nh tù mồi Nhiệt độ gắn mồi 5ATGTCCAAGCAGACTTACAGC3 5CTCAGCCACTTTGGCCTGAAG3 5GAGGTCTATTAAGCAGTATGC3 5AATGCAACCATCTGGGCTCCA3 5AGGCACTCGTATTGCCTCAAC3 5TCAAATGAATTCAAAGCGCAT3 54oC Phơng pháp a ADN tổng số đợc tách chiết theo phơng pháp Gawel Jarnet [7] có cải tiến Chất lợng nồng độ ADN đợc xác định máy quang phổ hấp phụ hãng Shimadzu (model 8452A), Nhật Bản b Dựa sở liệu khai thác Ngân hàng gien quốc tế, thiết kế mồi để nhân gien phốtpho-lipaza C3 Vì đoạn gien có kích thớc lớn (khoảng 4000 nucleotit) nên khó biến nạp đọc trình tự nucleotit gien đợc Do nhợc điểm trên, nên thiết kế cặp mồi để nhân đoạn gien lớn Đặc điểm cặp mồi đợc thiết kế gối lên nhau, để sau đọc xong trình tự nucleotit đoạn gien nhân cặp mồi 74 54oC 54oC này, ghép lại thành gien hoàn chỉnh Kích thớc dự kiến cặp mồi là: cặp mồi thø nhÊt (ký hiƯu F1) cã kÝch th−íc 1570 nucleotit, cỈp måi thø hai (ký hiƯu F2) cã kÝch th−íc 1331 nucleotit cặp mồi thứ ba (ký hiệu F3) cã kÝch th−íc 1482 nucleotit c Nh©n gien PLC3 b»ng kỹ thuật PCR PCR đợc tiến hành với tổng thể tích phản ứng 50 àl gồm: ADN mẫu (50 ng/àl) µl, måi (10 µM) µl, dNTP (2,5 mM) µl, MgCl2 (25 mM) µl, Taq polymeraza (5 U/àl) 0,8 àl, buffơ PCR (10X) àl, H2O khử ion 27,2 àl d Chu trình nhiệt bao gồm b−íc sau: 94oC-3 phót; 94oC-50 gi©y, 54oC-1 phót, 72oC-1 30 giây lặp lại 35 chu kỳ; 72oC - 10 phút lu giữ 4oC Tách dòng đọc trình tự: sản phẩm PCR gien PLC3 đợc kiểm tra điện di gel agaroza 1%, sau đợc làm (thôi gel) theo Kit QIAquick Gel Extraction đợc gắn trực tiếp vào véctơ pTZ57R/T đợc biến nạp vào tế bào khả biến chủng Esherichia coli DH5 Trình tự nucleotit gien PLC3 đợc xác định thành đoạn F1, F2, F3 máy đọc trình tự nucleotit tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer hãng Ampplied Biosystem Kết đọc trình tự đợc xử lý nối ghép phần mềm DNAstar BioEdit Sơ đồ thí nghiệm tổng quát: Hạt đậu xanh Mầm ngày tuổi ADN tổng số ↓ PCR víi cỈp måi F1, F2, F3 ↓ F1 1570 nucleotit F2 1331 nucleotit F3 1482 nucleotit ↓ Dòng hóa Chọn dòng Tách plasmit Đọc trình tự nucleotit đoạn gien Xử lý nối đoạn thành gien PLC3 dài 4215 nucleotit II Kết thảo luận Với mục đích nhân đoạn gien m· hãa PLC3 Nh©n gien PLC3 cđa giống đậu xanh KP11 MN93 M 1F1 2F1 1F2 2F2 1F3 2F3 2000 bp 1500 bp H×nh KÕt PCR nhân gien PLC3 giống đậu xanh KP11 MN93 với cặp mồi F1, F2, F3 Ghi chú: M thị phân tử 100 bp; 1F1 2F1 s¶n phÈm PCR cđa hai gièng KP11 MN93 víi cỈp måi F1; 1F2 2F2 s¶n phÈm PCR cđa hai gièng KP11 MN93 víi cặp mồi F2; 1F3 v 2F3 l sản phẩm PCR cđa hai gièng KP11 MN93 víi cỈp måi F3 75 đậu xanh, tiến hành tách chiết ADN tổng số với số lợng đủ lớn Các mẫu ADN đợc pha loãng nồng độ 50 ng xác định mật độ hấp thụ tia tử ngoại máy quang phổ, đảm bảo đủ độ tinh khiết để tiến hành bớc nghiên cứu Dựa phân tích trình tự nucleotit gien PLC3 giống đậu xanh đợc công bố Ngân hàng gien quốc tế với mã số AY394078, thiết kế cặp mồi F1, F2, F3 gối lên để nhân phát có mặt gien PLC3 giống đậu xanh KP11 MN93 Kích thớc đoạn gien đợc nhân lên cặp mồi F1 khoảng 1570 nucleotit, cặp mồi F2 khoảng 1330 nucleotit cặp mồi F3 khoảng 1480 nucleotit Đoạn gien PLC3 giống đậu xanh đợc nhân lên phơng pháp PCR sử dụng cặp mồi F1, F2, F3 Kết nhân gien đợc kiểm tra cách điện di gel agaroza 1% đợc thể hình Hình cho thấy mẫu nhận đợc đoạn ADN đặc hiệu có kích thớc khoảng 1570 nucleotit víi cỈp måi F1, 1331 nucleotit víi cỈp mồi F2 1482 nucleotit với cặp mồi F3 so với thang ADN chuẩn; hàm lợng sản phẩm đủ lớn để sử dụng cho việc tách dòng Kết tách dòng gien PLC3 Quá trình tách dòng đợc thực cách gắn sản phẩm PCR tinh vào véctơ tách dòng pTZ57R/T, sau biến nạp vào tế bào khả biến chủng E coli DH5 đợc cấy trải môi trờng LB đặc có bỉ sung ampixillin 100 mg/ml, X-gal 40 mg/ml vµ IPTG 100 àM ủ đĩa petri 37oC 16 Kết thu đợc khuẩn lạc xanh trắng Tiến hành chọn dòng thông qua phản ứng colonyPCR Chọn khuẩn lạc trắng nuôi môi trờng LB lỏng có bổ sung ampixillin 100 mg/ml qua đêm Lấy khuẩn mẫu chạy phản ứng clony PCR với cặp mồi pUC18 để xác định khuẩn lạc có plasmit mang gien mong muốn Vì cặp mồi pUC18 cặp mồi đợc thiết kế chung cho véctơ tạo dòng nên kiểm tra sản phẩm PCR vừa dòng hóa kích thớc đoạn gien vừa nhân lên cao khoảng 200 nucleotit so với nhân cặp mồi đặc hiệu Nh vậy, kích thớc sau dòng hóa đoạn gien đợc nhân cặp mồi F1 1770 nucleotit, đoạn gien đợc nhân cặp mồi F2 1531 nucleotit đoạn 76 gien đợc nhân cặp mồi F3 1682 nucleotit Sản phẩm colony PCR đợc điện di kiểm tra gel agaroza 1% (hình 2) M 1F1 2F1 1F2 2F2 1F3 2F3 2000 bp 1500 bp H×nh Kết điện di sản phẩm colony-PCR gel agaroza 1% Ghi chú: nh hình Kết điện di hình cho thấy sản phẩm colony PCR từ khuẩn lạc trắng cho kết dơng tính Tất mẫu cho băng kích thớc, chứng tỏ kết biến nạp chọn dòng thực tốt, phản ứng PCR đạt mức tối u Nh vậy, khẳng định việc nối ghép sản phẩm PCR vào véctơ tách dòng đạt kết nh mong muốn Tiến hành chọn khuẩn lạc trắng tơng ứng với mẫu nghiên cứu có sản phẩm colony PCR nh mong muốn để tách plasmit theo bé kit QIAprep Spin Miniprep S¶n phÈm ADN plasmit đợc điện di gel agaroza 1% Kết đợc thể hình 1F1 2F1 1F2 2F2 1F3 2F3 Hình Kết điện di tách plasmit Ghi chó: 1F1 2F1 plasmit cđa hai gièng KP11 v MN93 đợc nhân cặp mồi F1; 1F2 2F2 plasmit cña hai gièng KP11 MN93 đợc nhân cặp mồi F2; 1F3 v 2F3 l plasmit hai giống KP11 v MN93 đợc nhân cặp mồi F3 Kết điện di hình cho thấy sản phẩm tách plasmit sạch, đảm bảo chất lợng số lợng để tiến hành đọc trình tự nucleotit intron vµ exon Vïng coding (vïng m· hãa) Kết xác định trình tự nucleotit Để xác định xác gien PLC3 đợc gồm 1776 nucleotit mã hóa 591 axít amin (trừ tách dòng, tiến hành đọc trình tự axit amin mở đầu) Khi so sánh trình tự nucleotit đoạn gien đợc nhân lên ba BLAST NCBI, kết cho biết cặp mồi F1, F2, F3 máy đọc tự động ABI trình tự nucleotit gien mã hóa PLC3 đậu xanh Chúng kết luận tách dòng thành PRIMS 3100 Avant Genetic Analyzer theo công đoạn gien mã hóa PLC3 đậu xanh chiều xuôi chiều ngợc Trình tự nucleotit Sơ đồ cấu trúc gien PLC3 giống gien PLC3 mẫu nghiên cứu thu đợc, đem phân tích, xử lý phần mềm DNAstar đậu xanh KP11 vµ MN93 dµi 4215 nucleotit víi exon intron: BioEdit Kết cho thấy kích thớc gien PLC3 mẫu nghiên cứu 4215 nucleotit, gåm c¶ E1 I1 E2 I2 E3 I3 E4 I4 E5 I5 E6 I6 E7 I7 E8 I8 E9 E1 (exon 1) gåm 315 nucleotit: tõ vÞ trÝ nucleotit ®Õn 314 (1 314) E2 (exon 2) gåm 197 nucleotit: 889 1085 E3 (exon 3) gåm 136 nucleotit: 1438 1573 E4 (exon 4) gåm 246 nucleotit: 1654 1899 E5 (exon 5) gåm 230 nucleotit: 2004 2233 E6 (exon 6) gåm 118 nucleotit: 2698 2815 E7 (exon 7) gåm 153 nucleotit: 3481 3633 E8 (exon 8) gåm 87 nucleotit: 3739 3825 E9 (exon 9) gåm 294 nucleotit: 3922 4215 I1 (intron 1) gåm 574 nucleotit: 315 888 I2 (intron 2) gåm 352 nucleotit: 1086 1473 I3 (intron 3) gåm 80 nucleotit: 1574 1653 I4 (intron 4) gåm 104 nucleotit: 1900 2003 I5 (intron 5) gåm 464 nucleotit: 2234 2697 I6 (intron 6) gåm 665 nucleotit: 2816 3480 I7 (intron 7) gåm 105 nucleotit: 3634 3738 I8 (intron 8) gåm 96 nucleotit: 3826 3921 So sánh trình tự nucleotit mẫu nghiên cứu KP11 MN93 Sau đọc trình tự, tiến hành phân tích trình tự nucleotit mẫu nghiên cứu KP11 MN93 Kết cho thấy trình tự nucleotit đoạn gien PLC3 (dài 4215 nucleotit) mẫu nghiên cứu có độ tơng đồng cao 99,8% (sai khác nucleotit) Đó vị trí: vị trí 22 nucleotit T KP11 đợc thay C MN93, vị trÝ 414 A (KP11) thay b»ng G (MN93), vÞ trÝ 479 T (KP11) thay b»ng C (MN93), vÞ trÝ 297 C (KP11) thay b»ng T (MN93), vÞ trÝ 1964 T (KP11) thay b»ng G (MN93), vÞ trÝ 2979 C (KP11) thay b»ng T (MN93), vÞ trÝ 3388 T (KP11) thay b»ng C (MN93), vÞ trÝ 4194 A (KP11) thay b»ng G I1 E1 I2 E2 I3 E3 I4 E4 I5 E5 (MN93) Điểm khác biệt trình tự nucleotit gien mẫu nghiên cứu với trình tự nucleotit gien đăng ký Ngân hàng gien quốc tế cã m· sè AY39407 [8] lµ: kÝch th−íc gien cđa mẫu nghiên cứu (KP11 MN93) dài 4215 nucleotit mẫu có mã số AY394078 (tại Ngân hàng gien quốc tế) 5213 nucleotit Sự khác biệt chiều dài không ảnh hởng đến đoạn mã hóa trình tự axit amin đoạn thiếu hụt nằm vùng intron Vì chiều dài gien PLC3 dài (4215 nucleotit) nên không đa vào báo mà đa đoạn mã hóa axit amin gien dới Sơ đồ cÊu tróc cđa gien PLC3 cđa mÉu ®Ëu xanh cã mã số AY394078 Ngân hàng gien quốc tế: I6 E6 I7 E7 I8 E8 I9 E9 I10 77 S¬ ®å trªn cho thÊy gien PLC3 cđa mÉu cã m· sè AY394078 còng cã exon gièng mÉu nghiªn cứu KP11 MN93 nhng có thêm đoạn không mã hóa I1 gắn vào phía trớc đoạn E1 I10 gắn vào phía sau đoạn E9 I1 thực chất intron mà 5'UTR, I10 lµ 3'UTR Vïng m· hãa axit amin cđa gien PLC3 gåm cã exon nèi l¹i víi theo thø tù tõ exon ®Õn exon AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 78 So s¸nh c¸c vïng exon m· hãa axit amin (cã kÝch th−íc 1776 nucleotit) cđa gien PLC3 ë giống đậu xanh KP11 MN93 với giống đậu xanh Ngân hàng gien quốc tế có mã số AY394078, kết cho thấy trình tự nucleotit có độ tơng đồng cao, có vị trí sai khác lµ 22, 34, 142, 235, 297, 489, 627, 1287, 1755 (hình 4) Các vị trí sai khác tơng ứng với vị trí 22, 34, 142, 235, 297, 1065, 1552, 3525, 4194 ë gien ch−a lo¹i intron | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 ATGTCCAAGC AGACTTACAG CTTTTGCTTC TGCTTCCGCC GCCGCTTCAG ATGTCCAAGC AGACTTACAG CTTTTGCTTC TGCCTCCGCC GCCGCTTCAG ATGTCCAAGC AGACTTACAG CCTTTGCTTC TGCCTCCGCC GCCGCTTCAG | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 TCTCCCCGTG TCGGAGGCCC CTCCGGAGAT AAGGACCCTT TTCGACCGTT TCTCCCCGTG TCGGAGGCCC CTCCGGAGAT AAGGACCCTT TTCGACCGTT TCTCCCCGTG TCGGAGGCCC CTCCGGAGAT AAGGACCCTT TTCGACCGTT | | | | | | | | | | 110 120 130 140 150 ATTCCGATGA GAATGGAATC ATGACAGCCT CTCACGTCCG CAGTTTCCTG ATTCCGATGA GAATGGAATC ATGACAGCCT CTCACGTCCG CGGTTTCCTG ATTCCGATGA GAATGGAATC ATGACAGCCT CTCACGTCCG CGGTTTCCTG | | | | | | | | | | 160 170 180 190 200 GTTGAGGTGC AGAAGGAGGA GAGTGTCACT GAGGAGGAAG CACAGGCCAT GTTGAGGTGC AGAAGGAGGA GAGTGTCACT GAGGAGGAAG CACAGGCCAT GTTGAGGTGC AGAAGGAGGA GAGTGTCACT GAGGAGGAAG CACAGGCCAT | | | | | | | | | | 210 220 230 240 250 CATCGATGGC CACAAGCATC TCAGCATCTT TCACAGGAGG GGTCTCAATC CATCGATGGC CACAAGCATC TCAGCATCTT TCACCGGAGG GGTCTCAATC CATCGATGGC CACAAGCATC TCAGCATCTT TCACCGGAGG GGTCTCAATC | | | | | | | | | | 260 270 280 290 300 TTGAGAGTTT CTTCAACTAC CTCTTCAGTA GCAATAATAA TCCACCTCTC TTGAGAGTTT CTTCAACTAC CTCTTCAGTA GCAATAATAA TCCACCCCTC TTGAGAGTTT CTTCAACTAC CTCTTCAGTA GCAATAATAA TCCACCTCTC | | | | | | | | | | 310 320 330 340 350 TCGCCTTCTC TCGGGGTGCA CCAAGATATG TCTTCACCGT TGTCTCATTA TCGCCTTCTC TCGGGGTGCA CCAAGATATG TCTTCACCGT TGTCTCATTA TCGCCTTCTC TCGGGGTGCA CCAAGATATG TCTTCACCGT TGTCTCATTA | | | | | | | | | | 360 370 380 390 400 CTTCATTTAT ACTGGTCATA ATTCCTATCT AACTGGGAAC CAACTAAGCA CTTCATTTAT ACTGGTCATA ATTCCTATCT AACTGGGAAC CAACTAAGCA CTTCATTTAT ACTGGTCATA ATTCCTATCT AACTGGGAAC CAACTAAGCA | | | | | | | | | | 410 420 430 440 450 GTGACTGCAG TGACGTCCCC ATCATCAAGG CACTGCAGAA GGGTGTAAGG GTGACTGCAG TGACGTCCCC ATCATCAAGG CACTGCAGAA GGGTGTAAGG GTGACTGCAG TGACGTCCCC ATCATCAAGG CACTGCAGAA GGGTGTAAGG | | | | | | | | | | 460 470 480 490 500 GTGATTGAAT TAGATATATG GCCTAATGAA TCAAAGGAGG ATGTGGATGT GTGATTGAAT TAGATATATG GCCTAATGAA TCAAAGGATG ATGTGGATGT GTGATTGAAT TAGATATATG GCCTAATGAA TCAAAGGATG ATGTGGATGT | | | | | | | | | | 510 520 530 540 550 TCTTCATGGA AGGACATTGA CATCTCCTGT GGCCCTCATC AAATGTTTGA TCTTCATGGA AGGACATTGA CATCTCCTGT GGCCCTCATC AAATGTTTGA TCTTCATGGA AGGACATTGA CATCTCCTGT GGCCCTCATC AAATGTTTGA AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 | | | | | | | | | | 560 570 580 590 600 GGTCTATTAA GCAGTATGCT TTTGTTGCCT CAGAATATCC AGTTGTAATA GGTCTATTAA GCAGTATGCT TTTGTTGCCT CAGAATATCC AGTTGTAATA GGTCTATTAA GCAGTATGCT TTTGTTGCCT CAGAATATCC AGTTGTAATA | | | | | | | | | | 610 620 630 640 650 ACCTTAGAAG ACCACCTTAC TCCCGATCTT CAGGCCAAAG TGGCTGAGAT ACCTTAGAAG ACCACCTTAC TCCCGACCTT CAGGCCAAAG TGGCTGAGAT ACCTTAGAAG ACCACCTTAC TCCCGACCTT CAGGCCAAAG TGGCTGAGAT | | | | | | | | | | 660 670 680 690 700 GATTACTCAA ACATTTGGAG ACATACTATT TTCTCCTGGC TCTGAAAGCT GATTACTCAA ACATTTGGAG ACATACTATT TTCTCCTGGC TCTGAAAGCT GATTACTCAA ACATTTGGAG ACATACTATT TTCTCCTGGC TCTGAAAGCT | | | | | | | | | | 710 720 730 740 750 TGAAGGAATT TCCTTCTCCT AAATCGCTTA AAAGGAGGAT TATCATATCA TGAAGGAATT TCCTTCTCCT AAATCGCTTA AAAGGAGGAT TATCATATCA TGAAGGAATT TCCTTCTCCT AAATCGCTTA AAAGGAGGAT TATCATATCA | | | | | | | | | | 760 770 780 790 800 ACCAAACCAC CTAAGGAGTA CATTGAGGCA AAAGAAGTTC AGGAAAAGGG ACCAAACCAC CTAAGGAGTA CATTGAGGCA AAAGAAGTTC AGGAAAAGGG ACCAAACCAC CTAAGGAGTA CATTGAGGCA AAAGAAGTTC AGGAAAAGGG | | | | | | | | | | 810 820 830 840 850 GGAGGGATCA CAAAAGGAAA AGCCTGTAGA TGATGAAGAA GCATGGGGGA GGAGGGATCA CAAAAGGAAA AGCCTGTAGA TGATGAAGAA GCATGGGGGA GGAGGGATCA CAAAAGGAAA AGCCTGTAGA TGATGAAGAA GCATGGGGGA | | | | | | | | | | 860 870 880 890 900 AAGAAGTTCC TAGTTTGAGA GGTGGCACTA TTTCTGATCA CAAGAACATC AAGAAGTTCC TAGTTTGAGA GGTGGCACTA TTTCTGATCA CAAGAACATC AAGAAGTTCC TAGTTTGAGA GGTGGCACTA TTTCTGATCA CAAGAACATC | | | | | | | | | | 910 920 930 940 950 GAGGATGAGG ATGATCTTGA CAATGAAGAT GATACTGATG AAGCAGAATA GAGGATGAGG ATGATCTTGA CAATGAAGAT GATACTGATG AAGCAGAATA GAGGATGAGG ATGATCTTGA CAATGAAGAT GATACTGATG AAGCAGAATA | | | | | | | | | | 960 970 980 990 1000 TTCACGTCAA AATGCATCAG ACGAATACAG ACGTTTAATT GCCATTCATG TTCACGTCAA AATGCATCAG ACGAATACAG ACGTTTAATT GCCATTCATG TTCACGTCAA AATGCATCAG ACGAATACAG ACGTTTAATT GCCATTCATG | | | | | | | | | | 1010 1020 1030 1040 1050 CTGGGAAGCC TAAAGGTGGA TTAACAGAAT GCCTCAAAGT GGATCCCGAT CTGGGAAGCC TAAAGGTGGA TTAACAGAAT GCCTCAAAGT GGATCCCGAT CTGGGAAGCC TAAAGGTGGA TTAACAGAAT GCCTCAAAGT GGATCCCGAT | | | | | | | | | | 1060 1070 1080 1090 1100 ACAGTGAAAC GTCTAAGTTT AAGTGAGCTA CAACTTGAAA AGGCTGCTGA ACAGTGAAAC GTCTAAGTTT AAGTGAGCTA CAACTTGAAA AGGCTGCTGA ACAGTGAAAC GTCTAAGTTT AAGTGAGCTA CAACTTGAAA AGGCTGCTGA | | | | | | | | | | 1110 1120 1130 1140 1150 AACTCATGGC AAAGAAATCA TAAGGTTTAC TCAGCGGAAT ATACTGAGAG AACTCATGGC AAAGAAATCA TAAGGTTTAC TCAGCGGAAT ATACTGAGAG AACTCATGGC AAAGAAATCA TAAGGTTTAC TCAGCGGAAT ATACTGAGAG | | | | | | | | | | 1160 1170 1180 1190 1200 TGTATCCAAA AGGCACTCGT ATTGCCTCAA CAAATTATAA TCCATTGATC TGTATCCAAA AGGCACTCGT ATTGCCTCAA CAAATTATAA TCCATTGATC TGTATCCAAA AGGCACTCGT ATTGCCTCAA CAAATTATAA TCCATTGATC | | | | | | | | | | 1210 1220 1230 1240 1250 GGGTGGATGC ATGGAGCCCA GATGGTTGCA TTCAACATGC AGGGATACGG GGGTGGATGC ATGGAGCCCA GATGGTTGCA TTCAACATGC AGGGATACGG 79 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 GGGTGGATGC ATGGAGCCCA GATGGTTGCA TTCAACATGC AGGGATACGG | | | | | | | | | | 1260 1270 1280 1290 1300 TAGGTCTCTC TGGTTGATGC AGGGAATGTT CAAAGCGAAT GGGGGATGTG TAGGTCTCTC TGGTTGATGC AGGGAATGTT CAAAGCCAAT GGGGGATGTG TAGGTCTCTC TGGTTGATGC AGGGAATGTT CAAAGCCAAT GGGGGATGTG | | | | | | | | | | 1310 1320 1330 1340 1350 GTTATGTTAA GAAACCAGAT TTTCTGTTAA AGACTGGTCT TAATAATGAG GTTATGTTAA GAAACCAGAT TTTCTGTTAA AGACTGGTCT TAATAATGAG GTTATGTTAA GAAACCAGAT TTTCTGTTAA AGACTGGTCT TAATAATGAG | | | | | | | | | | 1360 1370 1380 1390 1400 GTCTTTGATC CTAAAGCTCG TTTGCCGGTG AAGAAAACTT TGAAAGTGAC GTCTTTGATC CTAAAGCTCG TTTGCCGGTG AAGAAAACTT TGAAAGTGAC GTCTTTGATC CTAAAGCTCG TTTGCCGGTG AAGAAAACTT TGAAAGTGAC | | | | | | | | | | 1410 1420 1430 1440 1450 TATATATATG GGGGAAGGAT GGTTTCATGA TTTCAAGCAC ACGCACTTTG TATATATATG GGGGAAGGAT GGTTTCATGA TTTCAAGCAC ACGCACTTTG TATATATATG GGGGAAGGAT GGTTTCATGA TTTCAAGCAC ACGCACTTTG | | | | | | | | | | 1460 1470 1480 1490 1500 ATCAATACTC ACCCCCTGAC TTCTATGCAA GAGTGGGGAT TGCTGGAGTC ATCAATACTC ACCCCCTGAC TTCTATGCAA GAGTGGGGAT TGCTGGAGTC ATCAATACTC ACCCCCTGAC TTCTATGCAA GAGTGGGGAT TGCTGGAGTC | | | | | | | | | | 1510 1520 1530 1540 1550 CCTTATGATA CTGTTATGAA AAAAACAAAG AGCGTGGAGG ATAATTGGTC CCTTATGATA CTGTTATGAA AAAAACAAAG AGCGTGGAGG ATAATTGGTC CCTTATGATA CTGTTATGAA AAAAACAAAG AGCGTGGAGG ATAATTGGTC | | | | | | | | | | 1560 1570 1580 1590 1600 TCCATCATGG AATGAGGAAT TTAAGTTTCC ACTTTCTGTT CCAGAACTGG TCCATCATGG AATGAGGAAT TTAAGTTTCC ACTTTCTGTT CCAGAACTGG TCCATCATGG AATGAGGAAT TTAAGTTTCC ACTTTCTGTT CCAGAACTGG | | | | | | | | | | 1610 1620 1630 1640 1650 CTCTGCTTCG TGTAGAAGTT CATGAATATG ACATGTCTGA GAAAGATGAC CTCTGCTTCG TGTAGAAGTT CATGAATATG ACATGTCTGA GAAAGATGAC CTCTGCTTCG TGTAGAAGTT CATGAATATG ACATGTCTGA GAAAGATGAC | | | | | | | | | | 1660 1670 1680 1690 1700 TTTGGTGGCC AAACTTGCTT ACCTGTGTGG GAACTGAGAA GTGGAATTCG TTTGGTGGCC AAACTTGCTT ACCTGTGTGG GAACTGAGAA GTGGAATTCG TTTGGTGGCC AAACTTGCTT ACCTGTGTGG GAACTGAGAA GTGGAATTCG | | | | | | | | | | 1710 1720 1730 1740 1750 TGCAGTTCCA TTATATTCCC GCAAAGGAGA AAAGTACCAC AATGTGAAGC TGCAGTTCCA TTATATTCCC GCAAAGGAGA AAAGTACCAC AATGTGAAGC TGCAGTTCCA TTATATTCCC GCAAAGGAGA AAAGTACCAC AATGTGAAGC | | | | | 1760 1770 TTCTAATGCG CTTTGAATTC ATTTGA TTCTAATGCG CTTTGAATTC ATTTGA TTCTGATGCG CTTTGAATTC ATTTGA Hình So sánh trình tự vùng exon giống đậu xanh KP11, MN93 AY394078 So sánh trình tự nucleotit gien PLC3 nghiªn cøu (vïng m· hãa axit amin) víi trình tự gien PLC3 số trồng khác Chúng tiến hành so sánh trình tự nucleotit gien PLC3 nghiên cứu với trình tù nucleotit cđa gien PLC3 ë mét sè c©y trång khác 80 có tên mã số đăng ký Ngân hàng gien quốc tế: đậu xanh Vigna radiata (L) Wilczek (AY394078) [7], khoai t©y Solanum tuberosum L (X94289) [8], đậu tơng Glycine max (L.) Merr (U25027) [13], ngô Zea mays L (AY536525) [9], đậu hà lan Pisum sativum L (Y15253) [10], thuốc Nicotiana tabacum L (X95877) [11], đậu d¶i Vigna unguiculata (L.) Walp (U85250) [12] KÕt qu¶ cho thấy mẫu nghiên cứu có độ tơng đồng cao nhÊt so víi mÉu AY394078 (®Ëu xanh); gièng KP11 cã độ tơng đồng 99,6% giống MN93 có độ tơng đồng 99,5% Tiếp đến Pisum sativum L (80,6%) vµ thÊp nhÊt lµ Zea mays L (54,7%) KÕt so sánh thể bảng Bảng So sánh trình tự nucleotit gien PLC3 loại trồng khác 100 99,8 99,6 65,7 76,4 54,8 80,6 58,2 100 99,5 65,8 76,4 54,7 80,6 57,4 100 65,7 76,5 57,4 80,5 57,6 100 64,2 52,9 64,1 58,4 100 52,8 76,0 59,7 100 52,9 54,1 100 58,9 100 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 55,5 55,3 55,5 53,0 58,1 53,5 57,5 58,9 100 Ghi chó: KP11; MN93; Vigna radiata (L.) Wilczek (AY394078); Solanum tuberosum L (X94289); Glycine max (L.) Merr (U25027); Zea mays L (AY536525); Pisum sativum L (Y15253); Nicotiana tabacum L (X95877); Vigna unguiculata (L.) Walp (U85250) So sánh trình tự axit amin hai giống đậu xanh KP11 MN93 với giống đậu xanh Ngân hàng gien quốc tế có mã số AY394078 Kết so sánh trình tự axit amin giống đậu xanh nghiên cứu có độ tơng đồng cao 99,8%, sai khác axit amin ë vÞ trÝ sè ë vÞ trÝ số 8, axit amin L KP11 đợc thay axit amin F MN93 So sánh trình tự axit amin giống đậu xanh có mã số AY394078 Ngân hàng gien quốc tế với giống đậu xanh nghiên cứu cho thấy giống có độ tơng đồng cao, sai khác trình tự axit amin vị trí 8, 12, 48 163 Kết thể hình | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 MSKQTYSFCF CFRRRFSLPV SEAPPEIRTL FDRYSDENGI MTASHVRSFL MSKQTYSLCF CLRRRFSLPV SEAPPEIRTL FDRYSDENGI MTASHVRGFL MSKQTYSFCF CLRRRFSLPV SEAPPEIRTL FDRYSDENGI MTASHVRGFL | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 VEVQKEESVT EEEAQAIIDG HKHLSIFHRR GLNLESFFNY LFSSNNNPPL VEVQKEESVT EEEAQAIIDG HKHLSIFHRR GLNLESFFNY LFSSNNNPPL VEVQKEESVT EEEAQAIIDG HKHLSIFHRR GLNLESFFNY LFSSNNNPPL | | | | | | | | | | 110 120 130 140 150 SPSLGVHQDM SSPLSHYFIY TGHNSYLTGN QLSSDCSDVP IIKALQKGVR SPSLGVHQDM SSPLSHYFIY TGHNSYLTGN QLSSDCSDVP IIKALQKGVR SPSLGVHQDM SSPLSHYFIY TGHNSYLTGN QLSSDCSDVP IIKALQKGVR | | | | | | | | | | 160 170 180 190 200 VIELDIWPNE SKEDVDVLHG RTLTSPVALI KCLRSIKQYA FVASEYPVVI VIELDIWPNE SKDDVDVLHG RTLTSPVALI KCLRSIKQYA FVASEYPVVI VIELDIWPNE SKDDVDVLHG RTLTSPVALI KCLRSIKQYA FVASEYPVVI | | | | | | | | | | 210 220 230 240 250 TLEDHLTPDL QAKVAEMITQ TFGDILFSPG SESLKEFPSP KSLKRRIIIS TLEDHLTPDL QAKVAEMITQ TFGDILFSPG SESLKEFPSP KSLKRRIIIS TLEDHLTPDL QAKVAEMITQ TFGDILFSPG SESLKEFPSP KSLKRRIIIS | | | | | | | | | | 260 270 280 290 300 TKPPKEYIEA KEVQEKGEGS QKEKPVDDEE AWGKEVPSLR GGTISDHKNI TKPPKEYIEA KEVQEKGEGS QKEKPVDDEE AWGKEVPSLR GGTISDHKNI TKPPKEYIEA KEVQEKGEGS QKEKPVDDEE AWGKEVPSLR GGTISDHKNI | | | | | | | | | | 310 320 330 340 350 EDEDDLDNED DTDEAEYSRQ NASDEYRRLI AIHAGKPKGG LTECLKVDPD EDEDDLDNED DTDEAEYSRQ NASDEYRRLI AIHAGKPKGG LTECLKVDPD EDEDDLDNED DTDEAEYSRQ NASDEYRRLI AIHAGKPKGG LTECLKVDPD | | | | | | | | | | 360 370 380 390 400 TVKRLSLSEL QLEKAAETHG KEIIRFTQRN ILRVYPKGTR IASTNYNPLI 81 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY294078 KP11 MN93 TVKRLSLSEL QLEKAAETHG KEIIRFTQRN ILRVYPKGTR IASTNYNPLI TVKRLSLSEL QLEKAAETHG KEIIRFTQRN ILRVYPKGTR IASTNYNPLI | | | | | | | | | | 410 420 430 440 450 GWMHGAQMVA FNMQGYGRSL WLMQGMFKAN GGCGYVKKPD FLLKTGLNNE GWMHGAQMVA FNMQGYGRSL WLMQGMFKAN GGCGYVKKPD FLLKTGLNNE GWMHGAQMVA FNMQGYGRSL WLMQGMFKAN GGCGYVKKPD FLLKTGLNNE | | | | | | | | | | 460 470 480 490 500 VFDPKARLPV KKTLKVTIYM GEGWFHDFKH THFDQYSPPD FYARVGIAGV VFDPKARLPV KKTLKVTIYM GEGWFHDFKH THFDQYSPPD FYARVGIAGV VFDPKARLPV KKTLKVTIYM GEGWFHDFKH THFDQYSPPD FYARVGIAGV | | | | | | | | | | 510 520 530 540 550 PYDTVMKKTK SVEDNWSPSW NEEFKFPLSV PELALLRVEV HEYDMSEKDD PYDTVMKKTK SVEDNWSPSW NEEFKFPLSV PELALLRVEV HEYDMSEKDD PYDTVMKKTK SVEDNWSPSW NEEFKFPLSV PELALLRVEV HEYDMSEKDD | | | | | | | | 560 570 580 590 FGGQTCLPVW ELRSGIRAVP LYSRKGEKYH NVKLLMRFEF I FGGQTCLPVW ELRSGIRAVP LYSRKGEKYH NVKLLMRFEF I FGGQTCLPVW ELRSGIRAVP LYSRKGEKYH NVKLLMRFEF I Hình So sánh trình tự axit amin hai giống đậu xanh KP11 MN93 với giống đậu xanh có mã số AY394078 Chúng tiến hành so sánh trình tự axit Toàn trình tự nucleotit dòng sản amin gien PLC3 giống đậu xanh KP11 phẩm PCR đợc xác định xử lý cho kết MN93 với trình tự axit amin cđa gien gien PLC3 cđa gièng ®Ëu xanh nghiên cứu dài PLC3 số trồng khác Kết cho 4215 nucleotit, có exon intron thấy, mẫu nghiên cứu có độ tơng đồng cao Đoạn gien mã hóa dài 1776 nucleotit mã hóa với AY394078 (99,5%), tiếp đến Pisum sản phẩm protein dài 591 axit amin (trừ axit sativum L (81,4%) vµ thÊp nhÊt lµ Zea mays L amin mở đầu) So sánh trình tự nucleotit trình tù axit amin cđa gien PLC3 cđa gièng ®Ëu (57,2%) KÕt qu¶ thĨ hiƯn ë b¶ng B¶ng xanh nghiên cứu với trình tự tơng tự gien PLC3 cđa gièng ®Ëu xanh cã m· sè So sánh trình tự axit amin loại AY394078 Ngân hàng gien quốc tế cho thấy trồng khác gien PLC3 thu đợc có độ tơng đồng cao 100 99,8 99,5 68,4 74,3 57,2 81,4 61,7 57,6 100 99,3 68,4 74,3 57,2 81,4 61,7 57,6 100 68,4 74,1 57,2 81,2 61,7 57,6 100 64,4 56,6 68,2 62,4 55,4 100 55,6 75,1 63,4 58,5 100 56,3 59,4 57,5 100 62,6 57,7 100 62,8 100 Ghi chó: nh− b¶ng III Kết luận Chúng tách chiết tinh ADN tỉng sè cđa gièng ®Ëu xanh Vigna radiata (L.) Wilczek KP11 MN93 Gien phốtpho-lipaza C3 đợc nhân lên phản ứng PCR với cặp mồi F1, F2, F3 đợc thiết kế dựa sở liệu khai thác Ngân hàng gien quốc tế Sản phẩm PCR đợc dòng hóa nhờ véctơ pTZ57R/T 82 TàI liệu tham khảo Trần Đình Long, Lê Khả Tờng, 1998: Cây đậu xanh Nxb Nông nghiệp Knight H., 2000: Int Rev Cyto., 195: 269325 Sanders D., Brownlee C and Harper J F., 1999: Plant cell, 11: 691-706 Trewavas A J and Gilroy S., 1991: Trends Gene, 7: 356-361 Yun Ju Kim et al., 2003: FEBS Letters (2004), 556: 127-136 Zhu J K., 2002: Ann Rev Plant Biol., 53: 247-273 Gawel N J., Jarret R H., 1991: Genomic DNA isolation http://www.weihenstephan de/pbpz/bambra/html/dna.html http://www.ncbi.nlm.nih.gov Cloning of the encoding phospholipase C3 gene from two mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek) cultivars kp11 and Mn93 Nguyen Vu Thanh Thanh, Chu Hoang Mau, Pham thi van, Le tran binh summary Mungbean Vigna radiata (L.) Wilczek is a grain legume widely grown in the tropics and subtropics and is an excellent source of dietary protein Many biotic and abiotic stresses such as disease and drought limit the mungbean yield In this study, mungbean cultivars KP11 and MN93 were subjected to PCR analysis using primer pairs (F1, F2, F3) A 4.2 k b phospholipase C3 (PLC3) gene fragment from the mungbean genome was successfully amplified by PCR The PCR products containing the PLC3 fragments were cloned in pTZ57R/T and sequenced with three primer pairs (3 forward and reverse primer) The cloned PLC3 gene had 4215 nucleotides in length, including start codon and stop codons, intron and exon The coding region of PLC3 comprised 1776 nucleotides, encoding a polypeptide of 591 amino acids Ngµy nhËn bµi: 20-3-2006 83 ... KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11. .. KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11. .. MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93 AY394078 KP11 MN93