Nghiên cứu một số đặc tính hóa sinh dược của dịch chiết từ hạt loài đậu xanh (vigna radiata (l ) wilczek)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ====== NGUYỄN THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA SINH DƢỢC CỦA DỊCH CHIẾT TỪ HẠT LOÀI ĐẬU XANH ( Vigna radiata (L.) Wilczek) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa sinh học HÀ NỘI, 2015 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn TS Trần Thị Phƣơng Liên trực tiếp hƣớng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện để hoàn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN tạo điều kiện cho học tập hoàn thành đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Chuyển giao Công nghệ - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng, anh chị cao học tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian học tập nghiên cứu Cuối xin chân thành cảm ơn ngƣời thân bạn bè động viên, tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian học tập nhƣ hoàn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2015 Sinh viên thực Nguyễn Thị Thu Hà LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu đƣợc trình bày khóa luận thực không trùng lặp với tác giả khác Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với nội dung đƣợc đề cập khóa luận Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2015 Sinh viên thực Nguyễn Thị Thu Hà MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Ý nghĩa khoa học Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 5.1 Mẫu thực vật 5.2 Phạm vi nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu Những đóng góp đề tài NỘI DUNG CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây đậu xanh 1.1.1 Thực vật học 1.1.2 Đặc điểm nông sinh học đậu xanh 1.1.3 Phân bố, sinh thái 1.1.4 Thành phần hóa học hạt loài đậu xanh 1.1.5 Một số tác dụng Sinh - dƣợc công dụng hạt loài đậu xanh 10 1.2 Giới thiệu số hợp chất tự nhiên thực vật 11 1.2.1 Một số khái niệm hợp chất thực vật thứ sinh 11 1.2.2 Vai trò hợp chất thực vật thứ sinh 17 1.2.3 Ứng dụng hợp chất thực vật thứ sinh 17 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 18 2.1.1 Mẫu thực vật 18 2.1.2 Dụng cụ hóa chất thí nghiệm 18 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phƣơng pháp chiết cao tổng số phân đoạn dịch chiết 19 2.2.2 Khảo sát sơ thành phần hạt loài đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) 19 2.2.3 Định lƣợng polyphenol tổng số theo phƣơng pháp Folin - Ciocalteau 22 2.2.4 Phân tích thành phần hợp chất tự nhiên phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) 23 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Quy trình tách chiết phân đoạn từ hạt loài đậu xanh 24 3.2 Định tính số hợp chất tự nhiên phân đoạn dịch chiết từ hạt loài đậu xanh 26 3.3 Định lƣợng polyphenol tổng số phân đoạn dịch chiết 27 3.3.1 Kết xây dựng đƣờng chuẩn acid gallic 27 3.3.2 Kết xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số 29 3.4 Phân tích thành phần chất tự nhiên phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh sắc ký lớp mỏng 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Hiệu suất chiết rút phân đoạn từ hạt đậu xanh 25 Bảng 3.2 Kết định tính phân đoạn dịch chiết hạt đậu xanh 26 Bảng 3.3 Kết xây dựng đƣờng chuẩn acid gallic 28 Bảng 3.4 Định lƣợng polyphenol tổng số phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh 29 Bảng 3.5 Đặc điểm băng vạch phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh 31 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) Hình 1.2 Quả loài đậu xanh ( Vigna radiata (L.) Wilczek) Hình 2.1 Hạt loài đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) 18 Hình 3.1 Sơ đồ quy trình tách chiết hợp chất tự nhiên từ hạt đậu xanh 24 Hình 3.2 Đồ thị đƣờng chuẩn acid gallic 28 Hình 3.3 Ảnh chạy sắc ký đồ dịch chiết hạt đậu xanh 30 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CHCl3: Choloroform EtOAc: Ethylacetate EtOH: Ethanol PĐ: Phân đoạn MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) ba đậu đỗ nhóm đậu ăn hạt, đứng sau đậu tƣơng lạc Đậu xanh trồng có vị trí quan trọng nông nghiệp nhiều nƣớc, có Việt Nam Y học cổ truyền cho đậu xanh có vị ngọt, tính hàn, có công dụng nhiệt, mát gan, điều hòa ngũ tạng, bổ nguyên khí, giải đƣợc nhiều thứ độc Từ cổ xƣa đến đậu xanh đƣợc đại danh y danh y coi trọng sử dụng làm vị thuốc quý [6] Ngƣời thƣờng xuyên ăn đậu xanh chế phẩm đậu xanh huyết áp giảm Trong đậu xanh có thành phần làm hạ mỡ máu hữu hiệu, giúp cho thể phòng chống chứng xơ cứng động mạch bệnh cao huyết áp, đồng thời có công hiệu bảo vệ gan giải độc Thực vật nguồn cung cấp hợp chất dùng làm dƣợc liệu phụ gia thực phẩm có giá trị Những sản phẩm đƣợc biết nhƣ chất trao đổi thứ cấp, thƣờng đƣợc hình thành với lƣợng nhỏ chức trao đổi chất chƣa đƣợc biết đầy đủ Chúng dƣờng nhƣ sản phẩm phản ứng hóa học thực vật với môi trƣờng bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật động vật Những nghiên cứu hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật phát triển từ cuối năm 50 kỉ XX (Rao cs 2002) [15] Ngày nay, hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học đƣợc phân lập từ cỏ đƣợc sử dụng rộng rãi đời sống Những hợp chất tiếp tục đƣợc dùng nhƣ nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp cung cấp chất đầu cho công nghiệp bán tổng hợp nhằm tìm kiếm dƣợc phẩm cho việc điều trị bệnh thông thƣờng nhƣ bệnh nan y Tuy nhiên, việc sử dụng đậu xanh, loài có nguồn gốc dân gian cộng đồng mang tính chất tự phát, chƣa có sở khoa học Từ thực tế trên, định chọn nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu số đặc tính hóa sinh dƣợc dịch chiết từ hạt loài đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek)” Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu số đặc điểm sinh học dịch chiết từ hạt loài đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) để từ tạo sở cho nghiên cứu lĩnh vực sử dụng tìm kiếm thảo dƣợc sẵn có từ nguồn tài nguyên thiên nhiên Việt Nam Nhiệm vụ nghiên cứu + Tách chiết số phân đoạn chứa hoạt chất thiên nhiên từ hạt loài đậu xanh(Vigna radiata (L.) Wilczek) + Định tính, định lƣợng số hợp chất từ phân đoạn + Định lƣợng phƣơng pháp Folin - Ciocalteau, phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng Ý nghĩa khoa học Cung cấp số dẫn liệu khoa học thành phần hóa học, số chất hữu dịch chiết từ loài đậu xanh(Vigna radiata (L.) Wilczek) Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 5.1 Mẫu thực vật Hạt đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) đƣợc thu hái vào tháng năm 2013 huyện Trực Ninh - tỉnh Nam Định - Thuốc thử Mayer (hỗn hợp HgCl2 KI nƣớc): với hỗn hợp HgCl2 KI thuốc thử Mayer phản ứng với alkaloid nƣớc cho kết tủa màu trắng màu vàng nhạt - Thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI I2 dung dịch HCl): phản ứng cho kết tủa màu đỏ thẫm [1], [3], [12] 2.2.2.4 Thử định tính glycoside Phản ứng Keller - Killian: Dung dịch A: 50ml CH3COOH 10% + 0,5ml dung dịch FeCl3 5% Dung dịch B: 0,5ml H2SO4 10% + 0,5ml dung dịch FeCl3 5% Lấy 0,05g cao dịch chiết cho vào ống nghiệm Thêm 1ml dung dịch A hòa cho hết mẫu, nghiêng ống cho từ từ dung dịch B vào Phản ứng dƣơng tính xuất màu đỏ nâu hai lớp chất lỏng 2.2.2.5 Thử định tính Catechin - Phản ứng vanillin: lấy ống nghiệm, ống nghiệm cho 1ml dung dịch thử + Ống 1: dùng làm đối chứng + Ống 2: thêm vài giọt vanillin/HCl Phản ứng có màu đỏ son xuất chứng tỏ có mặt catechin 2.2.2.6 Thử định tính polyphenol khác - Phản ứng với dung dịch kiềm: lấy ống nghiệm, ống nghiệm cho 1ml dung dịch thử + Ống 1: dùng làm đối chứng + Ống 2: thêm vài giọt NaOH 10% Phản ứng cho kết dƣơng tính xuất màu vàng, vàng cam - Phản ứng với FeCl3 1% nƣớc: cho vài giọt thuốc thử pha loãng EtOH 98% vào dung dịch thử Phản ứng dƣơng tính ống nghiệm xuất màu lục, xanh, đen 21 2.2.3 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin Ciocalteau Nguyên tắc: Dựa phản ứng hợp chất pholyphenol (trong mẫu) với thuốc thử Folin - Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam So màu máy quang phổ UV VIS 1000 bƣớc sóng λ = 765nm, dùng acid gallic làm chất chuẩn để định lƣợng polyphenol tổng số Phƣơng pháp đƣợc tiến hành nhƣ sau: - Cân 10g loại: Cao phân đoạn EtOH, phân đoạn n - hexan, phân đoạn CHCl3, phân đoạn AtOAc hòa loãng EtOH 98% Sau đó, dung dịch đƣợc hòa loãng nồng độ thích hợp để làm phản ứng định lƣợng - Dung dịch acid gallic: 0,5g acid gallic + 10ml C2H5OH + 90ml H2O, bảo quản lạnh Thể tích tổng số dung dịch gốc 100ml (cồn 90%) Nhƣ vậy, 1ml dung dịch gốc acid gallic chứa 5mg (5mg acid gallic/ml) - Dung dịch Na2CO3: 200g Na2CO3 + 800ml H2O đun sôi, thêm vài tinh thể Na2CO3, sau 24 đem lọc dẫn nƣớc cất tới 1000ml Tiến hành xây dựng đƣờng đồ thị chuẩn với acid gallic nhƣ sau: - Chuẩn bị cốc định lƣợng theo tỉ lệ 0, 1, 2, 3, 10ml, sau dẫn nƣớc cất tới 100ml ta thu đƣợc nồng độ 0, 50, 100, 150, 250 500mg/ml acid gallic - Cho vào cốc định lƣợng 20μl mẫu thử + 1,58ml H2O + 100μl thuốc thử Folin - Ciocalteau, sau 30giây đến phút cho thêm 300μl Na2CO3 Để hỗn hợp dung dịch phản ứng 20ºC xác định bƣớc sóng 765nm Tiến hành định lƣợng acid gallic để định lƣợng đƣờng chuẩn Định lƣợng phenolic mẫu nghiên cứu cách lấy 20μl (0,02ml) để định lƣợng tƣơng tự nhƣ làm với mẫu chuẩn acid gallic 22 2.2.4 Phân tích thành phần hợp chất tự nhiên phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng phƣơng pháp hiệu để phân tách nhiều hợp chất hữu Hệ thống sắc ký có nguyên tắc chung hệ thống sắc ký phân tách chất dựa phân bố chúng hai pha pha động pha tĩnh Pha động chất lỏng chất khí, đẩy mẫu qua vùng chứa pha tĩnh chất rắn chất lỏng Mẫu phân tích chứa chất có lực khác pha động pha tĩnh Nếu chất có lực lớn với pha tĩnh di chuyển chậm pha tĩnh, ngƣợc lại chất có lực thấp pha tĩnh di chuyển nhanh pha tĩnh Khả hòa tan chất pha động lớn chất di chuyển nhanh chuyển động pha động Nhƣ vậy, chất khác đƣợc phân tích, tách rời chúng có lực khác với pha động pha tĩnh Phƣơng pháp: Các mẫu (đã pha dung môi thích hợp) đƣợc tiến hành chạy sắc ký mỏng tráng sẵn DC - Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715) kích thƣớc phù hợp hệ dung môi khác để lựa chọn hệ dung môi phù hợp Một số hệ dung môi đƣợc sử dụng: - TEAF: 5: 3: 1: (Toluen - ethylacetate - acetone - acid formic) - Ethylacetate: acid fomic: nƣớc = 8: 1: - n - hexan: acetone = 5: Hiện màu dung dịch H2SO4 10% đƣợc phun mỏng Xác định hệ số Rf theo công thức a/b, đó: a: khoảng di chuyển chất nghiên cứu b: khoảng di chuyển dung môi [12] 23 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Quy trình tách chiết phân đoạn từ hạt loài đậu xanh Để tìm hiểu thành phần hóa học hạt đậu xanh qua tham khảo tài liệu lựa chọn quy trình tách chiết đƣợc mô tả nhƣ sau: HẠT ĐẬU XANH (3000g) Ngâm kiệt lần với EtOH, lọc thu dịch chiết, cô loại dung môi Cao cồn tổng số (186.71g) Hòa tan nước, chiết phân đoạn lần với n - hexan (1: 1) Để lại 20% (37.34g) cao cồn tổng số Phân lớp nƣớc Phân lớp n - hexan Chiết phân đoạn lần với CHCl3 (1: 1) Loại dung môi Cao PĐ n - hexan (33.28g) Phân lớp CHCl3 Chiết phân đoạn lần với EtOAc (1: 1) Loại dung môi Cao PĐ CHCl3 (21.07g) Phân lớp nƣớc Phân lớp EtOAc Loại dung môi Phân lớp nƣớc Loại dung môi Cao PĐ EtOAc (15.26g) Cao PĐ nƣớc (64.19g) Hình 3.1 Sơ đồ quy trình tách chiết hợp chất tự nhiên từ hạt đậu xanh 24 Quy trình tách chiết phân đoạn hợp chất tự nhiên từ hạt đậu xanh đƣợc thực nhƣ sau: Ngâm 3000g bột mịn hạt đậu xanh 10 lít cồn 96% vòng tuần nhiệt độ phòng, sau cất lại dung môi Tiếp tục cho cồn vào cất lại lần nữa, cô loại dung môi thu đƣợc 186.71g cao cồn tổng số Chúng để lại 20% (37.34g) cao cồn để làm thí nghiệm Phần lại hoà tan vào nƣớc ấm, chiết lần qua dung môi n - hexan theo tỷ lệ 1:1 thể tích Lấy phân lớp n - hexan cô loại dung môi đƣợc 33.28g cao phân đoạn n - hexan Phân lớp nƣớc lại hoà tan với chloroform theo tỷ lệ 1:1 thể tích (lặp lại lần nữa), thu phân lớp chloroform cô loại dung môi đƣợc 21.07g cao phân đoạn chloroform Phân lớp nƣớc tiếp tục đem hoà tan với ethylacetate (lặp lại lần nữa), thu phân lớp ethylacetate cô loại dung môi đƣợc 15.26g cao phân đoạn ethylacetate Cuối cô cạn lớp nƣớc lại thu đƣợc 64.19g cao phân đoạn nƣớc Với quy trình chiết rút nhƣ trên, thu đƣợc hiệu suất chiết rút phân đoạn hợp chất tự nhiên từ hạt đậu xanh nhƣ bảng 3.1 Bảng 3.1 Hiệu suất chiết rút phân đoạn từ hạt đậu xanh Mẫu ban đầu Hiệu suất chiết rút (g) (%) Cao PĐ ethanol 186.71 6.22 Cao PĐ n - hexan 33.28 1.1 Cao PĐ chloroform 21.07 0.7 Cao PĐ ethylacetate 15.26 0.5 Cao PĐ nƣớc 64.19 2.14 Phân đoạn Căn vào kết thực nghiệm thu đƣợc, nhận thấy hiệu suất chiết rút cao phân đoạn ethanol (6.22%) so với khối lƣợng nguyên liệu khô ban đầu 3000g, tiếp đến cao phân đoạn nƣớc (2.14%), 25 cao phân đoạn n - hexan (1.1%), cao phân đoạn chloroform (0.7%) thấp cao phân đoạn ethylacetate (0.5%) Kết cho thấy hạt đậu xanh có chứa lƣợng lớn hợp chất tự nhiên Khối lƣợng cao phân đoạn thu đƣợc đủ để thực phản ứng định tính, định lƣợng 3.2 Định tính số hợp chất tự nhiên phân đoạn dịch chiết từ hạt loài đậu xanh Nhằm xác định hợp chất tự nhiên có dịch chiết phân đoạn EtOH, n - hexan, CHCl3, AtOAc, nƣớc từ hạt loài đậu xanh Chúng tiến hành thử định tính phản ứng hóa học đặc trƣng Kết định tính đƣợc trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết định tính phân đoạn dịch chiết hạt đậu xanh Mẫu Cao Cao PĐ Cao Cao Cao PĐ n- PĐ PĐ PĐ EtOH hexan Shinoda ++ + ++ ++ + Diazo ++ + + + - H2SO4 đặc +++ + ++ + - Vanilin/HCl(đ) ++ - + - - Vanilin + + + - + Gelatin/NaCl + + + + + Acetat chì + - - + - Polyphenol NaOH 10% ++ + + + + khác FeCl3 5% ++ + + - + Glycoside Keller-killian + + + + + Nhóm chất Flavonoid Catechin Tannin Thuốc thử 26 CHCl3 EtOAc Nƣớc Alkaloid Mayer + - - + - Dragendroff + + + - - Bouchardat + - ++ + - (Ghi chú: (+): Các mức phản ứng dương tính, (-): Phản ứng âm tính; Mức độ phản ứng thể số dấu cộng) Từ bảng 3.2 cho thấy thành phần hạt đậu xanh có chứa hợp chất tự nhiên khác nhƣ flavonoid, alkaloid, glycoside số polyphenol khác Flavonoid có phản ứng dƣơng tính tất phân đoạn, chứng tỏ hạt đậu xanh có chứa nhiều nhóm hợp chất Đặc biệt hai phân đoạn cao cồn cao chloroform có chứa tƣơng đối đầy đủ nhóm hợp chất có hàm lƣợng lớn so với phân đoạn khác cho phản ứng mạnh với thuốc thử Còn cao phân đoạn n - hexan, ethylacetate cao phân đoạn nƣớc cho thấy có mặt nhiều nhóm chất nhƣ flavonoid, catechin, tannin nhƣng với hàm lƣợng thấp nhiều phản ứng cho kết âm tính Nhƣ hai phân đoạn cao cồn tổng số phân đoạn chloroform chứa nhiều hợp chất polyphenol nhƣ flavonoid, tannin… chất có hoạt tính sinh học cao, có khả chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thƣ… 3.3 Định lƣợng polyphenol tổng số phân đoạn dịch chiết Chúng tiến hành xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số phân đoạn dịch chiết phƣơng pháp Folin - Ciocalteau 3.3.1 Kết xây dựng đường chuẩn acid gallic Đƣờng chuẩn acid gallic đƣợc xây dựng cách chuẩn bị dung dịch acid gallic nồng độ 50, 100, 150, 250, 500mg/l, tiến hành máy ERMA bƣớc sóng 765nm Kết đƣợc thể bảng 3.3 hình 3.2 27 Bảng 3.3 Kết xây dựng đƣờng chuẩn acid gallic Acid gallic OD (mg/l) (765nm) 0.009 50 0.062 100 0.119 150 0.168 250 0.265 500 0.519 TT y = 0.001x + 0.0128 R2 = 0.9997 0.6 OD 765nm 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 100 200 300 400 500 600 axit gallic (m g/L) Hình 3.2 Đồ thị đƣờng chuẩn acid gallic 28 3.3.2 Kết xác định hàm lượng polyphenol tổng số Bảng 3.4 Định lƣợng polyphenol tổng số phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh Hàm lƣợng Mẫu OD765nm Tỷ lệ polyphenol Polyphenol (mg/l) (%) Cao EtOH 0.437 424.2 4.242 Cao n - hexan 0.083 70.2 0.702 Cao CHCl3 0.261 248.2 2.482 Cao EtOAc 0.097 84.2 0.842 Cao nƣớc 0.034 21.2 0.212 Từ kết bảng định lƣợng 3.4 cho thấy rằng, hàm lƣợng polyphenol tổng số cao phân đoạn nƣớc thấp (0.212%) Ở phân đoạn cao cồn hàm lƣợng polyphenol tổng số chiếm tỉ lệ cao (4.242%) sau đến phân đoạn cao chloroform (2.482%) Trong phân đoạn n - hexan EtOAc có hàm lƣợng polyphenol gần tƣơng đƣơng (chiếm 0.702% 0.842% tƣơng ứng) Kết rằng, thành phần hóa học hạt đậu xanh có chứa nhiều hợp chất có khả tan tốt ethanol chloroform Hàm lƣợng polyphenol tổng số chiếm tỷ lệ nhiều cao phân đoạn ethanol Đồng thời kết định lƣợng hoàn toàn phù hợp với mức độ phản ứng định tính 3.4 Phân tích thành phần chất tự nhiên phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh sắc ký lớp mỏng Chúng tiến hành chạy sắc kí mỏng tráng sẵn silicagel Merck Alufolien 60 F254 với nhiều hệ dung môi khác Qua thăm dò cho thấy hệ 29 dung môi (n - hexan : Acetone) = : cho kết rõ nét đƣợc lựa chọn Kết thể ảnh sắc ký đồ hình 3.3 Ghi : Cao phân đoạn nƣớc Cao phân đoạn n-hexan Cao phân đoạn EtOAc Cao phân đoạn EtOH Cao phân đoạn CHCl3 Hình 3.3 Ảnh chạy sắc ký đồ dịch chiết hạt đậu xanh Nhìn ảnh sắc ký ta thấy xuất nhiều băng vạch khác màu sắc Rf Về mặt lý thuyết băng vạch tƣơng ứng với chất định, nhƣng thực tế có nhiều chất Rf, chí màu sắc nằm gối lên nên vạch đƣợc coi có chất Vạch đậm chất có nồng độ cao, vạch nhạt chất có nồng độ nhỏ 30 Bảng 3.5 Đặc điểm băng vạch phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh STT Cao EtOH Rf Màu Cao n hexan Rf Màu Xanh Cao CHCl3 Rf Rf Rf 0.31 Vàng 0.29 0.34 0.38 0.34 Nâu 0.59 Vàng 0.40 0.46 Vàng 0.49 Nâu 0.64 0.51 Nâu Xanh 0.58 0.61 Vàng 0.64 Xanh nhạt Nâu đậm Xanh đậm 0.30 0.51 Vàng nhạt đậm Nâu Cao nƣớc nhạt 0.26 Màu Cao EtOAc Màu 0.34 Vàng 0.29 0.34 Xanh 0.28 Nâu 0.39 Xanh nhạt 0.45 0.67 Vàng 0.49 0.69 0.71 Vàng nhạt Màu Xanh nhạt Vàng nhạt 0.46 Nâu Nâu Xanh đậm Xanh đậm Nâu Nâu Trên sắc kí đồ xuất nhiều băng vạch màu vàng (đặc trƣng flavonoid), màu nâu (đặc trƣng cho dầu béo), màu xanh chứng tỏ hạt đậu xanh chứa đầy đủ polyphenol Về mặt lý thuyết, băng vạch tƣơng ứng với chất định song thực tế có nhiều băng vạch gối lên Trên sắc ký đồ nhận thấy phân đoạn cao EtOH xuất nhiều băng vạch nhất, tiếp đến phân đoạn CHCl3 Số vạch hai phân đoạn dao 31 động từ - có nhiều băng trùng gối lên Phân đoạn n - hexan, phân đoạn EtOAc phân đoạn nƣớc có băng vạch, số lƣợng băng vạch đến Nhƣ vậy, phân đoạn cao cồn tổng số phân đoạn CHCl3 có chứa nhiều nhóm hợp chất flavonoid số polyphenol Kết phù hợp với mức độ phản ứng định tính trình bày bảng 3.2 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu thu đƣợc, đƣa kết luận nhƣ sau: Thành phần hợp chất thứ sinh hạt đậu xanh phong phú bao gồm: flavonoid, tannin, alkaloid, glycoside số polyphenol khác Hàm lƣợng polyphenol tổng số cao phân đoạn EtOH chloroform hạt đậu xanh chiếm tƣơng ứng 4.242% 2.782% cao so với cao phân đoạn lại Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu, tìm hiểu sâu thành phần, cấu tạo hóa học hợp chất tự nhiên có hạt đậu xanh tác dụng sinh học nhƣ ứng dụng y học hợp chất đó, nhằm tạo sở lĩnh vực sử dụng thảo dƣợc sẵn có từ nguồn tài nguyên thiên nhiên Việt Nam 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Nguyễn Thƣợng Dong, Bùi Thị Hằng, Nguyễn Kim Cẩn, Phạm Thanh Hằng, Nguyễn Bích Thu, Nguyễn Duy Thuần, Nguyễn Văn Thuận (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Bộ giáo dục đào tạo - Bộ y tế - Viện dược liệu, NXB khoa học kỹ thuật, tr 33, 305 - 311, 344 - 370 [2] Trần Tử Dƣơng (2002), Rối loạn lipit máu, giảng sau đại học - cục Quân Y, tr 117 - 132 [3] Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, NXB Hà Nội [4] Nguyễn Quốc Khang (2004 - 2006), Bài giảng chuyên đề cao học “các hợp chất thứ sinh”, tr - 2, 11 - 12 [5] Nguyễn Đăng Khôi (1997), “Các đậu ăn hạt Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, số 2, tr - [6] Trần Đình Long, Lê Khả Tƣờng (1998), “Cây đậu xanh” , NXB NN [7] Phạm Văn Thiều (1997), “Cây đậu xanh kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm”, NXB Nông Nghiệp [8] Nguyễn Văn Thu (2004), Bài giảng dược liệu tập 1, NXB Y học, tr 240, 335, 368 TIẾNG ANH [9] Anderson M (2006), “Flavonoids Chemistry, Biochemistry and applications”, CRC Press, Taylor & Francis Group [10] Canell R J P (1989), Natural Products isolation, Humana press, pp 354 [11] Donald R., Linden K.G (2003), Antioxidant activities of flavonoids, Oregon State University USA 34 [12] Do Ngoc Lien, Nguyen Thuy Quynh, Nguyen Hoang Quang (2009), Anti - obesity and body weight reducing effect of fortunella japonica fell extract fractions in experimentally obese mice, KKU Science Journal vol 37 (sub) 96 - 104 (Bankok) [13] Harbonne J B (1994), The flavonoids advance in research sine 1986, Chapman and Hall, pp - 676 [14] Payene R L., Bidner T D., Southern L L., and geaghan (2001), Effect of dietarysoy isoflavones on growth, carcass traits and meat quality in growing finishing figs, J Anim Sci 2001, 79, pp 1230 - 1239 [15] Ramachandra - Rao S, Ravishankar GA (2002), Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites Biotechnology Advances, pp 100 - 153 [16] Rajnikant, Dinesh and Kamni (2005), Weak C - H … hydrogen bonds in Alkanoids: An overview, Bull Master Sci 2001, 79, pp 1230 - 1239 [17] Rence J G., Tetsusok (2000), Plant - fungal interaction the search for phytoalexin and other antifungal compounds from higher plants, Phytochemistry, Vol 56, pp 253 - 263 [18] Rodney Croteau, Toni M Kuchan, Norman G Lewis (2002), Natural products (secondary metabolites), Chapter 24, pp 1250 - 1318 [19] Taiz, Lincoln and Eduardo Zeiger (1991), Surface protection and Secondary defense Compounds, Plant physiology, Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc, pp 320 - 345 35 New York [...]...5.2 Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của dịch chiết từ hạt loài đậu xanh (Vigna radiata (L. ) Wilczek) 6 Phƣơng pháp nghiên cứu 6.1 Sử dụng các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau để tách chiết các phân đoạn dịch chiết từ loài đậu xanh (Vigna radiata (L. ) Wilczek) 6.2 Sử dụng một số phƣơng pháp hóa sinh để định tính, định lƣợng một số nhóm hợp chất tự nhiên 6.3... PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1 Mẫu thực vật Hạt loài đậu xanh (Vigna radiata (L. ) Wilczek) Địa điểm thu mẫu: Trực Ninh - Nam Định Thời gian thu mẫu: Hạt đậu xanh đƣợc thu vào tháng 5/2013 Xử lí mẫu: Phơi khô sau đó nghiền thành bột mịn Hình 2.1 Hạt loài đậu xanh (Vigna radiata (L. ) Wilczek) 2.1.2 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 2.1.2.1 Hóa chất - Silicagel 60 (0,04 - 0,063 mm) Merck... pháp xử lí thống kê toán học 7 Những đóng góp mới của đề tài Tách chiết thành công phân đoạn các hợp chất tự nhiên từ hạt loài đậu xanh Đánh giá đƣợc thành phần các hợp chất tự nhiên có trong hạt loài đậu xanh (Vigna radiata (L. ) Wilczek) 3 NỘI DUNG CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây đậu xanh 1.1.1 Thực vật học Đậu xanh có tên khoa học Vigna radiata (L. ) Wilczek thuộc ngành Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida,... trình tách chiết các phân đoạn từ hạt loài đậu xanh Để tìm hiểu thành phần hóa học của hạt đậu xanh và qua tham khảo các tài liệu chúng tôi lựa chọn quy trình tách chiết đƣợc mô tả nhƣ sau: HẠT ĐẬU XANH (3000g) Ngâm kiệt 3 lần với EtOH, lọc thu dịch chiết, cô loại dung môi Cao cồn tổng số (186.71g) Hòa tan trong nước, chiết phân đoạn 3 lần với n - hexan (1: 1) Để lại 20% (37.34g) cao cồn tổng số Phân... ra lứa sau đó, nhƣng quả to và hạt mẩy hơn Các quả của những đợt hoa ra sau thƣờng ngắn, ít hạt, hạt không mẩy, màu hạt cũng nhạt và bé hơn Các quả sinh ra từ các chùm hoa trên thân nhiều quả và quả to, dài hơn quả của các chùm hoa ở cành Quả đậu xanh chín rải rác, có khi kéo dài đến 20 ngày Hình 1.2 Quả loài đậu xanh ( Vigna radiata (L. ) Wilczek) 7 * Đặc điểm của hạt Hạt không nội nhũ, phôi cong, hai... lƣợng của hạt Mỗi quả có từ 8 - 15 hạt Hạt của những quả trên thân thƣờng to, mẩy hơn hạt của các quả ở cành Hạt của các quả lứa đầu cũng to và mẩy hơn các quả lứa sau Số lƣợng hạt trung bình trong một quả là một trong những yếu tố chủ yếu tạo thành năng suất của đậu xanh Trọng lƣợng hạt của mỗi cây biến động lớn từ 20 - 90 gam tùy giống, thời vụ và chế độ canh tác Trọng lƣợng hạt biểu thị bằng g/1000 hạt, ... 2.2.1 Phương pháp chiết cao tổng số và các phân đoạn dịch chiết Từ 3000g hạt đậu xanh (Vigna radiata (L. ) Wilczek) sấy khô đƣợc ngâm với ethanol 96% ở nhiệt độ phòng trong vòng 14 ngày (quá trình đƣợc lặp lại 3 lần) Gộp dịch chiết lại, lọc qua giấy lọc 3 lần và cất loại dung môi dƣới bóng điện 220V - 200W chúng tôi thu đƣợc cao tổng số ethanol Cao tổng số đƣợc bớt lại một phần (20 %) để làm các thí nghiệm... và polysaccarid cung cấp năng lƣợng cho sự nẩy mầm của hạt Tuy hàm lƣợng lipid trong hạt đậu xanh chiếm tỷ lệ thấp (trung bình khoảng 1,3 %), nhƣng đó lại là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá phẩm chất và khả năng bảo quản hạt [7] 1.1.5 Một số tác dụng Sinh - dược và công dụng của hạt loài đậu xanh - Theo đông y Hạt đậu xanh có vị ngọt, hơi lạnh, tính mát; có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, trừ phiền... cầu có nhiệt độ cao để mọc mầm, sinh trƣởng và phát triển Nhiệt độ bình quân từ 23 - 25ºC và lƣợng mƣa từ 1300 - 1500 mm là tƣơng đối thích hợp Thời gian sinh trƣởng của cây phụ thuộc vào từng giống, dao động khoảng 60 - 100 ngày [7] 1.1.4 Thành phần hóa học của hạt loài đậu xanh (Vigna radiata (L. ) Wilczek) 1.1.4.1 Protein Protein thực vật nói chung và protein đậu xanh nói riêng là nguồn cung cấp... (2.14 %), 25 cao phân đoạn n - hexan là (1.1 %), cao phân đoạn chloroform (0.7 %) và thấp nhất là ở cao phân đoạn ethylacetate (0.5 %) Kết quả này cho thấy trong hạt đậu xanh có chứa một lƣợng lớn các hợp chất tự nhiên Khối lƣợng cao các phân đoạn thu đƣợc đủ để chúng tôi thực hiện các phản ứng định tính, định lƣợng 3.2 Định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết từ hạt loài đậu xanh ... từ hạt loài đậu xanh (Vigna radiata (L. ) Wilczek) Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu số đặc điểm sinh học dịch chiết từ hạt loài đậu xanh (Vigna radiata (L. ) Wilczek) để từ tạo sở cho nghiên cứu lĩnh... (Vigna radiata (L. ) Wilczek) Hình 1.2 Quả loài đậu xanh ( Vigna radiata (L. ) Wilczek) Hình 2.1 Hạt loài đậu xanh (Vigna radiata (L. ) Wilczek) 18 Hình 3.1 Sơ đồ quy trình tách chiết hợp... Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu số đặc điểm sinh học dịch chiết từ hạt loài đậu xanh (Vigna radiata (L. ) Wilczek) Phƣơng pháp nghiên cứu 6.1 Sử dụng hệ dung môi có độ phân cực khác để tách chiết