Nghiên cứu một số đặc tính hóa sinh dược của dịch chiết từ lá xoài non (mangifera indica l ) (2017)

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, có hỗ trợ từ Giảng viên hướng dẫn T.S Trần Thị Phương Liên Các nội dung nghiên cứu kết đề tài trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu trước Những số liệu bảng, biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá tác giả nghiên cứu có ghi nhật kí thí nghiệm bảng theo dõi thí nghiệm ngày q trình nghiên cứu Ngồi ra, đề tài sử dụng số nghiên cứu, nhận xét, đánh số liệu tác giả, quan tổ chức khác thể phần tài liệu tham khảo Hà Nội, ngày….tháng….năm 2017 Tác giả Trần Thu Hòa LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cô giáo TS Trần Thị Phương Liên tận tình giúp đỡ bảo em suốt q trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị bạn mơn Hóa sinh – sinh lý thực vật, Khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ em suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày….tháng….năm 2017 Tác giả Trần Thu Hòa MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu 3 Nhiệm vụ nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Đóng góp đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vài nét chung xoài Mangifera indica L 1.1.1 Thực vật học 1.1.2 Phân bố, sinh thái 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Một số tác dụng Sinh - dược cơng dụng xồi 1.2 Một số hợp chất tự nhiên thực vật 1.2.1 Các hợp chất thứ sinh chất có hoạt tính sinh học 1.2.2 Hợp chất phenolic 1.2.3 Flavonoid thực vật 1.2.4 Tannin 11 1.2.5 Alkaloid thực vật 12 1.2.6 Hợp chất coumarin 13 1.3 ệnh éo phì 14 1.3.1 Khái niệm phân loại béo phì 14 1.3.2 Thực trạng béo phì giới nước 14 1.3.3 Nguyên nhân gây béo phì 15 1.3.4 Các tác hại nguy cụ thể béo phì 16 1.3.5 Một số số hoá sinh liên quan đến rối loạn trao đổi lipid máu 16 1.3.6 Giải pháp phòng điều trị 17 1.4 Bệnh ung thư 18 1.4.1 Nguyên nhân gây ung thư 18 1.4.2 Một số dấu hiệu bệnh ung thư 19 1.4.3 Thực trạng bệnh ung thư 20 1.5 Thuốc kháng sinh 22 1.5.1 Khái niệm kháng sinh kháng kháng sinh 22 1.5.2 Thực trạng sử dụng thuốc kháng sinh 22 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.1.1 Nguyên liệu thực vật 24 2.1.2 Mẫu động vật chế độ thức ăn 24 2.1.3 Hóa chất, dụng cụ thí nghiệm 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phương pháp tách chiết nghiên cứu 25 2.2.2 Phương pháp sắc ký mỏng 26 2.2.3 Nghiên cứu tác dụng phân đoạn dịch chiết từ xoài non Mangifera indica L lên trọng lượng số số hóa sinh máu chuột béo phì thực nghiệm 28 2.2.4 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết dịch chiết xoài non lên chuột nhắt gây béo phì 29 2.2.5 Sử dụng phương pháp hóa sinh - y dược 29 2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 32 2.2.7 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 32 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Tách chiết, định tính, định lượng hợp chất tự nhiên từ xoài non Mangifera indica L 35 3.1.1 Kết tách chiết phân đoạn cao etanol 35 3.1.2 Kết sắc ký mỏng 35 3.2 Kết xác định liều độc cấp 37 3.3 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 38 3.4 Kết mơ hình chuột béo phì thực nghiệm 40 3.5 Tác dụng phân đoạn dịch chiết cao EtOH từ xoài non lên chuột béo phì thực nghiệm 44 3.6 Kết thử hoạt tính độc tế bào invitro 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 KẾT LUẬN 48 KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU TH M KHẢO 49 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh xồi non Mangifera indica L 24 Hình 2.2 Chuột nhắt thí nghiệm 24 Hình 2.3: Phương pháp lấy máu đo glucose huyết 30 Hình 3.1 Ảnh chụp mỏng sau giải li hình thuốc thử (mẫu 2) 36 Hình 3.2 Chuột éo chuột thường sau tuần ni 41 Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn tăng trọng nhóm chuột với chế độ dinh dưỡng khác vòng tuần 42 Hình 3.4 iểu đồ so sánh số số lipid máu chuột nuôi thường nuôi béo phì thực nghiệm 43 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn biến động số sinh hóa lơ chuột điều trị không điều trị cao phân đoạn 46 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Phân loại BMI người trưởng thành châu Âu châu Á 14 Bảng 2.1: Thành phần thức ăn vỗ béo cho chuột 25 Bảng 3.1 Thành phần tỉ lệ dung mơi sử dụng thí nghiệm sắc ký 35 Bảng 3.2 Kết thử độc tính cấp theo đường uống 37 Bảng 3.3 Kết thử hoạt tính kháng sinh cao phân đoạn EtOH từ xồi non (đơn vị MIC (µg/ml)) 38 Bảng 3.4 Trọng lượng trung bình (tính theo gram) hai nhóm chuột ni hai chế độ dinh dưỡng khác 42 Bảng 3.5 So sánh số số lipid máu chuột ni thường ni béo phì thực nghiệm 43 Bảng 3.6 So sánh trọng lượng (g) lơ chuột éo phì trước sau điều trị 45 Bảng 3.7 So sánh số sinh hóa lơ chuột điều trị không điều trị dịch chiết cao EtOH từ xoài non sau tuần 45 Bảng 3.8 Kết thử hoạt tính độc tế bào 47 DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT LDL – c : Cholesterol xấu HDL – c : Hight denistylipoprotein Cholesterol TG : Triglyceride Glu : Glucose TC : Cholesterol EtOH : Ethanol EtOAc : Ethyl acetate GOD: glucose oxidase CHO: enzyme cholesterol oxydase ATCC: Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ CCL -17 TM : mơ biểu bì miệng KB MTT: (3-(4,5-dimethylthiazol-2 - yl )- 2, - diphenyltetrazolium) OD phản ánh số lượng tế bào sống IC50: nồng độ chất thử ức chế 50% phát triển tế bào DMEM: Dulbeccos Modified Eagle Medium MEME: Minimum Esental Medium with Eagle salt FBS: Fetal Bovine Serum SD: độ lệch chuẩn TM KB (CCL – 17 ): dòng tế ung thư iểu mơ biểu bì miệng TM Hep G2 (HB – 8065 ): dòng tế ung thư gan TM LU-1 (HTB – 57 ): dòng tế ung thư phổi TM MCF-7 (HTB – 22 ): dòng tế ung thư vú TM SK-Mel (HTB – 68 ): dòng tế ung thư da MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Theo Y học cổ truyền, xồi có vị chua ngọt, tính mát, có tác dụng làm mát, lợi tiểu, chống sa nội tạng, dùng trị ệnh hô hấp ho, viêm phế quản cấp hay mạn tính, phù thũng Hơn nữa, xồi có chất anthxyanhdin có tác dụng hạ đường huyết phòng iến chứng mắt mạch máu an đầu Đại học ệnh tiểu đường Kết nghiên cứu Queensland (Úc) cho thấy số hợp chất xồi có tác dụng chữa ệnh tương tự loại thuốc trị tiểu đường làm giảm cholesterol Chính thế, nhiều ác sĩ châu Âu sử dụng xoài phương thuốc hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường vô hiệu Những kết nghiên cứu cho thấy số đường huyết (glycemic index) xồi thấpkhoảng 41-60, xồi khơng gây ảnh hưởng lớn đến việc làm tăng lượng đường máu [29] Trên thực tế, việc nghiên cứu đặc tính y dược từ hoạt chất thiên nhiên xoài non chưa nghiên cứu nhiều Một số nước Thế Giới có nhiều nghiên cứu ứng dụng chế phẩm từ xoài Nhật ản, Trung Quốc, Mỹ, Ấn Độ, Cu a,… Trên thị trường Cu a có chế phẩm Vimang (dịch chiết toàn phần từ vỏ, thân, xoài) sử dụng thực phẩm chức để hỗ trợ điều trị số ệnh miễn dịch, dị ứng, chống oxy hóa, hỗ trợ điều trị HIV Một số nghiên cứu xoài Việt Nam thực từ năm 1989, cơng trình nghiên cứu sau chứng minh khả kháng khuẩn sâu răng, chống viêm xồi; tìm số chủng men dịch chiết xoài; công nghệ tách chiết sản xuất mangiferin từ xồi [29] Trong năm gần đây, cơng nghệ tách chiết hợp chất từ thực vật không ngừng phát triển ước đầu đạt thành đáng kể Trên giới từ lâu người ta ứng dụng công nghệ để sản xuất chất có hoạt tính sinh học, phục vụ cho nghiên cứu, sản xuất phục vụ lợi ích người Những nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học thực vật phát triển từ năm 1950 Có khoảng 30.000 hợp chất chiết xuất từ thực vật có hoạt tính có giá trị sống Những hợp chất alkaloid, terpenoid, phenolic iết đến hợp chất thứ sinh Các hợp chất thường tạo số loại tế định tế rễ tơ, iểu mô, hoa, Mặc dù hóa học tổng hợp hữu đạt nhiều thành tựu quan trọng nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học (thường gọi hợp chất thứ sinh) khó tổng hợp tổng hợp chi phí đắt [10] Nhiều cơng trình nghiên cứu cho thấy, hợp chất polyphenol (một nhóm hợp chất tự nhiên) có hoạt tính sinh dược ngày ứng dụng rộng rãi điều trị nhiều loại ệnh như: kháng viêm, chống ung thư, chống oxy hóa, viêm gan… Ngồi chúng có tác dụng chữa số ệnh rối loạn trao đổi lipid – glucid, éo phì đái tháo đường, ệnh phổ iến nguy hiểm ngày Cùng với phát triển xã hội, có nhiều ệnh gia tăng, ảnh hưởng lớn tới sức khỏe cộng đồng ung thư, éo phì, éo phì tình trạng tích lũy mỡ mức vùng thể hay toàn thân đến mức ảnh hưởng đến sức khỏe như: tăng huyết áp, ệnh tim mạch, rối loạn lipid máu, tiểu đường, giảm chức hô hấp… 3] [4] Ung thư tên chung dùng để gọi nhóm ệnh 200 loại khác nguồn gốc tế ào, nguyên, tiên lượng cách thức điều trị, có đặc điểm chung phân chia khơng kiểm sốt tế ào, khả tồn phát triển quan tổ chức lạ [28] Để đảm ảo sức kho , tránh số tác dụng phụ từ thuốc, ủy an chủng vi khuẩn Gram- Escherichia coli ATCC 25922: hay gọi vi khuẩn đại tràng, lồi vi khuẩn ký sinh đường ruột động vật máu nóng ( ao gồm chim động vật có vú) Vi khuẩn cần thiết q trình tiêu hóa thức ăn thành phần khuẩn lạc ruột Sự có mặt E.coli nước ngầm thị thường gặp cho ô nhiễm phân - Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835: hay gọi tr c khuẩn mủ xanh, mầm ệnh hội gây nhiễm trùng ệnh viện công ệnh nhân ị suy giảm miễn dịch Chủng vi khuẩn thường gây nhiễm trùng đường hô hấp, đường tiết niệu, vết ỏng, vết thương, gây nhiễm trùng huyết - Salmonella enterica ATCC 12228: vi khuẩn gây nhiễm trùng đường tiêu hóa ệnh thương hàn ệnh hiểm nghèo dễ lan vi khuẩn phân người ị ệnh nhiễm vào thức ăn hay nước uống truyền sang người khác chủng vi khuẩn Gram+ - Enterococcuc faecalis ATCC 13124: loại liên cầu sống đường tiêu hóa động vật có vú Liên cầu gây nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm phổi, viêm màng não, đơi xâm nhập qua vết mổ gây nhiễm trùng máu - Stapphylococus aureus ATCC 25923: hay tụ cầu vàng phần hệ vi sinh vật sống thường trú da Tụ cầu gây nhiều nhiễm trùng khác điểm hình ệnh ệnh chốc lở da hình thành ổ áp- xe chứa đầy mủ, sưng đau, tấy đỏ thường kèm theo chảy mủ Nếu tụ cầu xâm nhập vào máu gây nhiễm khuẩn huyết, xâm nhập vào 39 phổi gây viêm phổi, vào xương gây viêm tủy xương, gây nhiễm trùng 40 tm van tim Tụ cầu lưu thơng máu, chuyển đến hệ quan thể gây ệnh nhiễm trùng nghiêm trọng, nguy hiểm đến tính mạng - Bacillus cereus ATCC 13245: chủng vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm chủng Nấm men Candida albicans ATCC 10231: gây nhiễm nấm thể người miệng, âm đạo, dương vật gây ngứa rát Rất nhiễm trùng trở thành xâm hại lan rộng khắp thể Tình trạng nhiễm nấm phổ iến với tr sơ sinh tháng tuổi, người già, người ị suy giảm hệ thống miễn dịch ( ao gồm HIV/ IDS, loại thuốc sử dụng sau cấy ghép nội tạng, tiểu đường, sử dụng corticosteroid), rủi ro khác ao gồm việc sử dụng giả sau dùng kháng sinh trị liệu Từ ảng số liệu rút kết luận : mẫu cao phân đoạn có hoạt tính ức chế mạnh tất mẫu vi sinh vật thử hoạt tính, chí cao nhiều so với chất kháng sinh điều chế vào sử dụng từ lâu Y học Như vậy, nói cao EtOH từ xồi non có tính kháng viêm cao với chủng vi sinh vật sử dụng thí nghiệm Đây triển vọng tốt cho nghiên cứu chuyên sâu chủng vi sinh vật khác thách thức Y tế Dịch tễ học 3.4 Kết mô h nh chuột éo ph th c nghiệm Chuột nhắt trắng (Muss musculus) chủng Swiss (khối lượng an đầu 17 - 20g) chia làm lô Lô 1: Cho ăn chế độ ình thường (thức ăn Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương) Lô 2-4: Cho ăn thức ăn giàu lipid cholesterol cao Sau tuần nuôi theo chế độ trên, tiến hành cân trọng lượng 40 chuột Dưới hình ảnh so sánh chuột ăn thức ăn thường chuột ăn thức ăn giàu lipid cholesterol cao A – Chuột thường B – Chuột éo H nh 3.2 Chuột éo chuột thường sau tuần nuôi Kết thay đổi trọng lượng chuột thí nghiệm thể ảng 3.4 hình 3.3 41 Bảng 3.4 Trọng lượng trung nh (tính theo gram) hai nhóm chuột ni ằng hai chế độ dinh dưỡng khác Nhóm Trọng lƣợng (g) Ban đầu Tuần Tuần Tuần Tuần Ăn thƣờng 17,93 22,78 28,95 34,72 40,73 Ăn éo 18,09 29.27 39,71 47,66 52,87 Hình 3.3 Biểu đồ iểu diễn s tăng trọng nhóm chuột với chế độ dinh dưỡng khác vòng tuần Qua thử nghiệm tơi tạo thành cơng mơ hình chuột éo phì thực nghiệm Sau tuần với chế độ thức ăn giàu lipid cholesterol chúng tơi thấy có khác iệt r rệt khối lượng chuột nuôi ằng thức ăn giàu lipid so với chuột nuôi ằng thức ăn thường Cụ thể: chuột nuôi ằng thức ăn thường thể tăng thêm 22,8g ứng với 227,16% so với an đầu Trong chuột 42 nuôi ằng thức ăn giàu lipid cholesterol trọng lượng thể tăng thêm 43 34,78g ứng với 292,26% cao gấp 1,298 lần so với chuột nuôi thường Chọn ngẫu nhiên 13 chuột nuôi éo Sau cho nhịn đói 12 giờ, tơi lấy máu tổng số phân tích số hố sinh để đánh giá ảnh hưởng chế độ nuôi éo đến số lipid huyết Bảng 3.5 So sánh số số lipid máu chuột nuôi thường nuôi éo ph th c nghiệm Các số lipid (mmol/l) TC TG Nhóm ăn 4.16 thường Nhóm ăn éo So sánh éo/thường lô HDL-c LDL-c Glucose 1.18 1.64 2.83 6.15 ±0.44 ±0.2 ±0.2 ±0.32 ±0.37 6.03* 2.54* 0.97* 3.91* 8.93* ±0.31 ±0.21 ±0.2 ±0.37 ±0.35 ↑1,45 ↑2,15 ↓1,69 ↑1,38 ↑1,45 H nh 3.4 Biểu đồ so sánh số số lipid máu chuột nuôi thường nuôi éo ph th c nghiệm 44 Từ bảng số liệu bảng 3.5 hình 3.4 cho thấy số hóa sinh có khác biệt lớn lô nuôi thường lô nuôi béo Cụ thể: Hàm lượng glucose chuột béo phì 8.93 mmol/l, tăng 45.2% so với chuột nuôi thường (6.15mmol/l) với mức ý nghĩa P