Nghiên cứu một số đặc tính hoá sinh dược của dịch chiết từ thân cây ngũ gia bì

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ====== NGUYỄN THỊ PHƢƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA SINH DƢỢC CỦA DỊCH CHIẾT TỪ THÂN CÂY NGŨ GIA BÌ (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.)MERR) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa sinh học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học ThS. PHÍ THỊ BÍCH NGỌC HÀ NỘI , 2014 LỜI CẢM ƠN Với tấm lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn Ths. Phí Thị Bích Ngọc và TS. Trần Thị Phƣơng Liên, những ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ Trung tâm Hỗ trợ thiết bị và Chuyển giao công nghệ - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng, các anh chị cao học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới gia đình, bạn bè, là những ngƣời luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ và là chỗ dựa tinh thần lớn nhất giúp tôi vƣợt qua khó khăn để có đƣợc ngày hôm nay. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 05 tháng 05 năm 2014 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Phƣơng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong khóa luận là do tôi thực hiện và không trùng lặp với bất cứ tác giả nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những nội dung đƣợc đề cập trong bản khóa luận này. Hà Nội, ngày 05 tháng 05 năm 2014 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Phƣơng DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT BP Béo phì ĐTĐ Đái tháo đƣờng ĐT Điều trị EtOAc Ethylacetat EtOH Ethanol HDL Lipoprotein tỷ trọng cao ( High- density lipoprotein) LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp ( Low- density lipoprotein) Met Metformin PĐ Phân đoạn POD Peroxidase TG Triglycerid WHO Tổ chức Y tế Thế giới TN 0 Thí nghiệm DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại BMI của ngƣời trƣởng thành châu Âu và châu Á Bảng 2.1. Bảng các phản ứng định tính đặc trƣng Bảng 2.2. Mô hình nghiên cứu khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì(Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) Bảng 3.1. Hiệu suất chiết rút các phân đoạn từ thân cây Ngũ gia bì Bảng 3.2. Kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn acid gallic Bảng 3.4. Định lƣợng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì Bảng 3.5. Kết quả thử độc tính cấp theo đƣờng uống Bảng 3.6. Trọng lƣợng trung bình của hai nhóm chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dƣỡng khác nhau Bảng 3.7. So sánh một số chỉ số hóa sinh máu giữa chuột nuôi thƣờng và nuôi béo phì thực nghiệm Bảng 3.8. Nồng độ glucose huyết của các lô chuột trƣớc và sau khi tiêm STZ Bảng 3.9. Kết quả nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột sau 14 ngày điều trị. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Lá và thân cây Ngũ gia bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) Hình 2.2. Chuột nhắt trắng chủng Swiss Hình 3.1. Quy trình chiết suất các chất tự nhiên từ thân cây Ngũ gia bì Hình 3.2. Đồ thị đƣờng chuẩn acid gallic Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn sự tăng trọng của các nhóm chuột với 2 chế độ dinh dƣỡng khác nhau trong vòng 8 tuần Hình 3.4. Biểu đồ so sánh một số chỉ số hóa sinh giữa các lô chuột thí nghiệm Hình 3.5. Biểu đồ so sánh khối lƣợng của các lô chuột đái tháo đƣờng trƣớc và sau khi điều trị Hình 3.6. Nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột thí nghiệm trƣớc và sau khi tiêm 72 giờ Hình 3.7. Nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột trƣớc và sau 14 ngày điều trị Hình 3.8. Biểu đồ một số chỉ số lipid chuột đái tháo đƣờng trƣớc và sau điều trị bằng thân cây Ngũ gia bì MỤC LỤC MỤC LỤC 7 MỞ ĐẦU 1 NỘI DUNG 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Giới thiệu chung về cây Ngũ gia bì 4 1.1.1. Phân loại, mô tả 4 1.1.2. Phân bố 4 1.1.3. Thành phần hoá học 4 1.1.4. Công dụng 5 1.2. Giới thiệu một số hợp chất tự nhiên từ thực vật 5 1.2.1. Các hợp chất thứ sinh và các chất có hoạt tính sinh học 5 1.2.2. Flavonoid thực vật 6 1.2.1.1. Cấu tạo hóa học 6 1.2.1.2. Hoạt tính sinh học 7 1.2.2. Hợp chất phenolic 7 1.2.2.1. Cấu tạo hóa học 7 1.2.2.2. Hoạt tính sinh học 8 1.2.3. Alkaloid thực vật 8 1.2.3.1. Cấu tạo hóa học 8 1.2.3.2. Hoạt tính sinh học 9 1.2.4. Tannin thực vật 9 1.2.4.1. Cấu trúc hóa học 9 1.2.4.2. Hoạt tính sinh học 9 1.2.5. Hợp chất coumarin 10 1.3. Bệnh béo phì 10 1.3.1. Thực trạng béo phì trên thế giới và ở Việt Nam 11 1.3.2. Tác hại và nguy cơ của bệnh béo phì 11 1.4. Bệnh đái tháo đƣờng (Diabetes mellitus) 12 1.4.1. Khái niệm và phân loại 12 1.4.2. Thực trạng ĐTĐ trên thế giới và ở Việt Nam 13 1.4.3. Tác hại và biến chứng 13 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 14 2.1.1. Mẫu thực vật 14 2.1.2. Mẫu động vật 14 2.1.3. Hóa chất, dụng cụ thí nghiệm 15 2.1.3.1. Hóa chất 15 2.1.3.2. Dụng cụ thí nghiệm 15 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 16 2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết nghiên cứu 16 2.2.2. Phƣơng pháp khảo sát thành phần hóa học của thân cây Ngũ gia bì 16 2.2.2.1. Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên 16 2.2.2.2. Định lƣợng polyphenol tổng số theo phƣơng pháp Folin-Ciocalteau 18 2.2.3. Nghiên cứu tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) lên trọng lƣợng và một số chỉ số hóa sinh máu của chuột béo phì thực nghiệm 19 2.2.3.1. Thử độc tính cấp, xác định LD 50 19 2.2.3.2. Xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm 19 2.2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) 20 2.2.4.1. Tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2 20 2.2.4.2. Thử khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịchchiết 20 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn từ thân cây Ngũ gia bì 22 3.2. Kết quả khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong các phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì 23 3.2.1. Định tính một số hợp chất tự nhiên có trong thân cây Ngũ gia bì 23 3.2.2. Định lƣợng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết 25 3.2.2.1. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn acid gallic 25 3.2.2.2. Kết quả xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số 26 3.3. Kết quả xác định liều độc cấp 27 3.4. Kết quả mô hình chuột béo phì thực nghiệm 27 3.5. Tác dụng của một số phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì lên chuột béo phì thực nghiệm 32 3.6. Tác dụng hạ glucose huyết của thân cây Ngũ gia bì trên mô hình chuột đái tháo đƣờng type 2 33 3.6.1. Kết quả tạo mô hình chuột đái tháo đƣờng type 2 thực nghiệm 33 3.6.2. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì đến nồng độ glucose huyết lúc đói của chuột ĐTĐ 36 3.7. Tác dụng đến chuyển hóa lipid của thân cây Ngũ gia bì trên mô hình chuột ĐTĐ type 2 39 KẾT LUẬN 42 KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 1 MỞ ĐẦU 1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Do sự phát triển của xã hội hiện nay kéo theo nhịp sống công nghiệp hiện đại của con ngƣời, sự không phù hợp về thay đổi lối sống, các chế độ ăn uống mất cân đối dinh dƣỡng là nguyên nhân dẫn đến nhiều căn bệnh nguy hiểm nhƣ : bệnh đái tháo đƣờng (Diabetes mellitus), bệnh béo phì (Obesity), ung thƣ, tim mạch… Theo ƣớc tính của WHO trên thế giới có hơn 346 triệu ngƣời mắc đái tháo đƣờng. Từ nay tới năm 2030 con số này có khả năng tăng gấp đôi nếu không có biện pháp can thiệp. Gần 80% các trƣờng hợp tử vong do đái tháo đƣờng là ở các quốc gia thu nhập thấp và trung bình. Ở Việt Nam Bệnh viện Nội tiết Trung ƣơng đã công bố kết quả nghiên cứu bệnh viện thực hiện trong năm 2012. Theo đó, trong hơn 11.000 ngƣờituổi 30-69 tại 6 vùng sinh thái gồm: Miền núi phía Bắc, Đồng bằng sông Hồng, Duyên hải miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Tây Nam Bộ đã tham gia nghiên cứu, số bệnh nhân mắc bệnh tiểu đƣờng chiếm khoảng 6%. Đáng nói, số ngƣời mắc tiểu đƣờng có xu hƣớng tăng nhanh nhƣng số ngƣời phát hiện bệnh lại rất thấp. Theo kết quả nghiên cứu này, tỷ lệ ngƣời bệnh tiểu đƣờng trong cộng đồng không đƣợc phát hiện ở nƣớc ta là gần 64%. Kiến thức chung về bệnh của ngƣời dân cũng rất thiếu. Gần 76% số ngƣời đƣợc hỏi có kiến thức rất thấp về chẩn đoán và biến chứng của bệnh, chỉ có 0,5% có kiến thức tốt. Trong những năm gần đây, công nghệ tách chiết các hợp chất từ thực vật đã không ngừng phát triển và bƣớc đầu đạt đƣợc những thành quả đáng kể. Trên thế giới từ rất lâu ngƣời ta đã ứng dụng những công nghệ này để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học, phục vụ cho nghiên cứu, sản xuất và phục vụ lợi ích của con ngƣời. Những nghiên cứu về hợp chất có hoạt tính sinh học [...]... việc nghiên cứu đặc tính hóa sinh, y dƣợc của các hoạt chất thiên nhiên từ đối tƣợng này chƣa đƣợc nghiên cứu một cách thỏa đáng Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài : "Nghiên cứu một số đặc tính hóa sinh dƣợc của dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) " 2 NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU 2.1 Khảo sát sơ bộ thành phần các hợp chất tự nhiên có trong thân cây Ngũ gia bì (Acanthopanax... phân đoạn từ dịch chiết thân cây Ngũ gia bì, chúng tôi tiến hành các phản ứng định tính, định lƣợng 3.2.1 Định tính một số hợp chất tự nhiên có trong thân cây Ngũ gia bì Sử dụng các thuốc thử đặc trƣng cho từng nhóm hợp chất tự nhiên, chúng tôi thu đƣợc kết quả trình bày trong bảng 3.2 23 Bảng 3.2 Kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì Mẫu Nhóm chất... tôi tiến hành lựa chọn ngẫu nhiên từ mỗi nhóm ra 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số lipid máu Các số liệu đƣợc thu thập và tiến hành xử lí thống kê 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) Để tìm hiểu tác dụng của dịch chiết thân cây Ngũ gia bì lên đƣờng huyết, trƣớc tiên... định lƣợng tƣơng tự nhƣ đã làm với mẫu chuẩn acid gallic 2.2.3 Nghiên cứu tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) lên trọng lượng và một số chỉ số hóa sinh máu của chuột béo phì thực nghiệm 2.2.3.1 Thử độc tính cấp, xác định LD50 Xác định LD50 của dịch chiết thân cây Ngũ gia bì bằng đƣờng uống theo phƣơng pháp Lorke [18] Chuột nhịn đói... trình tách chiết các phân đoạn từ thân cây Ngũ gia bì Để tìm hiểu thành phần hóa học của thân cây Ngũ gia bì, chúng tôi tiến hành chiết nhƣ đã mô tả ở phần phƣơng pháp thu đƣợc cao ethanol Sau đó tiếp tục chiết với dung môi có độ phân cực tăng dần : n- hexan và ethylacetat Kết quả đƣợc trình bày trên sơ đồ 3.1 và bảng 3.1 3000 g thân cây Ngũ gia bì Chiết ethanol 3 lần 150 g Cao ethanol Bã sau khi chiết. .. chiết bằng ethanol Chiết bằng n - hexan 50.2 g Cao n - hexan Bã sau khi chiết bằng n - hexan Chiết bằng ethylacetate 42.5 g Cao ethylacetate Bã sau khi chiết bằng ethylacetate Hình 3.1 Quy trình chiết suất các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì Với quy trình chiết rút nhƣ trên, chúng tôi thu đƣợc hiệu suất chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ 3 kg thân cây Ngũ gia bì nhƣ bảng 3.1 22... định LD50 của dịch chiết tổng số từ thân cây Ngũ gia bì trên chuột nhắt trắng bằng đƣờng uống theo phƣơng pháp của Lorke [18] Chuột cho nhịn đói trƣớc 16 giờ thí nghiệm, đƣợc phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 5 con và đƣợc cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg thể trọng Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết thân cây Ngũ gia bì Bảng 3.5 Kết quả thử độc tính cấp... TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1 Mẫu thực vật Thân cây Ngũ gia Bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) đƣợc thu thập ở Lai Châu Mẫu cây Ngũ gia bì đƣợc giám định bởi Bộ môn Thực vật học - trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 Hình 2.1 Lá và thân cây Ngũ gia bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) 2.1.2 Mẫu động vật Chuột bạch chủng Swiss nặng từ 14-17g đƣợc nuôi béo... phƣơng pháp tách chiết, định tính, định lƣợng 2.2 Định lƣợng polyphenol tổng số theo phƣơng pháp Folin- Ciocalteau 2 2.3 Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết và chống rối loạn trao đổi lipid của các phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) trên mô hình chuột BP và ĐTĐ type II 3 NỘI DUNG CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây Ngũ gia bì 1.1.1 Phân... trong thân cây Ngũ gia bì có chứa một lƣợng lớn các hợp chất tự nhiên Trong đó hàm lƣợng các hợp chất phenolic chiếm tỷ lệ khá cao Điều này đƣợc chứng minh ở kết quả xét nghiệm định tính và định lƣợng 3.2 Kết quả khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong các phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì Nhằm góp phần đánh giá thành phần các hợp chất tự nhiên cơ bản có trong cao các phân đoạn từ dịch . các phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì 23 3.2.1. Định tính một số hợp chất tự nhiên có trong thân cây Ngũ gia bì 23 3.2.2. Định lƣợng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết 25 3.2.2.1 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ====== NGUYỄN THỊ PHƢƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA SINH DƢỢC CỦA DỊCH CHIẾT TỪ THÂN CÂY NGŨ GIA BÌ (Acanthopanax trifoliatus gatus. phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn acid gallic Bảng 3.4. Định lƣợng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì Bảng 3.5.