Cao các phân đoạn đƣợc hòa tan trong dung môi thích hợp với từng loại phản ứng định tính. Các nhóm phản ứng đƣợc trình bày tóm tắt ở bảng 2.1.
17 Bảng 2.1. Bảng các phản ứng định tính đặc trƣng Nhóm hợp chất Phản ứng Thuốc
thử Dấu hiệu nhận biết
Flavonoid
Shinoda Mg/HCl
Màu đỏ, hồng, da cam xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của flavon, flavonol và các dẫn
xuất hydro của chúng. Diazo
hoá Diazo Phản ứng cho màu da cam là dƣơng tính. Dung
dịch kiềm
NaOH 10%
Phản ứng có kết quả dƣơng tính khi xuất hiện màu vàng cam.
Acid sulfuric
H2SO4 10%
Phản ứng cho mầu vàng đậm cho thấy sự có mặt của favon và flavonol, mầu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon
và auron.
Vanilin/HCl Màu đỏ son xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của catechin.
Tannin
Vanilin/H2SO4 Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện màu đỏ đậm.
Dung dịch 5% Gelatin/1% NaCl
Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện kết tủa.
Acetate chì 10% Phản ứng dƣơng tính nếu kết tủa xuất hiện. Alkaloid Bouchar dat Hỗn hợp KI + I2 /HCl
Phản ứng dƣơng tính nếu có màu đỏ thẫm.
18 VansMa yer Hỗn hợp HgCl2+ KI
Phản ứng dƣơng tính nếu có kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt.
Dragendorf Phản ứng dƣơng tính nếu có kết tủa màu da cam.
Glycoside Keller-Killian
Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện vòng đỏ nâu ở bề mặt phân cách giữa hai lớp
chất lỏng.
Polyphen- ol khác
Dung dịch kiềm Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện màu vàng.
FeCl3/HCl Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện màu lục, xanh, đen.
2.2.2.2. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin-Ciocalteau Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong mẫu) với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm có màu xanh lam. So màu trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở bƣớc sóng λ= 765 nm, dùng chất chuẩn là acid gallic.
Các bước tiến hành như sau: Chuẩn bị mẫu định lượng và hóa chất:
* Dung dịch acid gallic: 0,5 g acid gallic + 10 ml C2H5OH + 90 ml H2O bảo quản lạnh. Nhƣ vậy dịch chuẩn gốc acid gallic có nồng độ 5 mg/ml.
Dung dịch Na2CO3: 200 g Na2CO3 + 800ml H2O đun sôi. Thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nƣớc cất tới 1000ml.
* Dung dịch mẫu cần định lƣợng.
19
Chuẩn bị cốc định lƣợng theo số lƣợng dung dịch gốc nhƣ sau: 0, 1, 2, 3, 5 và 10 ml sau đó dẫn nƣớc cất tới 100μl ta thu đƣợc các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250 và 500 mg/l acid gallic.
Cho vào mỗi cuvert 20 μl mẫu thử (dung dịch acid gallic chuẩn ở các nồng độ hoặc dịch chiết các phân đoạn) + 1,58 ml H2O + 100 μl thuốc thử Folin-Ciocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300 μl Na2CO3. Để hỗn hợp dung dịch phản ứng trong 2 giờ ở 200C rồi xác định ở bƣớc sóng 765nm. Tiến hành định lƣợng acid gallic để dựng đƣờng chuẩn.
Định lượng phenolic của mẫu nghiên cứu bằng cách lấy 20 μl (0,02 ml) để định lƣợng tƣơng tự nhƣ đã làm với mẫu chuẩn acid gallic.
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) lên trọng lượng và một số chỉ số hóa sinh máu của chuột béo phì thực nghiệm
2.2.3.1. Thử độc tính cấp, xác định LD50
Xác định LD50 của dịch chiết thân cây Ngũ gia bì bằng đƣờng uống theo phƣơng pháp Lorke [18]. Chuột nhịn đói trƣớc 16h thí nghiệm đƣợc phân lô ngẫu nhiên N= 10 và cho uống theo liều tăng dần lên đến 8 g/kg (thể tích và khối lƣợng tối đa cho phép). Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr).
2.2.3.2. Xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, sau khi mua về đƣợc chăm sóc ở điều kiện bình thƣờng trong 3- 4 ngày để thích ứng với môi trƣờng mới sau đó chúng tôi tiến hành phân chuột thành hai nhóm với hai chế độ dinh dƣỡng nhƣ sau:
Nhóm 1- Nhóm đối chứng: các con chuột tiếp tục đƣợc chăm sóc bằng thức ăn bình thƣờng (do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng cung cấp).
20
Nhóm 2- Nhóm nuôi béo: các con chuột đƣợc chăm sóc bằng chế độ thức ăn giàu lipid và cholesterol do chúng tôi phối trộn các thực phẩm dinh dƣỡng.
Các nhóm chuột đƣợc theo dõi trong vòng 8 tuần, trọng lƣợng của các con chuột đƣợc kiểm tra hàng tuần. Vào tuần cuối cùng thời gian thí nghiệm, sau khi xác định trọng lƣợng, chúng tôi tiến hành lựa chọn ngẫu nhiên từ mỗi nhóm ra 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số lipid máu. Các số liệu đƣợc thu thập và tiến hành xử lí thống kê.
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr)
Để tìm hiểu tác dụng của dịch chiết thân cây Ngũ gia bì lên đƣờng huyết, trƣớc tiên chúng tôi tiến hành gây mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2 dựa trên chế độ ăn giàu chất béo kết hợp với STZ liều đơn của Srinivasan [14].
2.2.4.1. Tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2
Để có mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2, chuột nuôi với chế độ ăn giàu chất béo và cholesterol sau 8 tuần, đƣợc tiêm màng bụng liều đơn STZ (110 mg/kg pha trong đệm citrate 0,01M, pH= 4,3).
Đo đƣờng huyết tại các thời điểm 0 giờ (trƣớc khi tiêm STZ), 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ (sau khi tiêm STZ). Đo 3 lần, mỗi lần cách nhau 1 tiếng và lấy giá trị trung bình. Chuột nào có đƣờng huyết cao (≥18 mmol/l) và ổn định đƣợc lựa chọn để cho uống cao phân đoạn dịch chiết trong vòng 21 ngày. Đƣờng huyết trong các trƣờng hợp trên đều đƣợc đo sau khi cho chuột nhịn qua đêm (12 giờ), chỉ cho uống nƣớc.
2.2.4.2. Thử khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịchchiết
Các lô chuột ĐTĐ type 2 (5 con/lô) đƣợc ăn thức ăn thƣờng và điều trị hằng ngày bằng cách cho uống cao các phân đoạn dịch chiết nhƣ bảng 2.2.
21
Đƣờng huyết của các con chuột đƣợc đo vào cùng một thời điểm trong ngày và sau khi nhịn đói 12 giờ ở các ngày thứ 0 (trƣớc khi điều trị), ngày thứ 5, thứ 10, thứ 14 khi điều trị.
Bảng 2.2. Mô hình nghiên cứu khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì
(Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) Lô Chế độ ăn
trƣớc điều trị Tiêm Mục đích
1 Thức ăn chuẩn Uống nƣớc cất, không điều trị. 2 Thức ăn béo STZ Uống nƣớc cất, không điều trị.
3 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn ethanol (2000 mg/kg). 4 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn n- hexan
(2000 mg/kg).
5 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn ethylacetate (2000 mg/kg).
22
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn từ thân cây Ngũ gia bì
Để tìm hiểu thành phần hóa học của thân cây Ngũ gia bì, chúng tôi tiến hành chiết nhƣ đã mô tả ở phần phƣơng pháp thu đƣợc cao ethanol. Sau đó tiếp tục chiết với dung môi có độ phân cực tăng dần : n- hexan và ethylacetat. Kết quả đƣợc trình bày trên sơ đồ 3.1 và bảng 3.1.
Hình 3.1. Quy trình chiết suất các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì
Với quy trình chiết rút nhƣ trên, chúng tôi thu đƣợc hiệu suất chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ 3 kg thân cây Ngũ gia bì nhƣ bảng 3.1.
Bã sau khi chiết bằng n - hexan 50.2 g Cao n - hexan
Chiết bằng n - hexan
Bã sau khi chiết bằng ethylacetate 42.5 g Cao ethylacetate
150 g Cao ethanol Bã sau khi chiết bằng ethanol Chiết ethanol 3 lần 3000 g thân cây Ngũ gia bì
23
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết rút các phân đoạn từ thân cây Ngũ gia bì
Phân đoạn Số mẫu thu được (g)
Hiệu suất chiết rút (% nguyên liệu khô)*
Cao ethanol 150 5
Cao n – hexan 50.2 1.67
Cao ethylacetate 42.5 1.42
(* Tính theo nguyên liệu khô ban đầu)
Hiệu suất chiết rút cao nhất là ở phân đoạn cao ethanol (5%) so với khối lƣợng nguyên liệu khô ban đầu là 150g, tiếp đến là ở cao phân đoạn n- hexan (1.67%), thấp nhất là cao phân đoạn ethyacetate (1.42%). Kết quả này cho thấy trong thân cây Ngũ gia bì có chứa một lƣợng lớn các hợp chất tự nhiên. Trong đó hàm lƣợng các hợp chất phenolic chiếm tỷ lệ khá cao. Điều này đƣợc chứng minh ở kết quả xét nghiệm định tính và định lƣợng.
3.2. Kết quả khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong các phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì
Nhằm góp phần đánh giá thành phần các hợp chất tự nhiên cơ bản có trong cao các phân đoạn từ dịch chiết thân cây Ngũ gia bì, chúng tôi tiến hành các phản ứng định tính, định lƣợng.
3.2.1. Định tính một số hợp chất tự nhiên có trong thân cây Ngũ gia bì
Sử dụng các thuốc thử đặc trƣng cho từng nhóm hợp chất tự nhiên, chúng tôi thu đƣợc kết quả trình bày trong bảng 3.2.
24
Bảng 3.2. Kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì
Chú thích:
(-) : Không phản ứng (++) : Phản ứng mạnh
(+) : Phản ứng (+++) : Phản ứng rất mạnh Kết quả định tính cho thấy thành phần các hợp chất tự nhiên trong thân cây Ngũ gia bì khá phong phú bao gồm: Flavonoid, tannin, glycoside và alkaloid. Cao của cả 3 phân đoạn EtOH, n-hexan, EtOAc đều chứa các thành phần này nhƣng với hàm lƣợng khác nhau. Các phân đoạn EtOH, n-hexan, EtOAc có chứa thành phần hợp chất tự nhiên khá giống nhau: chứa nhiều alkaloid, polyphenol; không chứa catechin. Từ bảng 3.2 ta thấy ở phân đoạn
Nhóm chất Thuốc thử
Mẫu Cao ethanol Cao
n-hexan EtOAc Flavonoid Shinoda + + + Diazo + + + H2SO4 đặc + + ++ Catechin Vanilin/HCl (đ) - - - Tannin Vanilin - - - Gelatin/NaCl + + + Acetat chì + ++ + Polyphenol khác NaOH 10% + + ++ FeCl3 5% +++ +++ ++ Glycoside Keller-killian + ++ + Alkaloid Mayen + + + Dragendroff + ++ ++ Bouchardat +++ ++ ++
25
cao cồn tổng số, phân đoạn cao n-hexan và cao etylacetate chứa rất nhiều polyphenol và mức phản ứng mạnh và rất mạnh, chứng tỏ là hợp chất có hoạt tính sinh học cao, có khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn ... Kết quả định tính này giúp chúng tôi có những định hƣớng để tiếp tục nghiên cứu ở mức độ cao hơn.
3.2.2. Định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết
Chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết bằng phƣơng pháp Folin - Ciocalteau.
3.2.2.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic
Đƣờng chuẩn acid gallic đƣợc xây dựng bằng cách chuẩn bị các dung dịch acid gallic ở các nồng độ 50, 100, 150, 250, 500mg/l, tiến hành trên máy ERMA ở bƣớc sóng 765nm. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.2.
Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn acid gallic
TT acid gallic (mg/l) OD (765nm) 1 0 0.009 2 50 0.062 3 100 0.119 4 150 0.168 5 250 0.265 6 500 0.519
26
Hình 3.2 : Đồ thị đƣờng chuẩn acid gallic
3.2.2.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Bảng 3.4. Định lƣợng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì
Mẫu OD765nm Hàm lƣợng polyphenol (mg/l) Tỷ lệ (%) polyphenol Cao EtOH 0.04 27.2 0.272 Cao n-hexan 0.67 657.2 6.572 Cao EtOAc 0.22 207.2 2.072
Bảng định lƣợng 3.4 cho thấy rằng, hàm lƣợng polyphenol tổng số trong cao phân đoạn n-hexan là cao nhất (6.572%), sau đó đến phân đoạn cao EtOAc (2.072%). Đối với phân đoạn EtOH hàm lƣợng polyphenol thấp nhất (0.272%).
Kết quả đó chỉ ra rằng, thành phần hóa học trong thân cây Ngũ gia bì có chứa nhiều hợp chất có khả năng tan tốt trong cao n-hexan và cao ethylacetate. Điều này phù hợp với tính chất vật lý và sự phân cực của phân tử polyphenol, chúng tan tốt trong dung môi phân cực và ít tan trong dung môi không phân cực. Chính vì polyphenol là những hợp chất hữu cơ có hoạt tính
y = 0.001x + 0.0128 R2 = 0.9997 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 400 500 600 axit gallic (m g/L) O D 7 6 5 n m
27
sinh học cao nên chúng tôi quyết định chọn các phân đoạn ethanol, ethylacetate, n- hexan vào điều trị cho chuột gây béo phì và ĐTĐ.
3.3. Kết quả xác định liều độc cấp
Xác định LD50 của dịch chiết tổng số từ thân cây Ngũ gia bì trên chuột nhắt trắng bằng đƣờng uống theo phƣơng pháp của Lorke [18]. Chuột cho nhịn đói trƣớc 16 giờ thí nghiệm, đƣợc phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 5 con và đƣợc cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg thể trọng. Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết thân cây Ngũ gia bì.
Bảng 3.5. Kết quả thử độc tính cấp theo đƣờng uống
Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết
6500mg/kg 10 0 0%
7000mg/kg 10 0 0%
7500mg/kg 10 0 0%
8000mg/kg 10 0 0%
Sau 72 giờ theo dõi với các liều 6500, 7000, 7500 mg/kg thể trọng thấy không có con chuột nào chết. Đến liều cao nhất 8000mg/kg thể trọng cũng không có con nào chết, vì vậy chƣa tính đƣợc LD50, nghĩa là có thể kết luận các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì hoàn toàn không độc dù ở liều rất cao theo đƣờng uống.
3.4. Kết quả mô hình chuột béo phì thực nghiệm
Chuột nhắt trắng (Muss musculus) chủng Swiss (khối lƣợng ban đầu là 14 – 17 g) đƣợc chia làm 8 lô.
Lô 1: cho ăn chế độ bình thƣờng (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng).
28
Sau 8 tuần nuôi theo chế độ trên, chúng tôi tiến hành cân trọng lƣợng chuột. Kết quả sự thay đổi trọng lƣợng của chuột thí nghiệm đƣợc thể hiện ở bảng 3.6 và hình 3.3.
Bảng 3.6. Trọng lƣợng trung bình (tính theo gam) của hai nhóm chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dƣỡng khác nhau
Nhóm Nhóm ăn thƣờng Nhóm ăn béo
Ban đầu 14.65 ± 0.50 14.65 ± 0.50 Tuần 1 17.59 ± 0.67 21.57 ± 1.02 Tuần 2 20.21 ± 1.02 30.78 ± 1.91 Tuần 3 24.78 ± 0.91 36.43 ± 2.30 Tuần 4 28.42 ± 1.01 40.27 ± 2.73 Tuấn 5 33.58 ± 1.80 45.82 ± 3.05 Tuần 6 38.77 ± 1.08 50.23 ± 3.12 Tuần 7 41.20 ± 1.40 55.10 ± 4.68 Tuần 8 44.45 ± 1.24 59.92 ± 5.74
(Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình của các lô chuột; (*): p < 0.05 so sánh với nhóm ăn thường)
29
Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn sự tăng trọng của các nhóm chuột với 2 chế độ dinh dưỡng khác nhau trong vòng 8 tuần
Bảng 3.6 và hình 3.3 đã cho thấy, chuột đƣợc nuôi theo chế độ ăn có hàm lƣợng lipid và cholesterol cao (ăn béo - HFD) có khả năng tăng về trọng lƣợng lớn hơn rất nhiều so với chuột ăn thức ăn thƣờng (ND) và sự sai khác này là có ý nghĩa p < 0.05. Cụ thể là sau 8 tuần nuôi, chuột nuôi với thức ăn thƣờng trọng lƣợng cơ thể chỉ tăng thêm 29.8 g ứng với 203.41% so với ban đầu, trong khi chuột nuôi với thức ăn có hàm lƣợng lipid và cholesterol cao trọng lƣợng cơ thể tăng thêm 45.27 g ứng với 309.01% so với ban đầu. Nhƣ vậy, chuột ăn thức ăn có hàm lƣợng lipid và cholesterol cao đã tăng trọng hơn so với chuột ăn thức ăn thƣờng là 15.47g hay gấp 1.52 lần
Để đánh giá ảnh hƣởng của chế độ nuôi béo đến một số chỉ số lipid trong huyết thanh của chuột vào ngày cuối cùng của thời gian nuôi béo sau khi cho nhịn đói qua đêm, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số hoá sinh. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.7 và hình 3.4 sau đây.
0 10 20 30 40 50 60
Ban đầu Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6 Tuần 7 Tuần 8 14.56 17.59 20.21 24.78 28.42 33.58 38.77 41.2 44.45 14.56 21.57 30.78 36.43 40.27 45.82 50.23 55.1 59.92 Nhóm ăn thường Nhóm ăn béo
30
Bảng 3.7. So sánh một số chỉ số hóa sinh máu giữa chuột nuôi thƣờng và nuôi béo phì thực nghiệm
Các chỉ số lipid (mmol/l) TC TG HDL-c LDL-c Glucose Nhóm ăn thƣờng 3.7 ± 0.22 1.15 ± 0.15 2.7 ± 0.17 0.5 ± 0.10 6.52 ± 0.20 Nhóm ăn béo