Các lô chuột ĐTĐ type 2 (5 con/lô) đƣợc ăn thức ăn thƣờng và điều trị hằng ngày bằng cách cho uống cao các phân đoạn dịch chiết nhƣ bảng 2.2.
21
Đƣờng huyết của các con chuột đƣợc đo vào cùng một thời điểm trong ngày và sau khi nhịn đói 12 giờ ở các ngày thứ 0 (trƣớc khi điều trị), ngày thứ 5, thứ 10, thứ 14 khi điều trị.
Bảng 2.2. Mô hình nghiên cứu khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì
(Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) Lô Chế độ ăn
trƣớc điều trị Tiêm Mục đích
1 Thức ăn chuẩn Uống nƣớc cất, không điều trị. 2 Thức ăn béo STZ Uống nƣớc cất, không điều trị.
3 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn ethanol (2000 mg/kg). 4 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn n- hexan
(2000 mg/kg).
5 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn ethylacetate (2000 mg/kg).
22
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn từ thân cây Ngũ gia bì
Để tìm hiểu thành phần hóa học của thân cây Ngũ gia bì, chúng tôi tiến hành chiết nhƣ đã mô tả ở phần phƣơng pháp thu đƣợc cao ethanol. Sau đó tiếp tục chiết với dung môi có độ phân cực tăng dần : n- hexan và ethylacetat. Kết quả đƣợc trình bày trên sơ đồ 3.1 và bảng 3.1.
Hình 3.1. Quy trình chiết suất các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì
Với quy trình chiết rút nhƣ trên, chúng tôi thu đƣợc hiệu suất chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ 3 kg thân cây Ngũ gia bì nhƣ bảng 3.1.
Bã sau khi chiết bằng n - hexan 50.2 g Cao n - hexan
Chiết bằng n - hexan
Bã sau khi chiết bằng ethylacetate 42.5 g Cao ethylacetate
150 g Cao ethanol Bã sau khi chiết bằng ethanol Chiết ethanol 3 lần 3000 g thân cây Ngũ gia bì
23
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết rút các phân đoạn từ thân cây Ngũ gia bì
Phân đoạn Số mẫu thu được (g)
Hiệu suất chiết rút (% nguyên liệu khô)*
Cao ethanol 150 5
Cao n – hexan 50.2 1.67
Cao ethylacetate 42.5 1.42
(* Tính theo nguyên liệu khô ban đầu)
Hiệu suất chiết rút cao nhất là ở phân đoạn cao ethanol (5%) so với khối lƣợng nguyên liệu khô ban đầu là 150g, tiếp đến là ở cao phân đoạn n- hexan (1.67%), thấp nhất là cao phân đoạn ethyacetate (1.42%). Kết quả này cho thấy trong thân cây Ngũ gia bì có chứa một lƣợng lớn các hợp chất tự nhiên. Trong đó hàm lƣợng các hợp chất phenolic chiếm tỷ lệ khá cao. Điều này đƣợc chứng minh ở kết quả xét nghiệm định tính và định lƣợng.
3.2. Kết quả khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong các phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì
Nhằm góp phần đánh giá thành phần các hợp chất tự nhiên cơ bản có trong cao các phân đoạn từ dịch chiết thân cây Ngũ gia bì, chúng tôi tiến hành các phản ứng định tính, định lƣợng.
3.2.1. Định tính một số hợp chất tự nhiên có trong thân cây Ngũ gia bì (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sử dụng các thuốc thử đặc trƣng cho từng nhóm hợp chất tự nhiên, chúng tôi thu đƣợc kết quả trình bày trong bảng 3.2.
24
Bảng 3.2. Kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì
Chú thích:
(-) : Không phản ứng (++) : Phản ứng mạnh
(+) : Phản ứng (+++) : Phản ứng rất mạnh Kết quả định tính cho thấy thành phần các hợp chất tự nhiên trong thân cây Ngũ gia bì khá phong phú bao gồm: Flavonoid, tannin, glycoside và alkaloid. Cao của cả 3 phân đoạn EtOH, n-hexan, EtOAc đều chứa các thành phần này nhƣng với hàm lƣợng khác nhau. Các phân đoạn EtOH, n-hexan, EtOAc có chứa thành phần hợp chất tự nhiên khá giống nhau: chứa nhiều alkaloid, polyphenol; không chứa catechin. Từ bảng 3.2 ta thấy ở phân đoạn
Nhóm chất Thuốc thử
Mẫu Cao ethanol Cao
n-hexan EtOAc Flavonoid Shinoda + + + Diazo + + + H2SO4 đặc + + ++ Catechin Vanilin/HCl (đ) - - - Tannin Vanilin - - - Gelatin/NaCl + + + Acetat chì + ++ + Polyphenol khác NaOH 10% + + ++ FeCl3 5% +++ +++ ++ Glycoside Keller-killian + ++ + Alkaloid Mayen + + + Dragendroff + ++ ++ Bouchardat +++ ++ ++
25
cao cồn tổng số, phân đoạn cao n-hexan và cao etylacetate chứa rất nhiều polyphenol và mức phản ứng mạnh và rất mạnh, chứng tỏ là hợp chất có hoạt tính sinh học cao, có khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn ... Kết quả định tính này giúp chúng tôi có những định hƣớng để tiếp tục nghiên cứu ở mức độ cao hơn.
3.2.2. Định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết
Chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết bằng phƣơng pháp Folin - Ciocalteau.
3.2.2.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic
Đƣờng chuẩn acid gallic đƣợc xây dựng bằng cách chuẩn bị các dung dịch acid gallic ở các nồng độ 50, 100, 150, 250, 500mg/l, tiến hành trên máy ERMA ở bƣớc sóng 765nm. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.2.
Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn acid gallic
TT acid gallic (mg/l) OD (765nm) 1 0 0.009 2 50 0.062 3 100 0.119 4 150 0.168 5 250 0.265 6 500 0.519
26
Hình 3.2 : Đồ thị đƣờng chuẩn acid gallic
3.2.2.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Bảng 3.4. Định lƣợng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì
Mẫu OD765nm Hàm lƣợng polyphenol (mg/l) Tỷ lệ (%) polyphenol Cao EtOH 0.04 27.2 0.272 Cao n-hexan 0.67 657.2 6.572 Cao EtOAc 0.22 207.2 2.072
Bảng định lƣợng 3.4 cho thấy rằng, hàm lƣợng polyphenol tổng số trong cao phân đoạn n-hexan là cao nhất (6.572%), sau đó đến phân đoạn cao EtOAc (2.072%). Đối với phân đoạn EtOH hàm lƣợng polyphenol thấp nhất (0.272%).
Kết quả đó chỉ ra rằng, thành phần hóa học trong thân cây Ngũ gia bì có chứa nhiều hợp chất có khả năng tan tốt trong cao n-hexan và cao ethylacetate. Điều này phù hợp với tính chất vật lý và sự phân cực của phân tử polyphenol, chúng tan tốt trong dung môi phân cực và ít tan trong dung môi không phân cực. Chính vì polyphenol là những hợp chất hữu cơ có hoạt tính
y = 0.001x + 0.0128 R2 = 0.9997 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 400 500 600 axit gallic (m g/L) O D 7 6 5 n m
27
sinh học cao nên chúng tôi quyết định chọn các phân đoạn ethanol, ethylacetate, n- hexan vào điều trị cho chuột gây béo phì và ĐTĐ.
3.3. Kết quả xác định liều độc cấp
Xác định LD50 của dịch chiết tổng số từ thân cây Ngũ gia bì trên chuột nhắt trắng bằng đƣờng uống theo phƣơng pháp của Lorke [18]. Chuột cho nhịn đói trƣớc 16 giờ thí nghiệm, đƣợc phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 5 con và đƣợc cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg thể trọng. Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết thân cây Ngũ gia bì.
Bảng 3.5. Kết quả thử độc tính cấp theo đƣờng uống (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết
6500mg/kg 10 0 0%
7000mg/kg 10 0 0%
7500mg/kg 10 0 0%
8000mg/kg 10 0 0%
Sau 72 giờ theo dõi với các liều 6500, 7000, 7500 mg/kg thể trọng thấy không có con chuột nào chết. Đến liều cao nhất 8000mg/kg thể trọng cũng không có con nào chết, vì vậy chƣa tính đƣợc LD50, nghĩa là có thể kết luận các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì hoàn toàn không độc dù ở liều rất cao theo đƣờng uống.
3.4. Kết quả mô hình chuột béo phì thực nghiệm
Chuột nhắt trắng (Muss musculus) chủng Swiss (khối lƣợng ban đầu là 14 – 17 g) đƣợc chia làm 8 lô.
Lô 1: cho ăn chế độ bình thƣờng (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng).
28
Sau 8 tuần nuôi theo chế độ trên, chúng tôi tiến hành cân trọng lƣợng chuột. Kết quả sự thay đổi trọng lƣợng của chuột thí nghiệm đƣợc thể hiện ở bảng 3.6 và hình 3.3.
Bảng 3.6. Trọng lƣợng trung bình (tính theo gam) của hai nhóm chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dƣỡng khác nhau
Nhóm Nhóm ăn thƣờng Nhóm ăn béo
Ban đầu 14.65 ± 0.50 14.65 ± 0.50 Tuần 1 17.59 ± 0.67 21.57 ± 1.02 Tuần 2 20.21 ± 1.02 30.78 ± 1.91 Tuần 3 24.78 ± 0.91 36.43 ± 2.30 Tuần 4 28.42 ± 1.01 40.27 ± 2.73 Tuấn 5 33.58 ± 1.80 45.82 ± 3.05 Tuần 6 38.77 ± 1.08 50.23 ± 3.12 Tuần 7 41.20 ± 1.40 55.10 ± 4.68 Tuần 8 44.45 ± 1.24 59.92 ± 5.74
(Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình của các lô chuột; (*): p < 0.05 so sánh với nhóm ăn thường)
29
Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn sự tăng trọng của các nhóm chuột với 2 chế độ dinh dưỡng khác nhau trong vòng 8 tuần
Bảng 3.6 và hình 3.3 đã cho thấy, chuột đƣợc nuôi theo chế độ ăn có hàm lƣợng lipid và cholesterol cao (ăn béo - HFD) có khả năng tăng về trọng lƣợng lớn hơn rất nhiều so với chuột ăn thức ăn thƣờng (ND) và sự sai khác này là có ý nghĩa p < 0.05. Cụ thể là sau 8 tuần nuôi, chuột nuôi với thức ăn thƣờng trọng lƣợng cơ thể chỉ tăng thêm 29.8 g ứng với 203.41% so với ban đầu, trong khi chuột nuôi với thức ăn có hàm lƣợng lipid và cholesterol cao trọng lƣợng cơ thể tăng thêm 45.27 g ứng với 309.01% so với ban đầu. Nhƣ vậy, chuột ăn thức ăn có hàm lƣợng lipid và cholesterol cao đã tăng trọng hơn so với chuột ăn thức ăn thƣờng là 15.47g hay gấp 1.52 lần
Để đánh giá ảnh hƣởng của chế độ nuôi béo đến một số chỉ số lipid trong huyết thanh của chuột vào ngày cuối cùng của thời gian nuôi béo sau khi cho nhịn đói qua đêm, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số hoá sinh. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.7 và hình 3.4 sau đây.
0 10 20 30 40 50 60
Ban đầu Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6 Tuần 7 Tuần 8 14.56 17.59 20.21 24.78 28.42 33.58 38.77 41.2 44.45 14.56 21.57 30.78 36.43 40.27 45.82 50.23 55.1 59.92 Nhóm ăn thường Nhóm ăn béo
30
Bảng 3.7. So sánh một số chỉ số hóa sinh máu giữa chuột nuôi thƣờng và nuôi béo phì thực nghiệm
Các chỉ số lipid (mmol/l) TC TG HDL-c LDL-c Glucose Nhóm ăn thƣờng 3.7 ± 0.22 1.15 ± 0.15 2.7 ± 0.17 0.5 ± 0.10 6.52 ± 0.20 Nhóm ăn béo 5.2* ± 0.1 2.3* ± 0.43 1.8* ± 0.2 0.9* ± 0.26 9.51* ± 0.42 So sánh lô béo/ thƣờng 1.41 lần 2 lần 1.5 lần 1.8 lần 1.46 lần
(Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình của 10 con chuột;
(*): p < 0.05 khi so sánh với nhóm ăn thường; trong đó (-) sự giảm,(+) sự tăng)
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh một số chỉ số hóa sinh giữa các lô chuột thí nghiệm
Từ bảng số liệu bảng 3.7 và hình 3.4 cho thấy các chỉ số hóa sinh đã có sự khác biệt rất lớn giữa lô nuôi thƣờng và lô nuôi béo. Cụ thể, ở nhóm chuột
0 2 4 6 8 10 TC TG HDL-C LDL-C Glucose 3.7 1.15 2.7 0.5 6.52 5.2 2.3 1.8 0.9 9.51
31 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
cho ăn thức ăn béo trong 8 tuần, hàm lƣợng cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL-c trong huyết thanh đều cao hơn một cách có ý nghĩa (p<0.05) so với nhóm ăn bằng thức ăn thƣờng. Hàm lƣợng cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL-c, Glucose trong huyết thanh của nhóm chuột nuôi béo tƣơng ứng tăng gấp 1.08, 1.03, 1.8, 1.46 lần so với nhóm chuột nuôi bằng thức ăn thƣờng. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với qui luật thực tế và với nghiên cứu của Srinivasan và cộng sự [19]. Điều đó chứng tỏ chuột ăn các thức ăn có hàm lƣợng lipid cao thời gian dài rất dễ rối loạn trao đổi lipid và glucid.
Kết quả trên có thể giải thích là do chuột đƣợc ăn thức ăn có thành phần giàu lipid (32%) và cholesterol (1%) nên các chỉ số triglycerid và cholesterol toàn phần trong máu tăng chủ yếu là do thu nhận từ quá trình tiêu hoá. Cholesterol tuy cần thiết cho cơ thể vì nó là hợp phần cấu tạo của màng tế bào, của các mô thần kinh, các hormon steroid và quá trình tổng hợp vitamin D, nhƣng khi cholesterol máu tăng cao quá mức lại trở nên có hại cho cơ thể vì khi đó nó trở thành nguyên nhân gây ra nhiều bệnh nguy hiểm nhƣ xơ vữa động mạch, bệnh lý tim mạch…,[1] là những bệnh lý thƣờng gặp ở bệnh nhân béo phì.
Triglycerid hay mỡ trung tính là thành phần chủ yếu của dầu, mỡ động thực vật, không tan trong máu nên đƣợc vận chuyển dƣới dạng các hạt lipoprotein nhƣ chylomicron, VLDL đến trao đổi với các mô. Tế bào của mô hấp thụ triglycerid và tiêu dùng theo nhu cầu, khi dƣ thừa nó tích tụ trong tế bào và trở thành dạng năng lƣợng dự trữ trong các mô mỡ. Trong thời gian dài chuột luôn có chế độ ăn dƣ thừa triglycerid nên không những trọng lƣợng tăng mà hàm lƣợng triglycerid trong máu cũng ứ đọng rất cao.
Đáng chú ý là sự biến thiên hai chỉ số HDL-c và LDL-c. HDL-c và LDL-c là hai dạng lipoprotein có thành phần giàu cholesterol (lần lƣợt chứa 18% và gần 70%) tham gia vào quá trình trao đổi cholesterol của cơ thể theo hai chiều ngƣợc nhau. HDL đƣợc mệnh danh là “lipoprotein tốt” vì hoạt động
32
chính của nó là vận chuyển cholesterol dƣ thừa từ tế bào ngoại vi về gan để đào thải qua đƣờng mật. Trái lại LDL là “lipoprotein xấu” vì nó vận chuyển cholesterol đến mô để tổng hợp steroid, nó rất dễ bị oxy hoá tạo các hạt LDL với kích thƣớc lớn và tỷ trọng thấp - tác nhân gây xơ vữa và làm tắc nghẽn động mạch ở ngƣời béo phì, dễ gây nhồi máu cơ tim và đột tử khi gây tắc mạch máu não.
Nhƣ vậy với các dẫn liệu trọng lƣợng cơ thể, các chỉ số mỡ máu tăng cao bất thƣờng ở chuột cũng những hiểu biết về quá trình chuyển hoá trên, chúng tôi có thể kết luận rằng mô hình gây chuột béo phì bằng các chế độ ăn giàu chất béo đã thành công. Chuột béo phì đƣợc tiếp tục sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.5. Tác dụng của một số phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì lên chuột béo phì thực nghiệm chuột béo phì thực nghiệm
Tác dụng giảm khối lƣợng cơ thể
Sau khi gây mô hình chuột béo phì thực nghiệm thành công, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng giảm khối lƣợng chuột đái tháo đƣờng của các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì.
Chuột BP đƣợc uống các cao phân đoạn dịch chiết với liều lƣợng 2000mg/kg thể trọng vào mỗi sáng hàng ngày. Quá trình điều trị kéo dài 14 ngày, trong thời gian này chuột đƣợc cung cấp thức ăn và nƣớc uống bình thƣờng. Kết quả thể hiện ở biểu đồ hình 3.5.
33
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh khối lƣợng của các lô chuột đái tháo đƣờng trƣớc và sau khi điều trị
Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy:
Sau 14 ngày, chuột đái tháo đƣờng không điều trị nặng 61g tăng 5.17%, chuột nuôi thƣờng là 48 g tăng 8.11% so với thời điểm ban đầu, song các mức tăng này không có ý nghĩa (p > 0.05).
Các lô chuột gây đái tháo đƣờng đƣợc điều trị thì trọng lƣợng đều giảm sau 14 ngày. Với phân đoạn cồn thì trọng lƣợng giảm 34.53%, các phân đoạn n-hexan và EtOAc thì lần lƣợt là 32.64% và 37.92%.
3.6. Tác dụng hạ glucose huyết của thân cây Ngũ gia bì trên mô hình chuột đái tháo đƣờng type 2 chuột đái tháo đƣờng type 2
3.6.1. Kết quả tạo mô hình chuột đái tháo đường type 2 thực nghiệm
Với nguyên tắc kết hợp giữa chế độ ăn béo trong thời gian dài và tiêm màng bụng STZ (pha trong đệm Citrat 0,01M, pH 4,5) với liều đơn 110 mg/kg thể trọng, chúng tôi đã thành công trong việc gây ĐTĐ type 2 thực nghiệm. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.8 và có so sánh với các lô chuột chỉ ăn thƣờng tiêm STZ, chuột thƣờng và chuột béo phì không tiêm.
0 10 20 30 40 50 60 70
Nuôi thường ĐTĐ không
ĐT EtOH n-Hexan EtOAc
44.4 58 59.92 57.22 58.12 46.5 60 52.02 50.02 49.43 48 61 44.54 43.14 42.14
34
Bảng 3.8. Nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột trƣớc và sau khi