Nghiên cứu quá trình chiết và khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của dịch chiết từ cây sả (cymbopogon citratus stapf)

Trong đó cây Sả Chanh là nguyên liệu phổ biến đang được nghiên cứu, cây Sả Chanh không chỉ đơn thuần là gia vị trong cuộc sống hằng ngày mà còn được xem là cây thuốc quý có tác dụng chữa

GVHD: ThS TRẦN THỊ HUYỀN

ThS NGUYỄN THỊ HẢI THANH

KHÁNH HÒA -07/ 2015

LỜI CAM ĐOAN

Sinh viên: Phạm Ngọc Mỹ Dung

Nơi đào tạo: Trường Đại học Nha Trang

Khoa: Công nghệ Thực Phẩm

Chuyên ngành: Chế Biến thủy sản

Giáo viên hướng dẫn: ThS Trần Thị Huyền, Ths Nguyễn Thị Thanh Hải Tên đồ án tốt nghiệp:

“Nghiên cứu quá trình chiết và khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của

dịch chiết từ cây Sả (Cymbopogon citratus Stapf)”

Nội dung cam đoan:

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của

cô Trần Thị Huyền và cô Nguyễn Thị Thanh Hải, cùng với sự giúp đỡ của tập thể cán

bộ Trung tâm TNTH Trường Đại học Nha Trang Các số liệu và kết quả nêu trong đồ

án là trung thực và chưa từng được công bố

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên

Nha Trang, ngày 20 tháng 6 năm 2015

Sinh viên

Phạm Ngọc Mỹ Dung

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG viii

LỜI CẢM ƠN ix

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về cây Sả Chanh 3

1.1.1 Phân lọai học 3

1.1.3 Phân bố và điều kiện trồng trọt 5

1.1.3.1 Phân bố 5

1.1.3.2 Điều kiện trồng trọt 6

1.1.4 Thành phần hóa học của tinh dầu Sả Chanh 6

1.1.5.Công dụng của cây Sả Chanh 9

1.2 Giới thiệu về chất kháng khuẩn từ thực vật 10

1.2.1 Giới thiệu chất kháng khuẩn thực vật 10

1.2.2 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Sả Chanh 12

1.2.3 Cơ chế kháng khuẩn 14

1.3 Giới thiệu các phương pháp ly trích tinh dầu Sả Chanh 14

1.3.1 Phương pháp dùng dung môi ngâm chiết 14

1.3.2 Phương pháp lôi cuốn hơi nước 15

1.3.3 Phương pháp chiết hồi lưu (soxhlet) 15

1.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết 16

1.4.1 Dung môi 16

1.4.2 Nhiệt độ chiết 16

1.4.3 Thời gian chiết xuất 17

1.4.4 Độ mịn của nguyên liệu 17

1.4.5 Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 18

1.5 Nghiên cứu trong và ngoài nước về cây Sả Chanh 18

1.5.1 Nghiên cứu trong nước 18

1.5.2 Nghiên cứu ngoài nước 19

1.6 Giới thiệu về các chủng vi sinh vật 20

1.6.1 Escherichia coli 20

1.6.1.1 Phân loại E coli 21

1.6.1.2 Đặc điểm hình thái của E coli 21

1.6.1.3 Tính chất nuôi cấy 21

1.6.1.4 Khả năng gây bệnh của E coli 22

1.6.2 Staphylococcus aureus 22

1.6.2.1 Phân loại Staphylcoccus aureus 22

1.6.2.2 Đặc điểm hình thái của S.aureus 23

1.6.2.3 Tính chất nuôi cấy 23

1.6.2.4 Khả năng gây bệnh của S.aureus 24

1.6.3 Salmonella 24

1.6.3.1 Đặc điểm hình thái của Salmonella 24

1.6.3.2 Tính chất nuôi cấy 25

1.6.3.3 Khả năng gây bệnh của Salmonella 26

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 27

2.2 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 27

2.3 Nội dung nghiên cứu 29

2.4 Phương pháp nghiên cứu 29

2.4.1 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu 29

2.4.2 Bố trí thí nghiệm 30

2.4.2.1 Lập sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30

2.4.2.2 Thí nghiệm 1: khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến

khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Sả 32

2.4.2.3 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Sả 34

2.4.2.4 Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Sả 36

2.4.2.5 Thí nghiệm 4: khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Sả 38

2.4.2.6 Thí nghiệm 5: khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết sả 40

2.5 Phương pháp phân tích 41

2.5.1 Phương pháp cấy ria vi khuẩn, pha loãng vi khuẩn 41

2.5.2 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch 41

2.5.3 Phương pháp phân tích, xử lý số liệu 41

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 Ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết sả 42

3.2 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Sả 44

3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Sả 49

3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Sả 53

3.5 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Sả 56

3.6 Đề xuất quy trình chiết tinh dầu Sả hoàn chỉnh 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

1 Kết luận: 60

2 Kiến nghị: 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHỤ LỤC 64

NA: Nutrient agar

NL/DM: Nguyên liệu/dung môi

PL: phụ lục

TN: thí nghiệm

µl: microlit

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cây Sả Chanh (Cymbopogon citratus stapf) 4

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử citral 13

Hình 1.3 Vi khuẩn E coli 21

Hình 1.4 Vi khuẩn S.aureus 23

Hình 1.5 Vi khuẩn Salmonella 25

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ Sả Chanh 32

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ Sả Chanh 34

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Sả Chanh 36

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Sả Chanh 38

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ Sả Chanh 40

Hình 3.1 Hình ảnh đường kính vòng tan thu được của dịch chiết Sả chiết bằng ba dung môi (1) nước; (2) ethanol; (3) aceton trên một số vi khuẩn chỉ thị: a)E coli.b) S aureus.c)Salmonella 43

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Sả lên các vi khuẩn chỉ thị 45

Hình 3.3 Hình ảnh đường kính vòng tan thu được của dịch chiết Sả chiết bằng bốn nồng độ dung môi chiết(1) ethanol 60%, (2) ethanol 70%, (3) ethanol 80%, (4) ethanol 90% trên một số vi khuẩn chỉ thị: a)E coli.b) S aureus c)Salmonella 46

Hình 3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ NL/DM đếnhoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Sả lên các vi khuẩn chỉ thị 49

Hình 3.5 Hình hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Sả chiết bằng bốn tỉ lệ NL/DM chiết (1) 1/5, (2) 1/10, (3) 1/15, (4) 1/20 trên một số vi khuẩn chỉ thị :

a)E coli.b)S aureus.c)Salmonella 50

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đếnhoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Sả lên các vi khuẩn chỉ thị 53 Hình 3.7 Hình hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Sả chiết bằng bốn nhiệt độ chiết (1) 300C, (2) 350C, (3) 400C, (4) 450C trên một số vi khuẩn chỉ thị: a)E

coli b)S aureus c) Salmonella 54

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Sả lên các vi khuẩn chỉ thị 56 Hình 3.9 Hình hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Sả chiết bằng bốn thời gian

chiết 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ trên một số vi khuẩn chỉ thị: a) E coli b)S

aureus c) Salmonella 57

Hình 3.10 Sơ đồ quy trình chiết tinh dầu Sả hoàn chỉnh 59

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của tinh dầu SảC.citratus và Sả C.nadus từ Togo 7

Bảng 1.2 Thành phần các chất cấu tạo nên thành tế bào vi khuẩn 14 Bảng 3.1 Bảng đường kính vòng tan thể hiện hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Sả với ba loại dung môi nước, ethanol, aceton lên các loại vi sinh vật chỉ thị 42

LỜI CẢM ƠN

Bốn năm là khoảng thời gian em được ngồi trên ghế nhà trường, được trau dồi những kiến thức mới mà chính những kiến thức ấy đã giúp em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp của mình, bên cạnh đó sẽ là những kinh nghiệm vô cùng quý báu, một nền tảng vững chắc cho em bước đi trên con đường đời đầy chông gai phía trước

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, các quý Thầy, Cô Bộ môn Công nghệ Chế biến Thủy sản Khoa Công nghệ Thực phẩm đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu và bổ ích

Sự biết ơn sâu sắc nhất em xin gửi đến cô Ths Trần Thị Huyền, cô Ths Nguyễn

Thị Thanh Hải đã tận tình hướng dẫn và động viên em trong suốt quá trình em làm

Xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày….tháng….năm 2015

LỜI MỞ ĐẦU

Hiện nay, xã hội ngày càng phát triển cũng như nhận thức của con người về thực phẩm ngày càng cao, thực phẩm không chỉ tươi ngon mà còn phải an toàn Song, các loại vi sinh vật chính là nguyên nhân chính gây nên hiện tượng hư hỏng và làm giảm chất lượng của thực phẩm Để kéo dài thời gian bảo quản các nhà sản xuất đã

sử dụng chất bảo quản hóa học, tuy những chất này có khả năng ức chế họat động của

vi sinh vật nhưng lại không đảm bảo an toàn cho người sử dụng

Chính vì thế, để tìm ra các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ các cây thảo dược tự nhiên vừa bảo quản được thực phẩm vừa đảm bảo an toàn là một vấn đề cấp thiết Trong đó cây Sả Chanh là nguyên liệu phổ biến đang được nghiên cứu, cây Sả Chanh không chỉ đơn thuần là gia vị trong cuộc sống hằng ngày mà còn được xem là cây thuốc quý có tác dụng chữa các bệnh về nhiễm khuẩn, ngăn ngừa bệnh ung thư, đặc biệt dịch chiết từ cây Sả Chanh có tác dụng kháng khuẩn rất tốt đối với vi khuẩn

staphylococcus aureus, Escherichia coli, nấm Aspergillus niger…

Tuy nhiên, việc nghiên cứu về đặc tính kháng khuẩn của cây Sả Chanh chưa

được quan tâm nhiều ở Việt Nam Vì vậy, em chọn đề tài “ Nghiên cứu quá trình chiết và khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của dịch chiết từ cây Sả(Cymbopogon Citratus Stapf)” nhằm đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch

chiết từ cây Sả, góp phần nâng cao giá trị sử dụng của cây Sả Chanh tại Việt Nam cũng như trên toàn Thế Giới

Mục tiêu của đề tài: khảo sát ảnh hưởng của chế độ chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Sả

Nội dung của đề tài:

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Sả

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Sả

Ý nghĩa khoa học: đề tài cung cấp dữ liệu khoa học có ý nghĩa tham khảo về

sự ảnh hưởng của dung môi chiết, thời gian và nhiệt độ chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Sả

Ý nghĩa thực tiễn: đề tài chỉ mới được nghiên cứu với quy mô tại phòng thí nghiệm, dựa trên kết quả khảo sát của đề tài, các nhà sản xuất có thể mở rộng phạm

vi sử dụng dịch chiết từ cây Sả trong Công nghệ Chế biến Thực phẩm giúp tạo ra sản phẩm thực phẩm đáp ứng yêu cầu của người tiêu dùng

LOÀICymbopogon citratus Stapf

Họ Hòa thảo hay họ Lúa hoặc họ Cỏ ("cỏ" thực thụ) là một họ thực vật một lá mầm (lớp Liliopsida), với danh pháp khoa học là Poaceae, còn được biết dưới danh

pháp khác là Gramineae Trong họ này có khoảng 668 chi và khoảng 10.035 loài cỏ

Người ta ước tính rằng các đồng cỏ chiếm khoảng 20% toàn bộ thảm thực vật trên Trái Đất Họ này là họ thực vật quan trọng nhất đối với toàn bộ nền kinh tế của loài người, bao gồm cả các bãi cỏ và cỏ cho gia súc cũng như là nguồn lương thực chủ yếu (ngũ cốc) cho toàn thế giới, hay các loại tre, trúc được sử dụng rộng rãi ở châu Á trong xây dựng [23]

Tùy vào khí hậu của mỗi khu vực mà chi Sả được phân loại với nhiều loài có tên gọi khác nhau:

+ Cymbopogon casein (Sả lam, Sả hôi): phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Ả Rập,

Châu Phi và Việt Nam Ở nước ta mọc từ Lạng Sơn vào Quảng Trị, Thừa Thiên Huế

và Bình Định

+ Cymbopogon flexuosus (Sả dịu): cây cỏ cao 2 - 2,5mét, lá dài 70 –

90centimet (cm), rộng 1 cm, lưỡi bẹ cao 6 – 7milimet (mm) Phân bố ở Ấn Độ, Myanma, Thái Lan, Indonexia Sả dịu được trồng làm nguyên liệu để lấy tinh dầu, làm hương liệu trong ngành thực phẩm, làm thuốc trừ ruồi, muỗi

+ Cymbopogon matinii (Sả hoa hồng, Sả hồng): cây thảo sống nhiều năm thân

rễ ngắn Thân cao trung bình từ 1,2 - 1,8 mét Cây trưởng thành có từ10 - 20 đốt, lóng dài 10 – 13cm, rộng 3mm Phiến lá có gốc hình tim hay tròn, dài 10 – 15cm Phân bố chủ yếu ở Ấn Độ, người ta dung tinh dầu Sả hồng thay cho tinh dầu Hoa hồng trong việc chế tạo xà phòng thơm và dung làm hương liệu[6]

+ Cymbopogon winterianus (Sả Java): có nguồn gốc từ Nam Ấn Độ, được sản

xuất để lấy tinh dầu có tên thương phẩm là Citronela oil, thành phần chính của tinh dầu là geraniol (85 - 90%), citronella (35 - 40%), được dùng làm thuốc chống côn trùng[18]

+ Cymbopogon nadus (Sả Sri Lanka): có nguồn gốc từ Sri Lanka, cho tinh

dầu có tính chất và thành phần hóa học giống Sả Java nhưng chất lượng kém hơn

+ Cymbopogon pendulus (Sả tía hay Sả Jammu): được trồng để sản xuất tinh

dầu Sả Jammu với tên thương phẩm là Jammu lemongrass oil

+ Cymbopogon citratus Stapf (Sả Chanh): được trồng để sản xuất tinh dầu có

tên thương phẩm là West Indian Lemongrass oil, thành phần chính chứa hàm lượng citral cao (80 - 90%) [18]

1.1.2 Đặcđiểm hình thái của cây SảChanh

Hình 1.1.Cây Sả Chanh (Cymbopogon citratus stapf)

Cây Sả Chanh (Cymbopogon citratus stapf) là loại cây nhiệt đới, sống lâu

năm, mọc thành bụi, cao từ 0,8 -1,5 mét (m) Thân rễ trắng hay hơi tím Lá hẹp dài giống như lá lúa, dài tới 1 m hay hơn, có bẹ, mép hơi nhám Toàn cây có mùi thơm đặc biệt mùi chanh Thân rễ trắng hoặc hơi tím Cây Sả Chanh được trồng bằng cách

tách tép Sả từ những cây mẹ có độ tuổi từ 1-2 năm Hàm lượng tinh dầu trong lá Sả khoảng 0,25 – 0,30% Cây Sả Chanh có nguồn gốc từ Ấn Độ và được dùng làm cây gia vị quý, phổ biến Hiện nay Sả còn được dùng làm dược phẩm và mỹ phẩm

Cụm hoa to dài đến 60cm, có 4 - 9 đốt, gồm nhiều bông nhỏ nhưng ít gặp, chùm tụ, tán thưa, có mo, gié hoa dẹp

Giá trị sử dụng chính của cây Sả Chanh đó là hàm lượng tinh dầu trong cây Các bộ phận như lá, thân, hoa, rễ chứa hàm lượng tinh dầu khác nhau, tập trung chủ yếu tại phần thân cây 5 – 7 cm tính từ rễ lên thân

Một số bài báo khoa học nghiên cứu vềcác thành phần hóa học trong tinh dầu

Sả cóhoạt tính sinh học và do đó có thể được sử dụng trong điều trị một số bệnh bao gồm ung thư, và trong các ứng dụng có tầm quan trọng đặc biệt là công nghiệp đóng gói thực phẩm Các hợp chất citral, geraniol, citronellol, citronellal và piperitone, đã được biết là có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, diệt côn trùng, thuốc chống côn trùng trong một thời gian dài[18]

1.1.3 Phân bố và điều kiện trồng trọt

1.1.3.1 Phân bố

Sả Chanh được trồng nhiều ở các nước Nam Mỹ như Achentina, Braxin, Hoduras, Guatemala, Liên Bang Nga, Bắc Australia, Ấn Độ, Banglades, Việt Nam

và các nước Đông Nam Á khác

Ở các tỉnh phía Nam như miền Đông Nam Bộ, Tây Nguyên, v.v…Ở Việt Nam

Sả Chanh được trồng khắp cả nước, một số vùng đồi núi đã được quy hoạch trồng cây Sả để làm nguyên liệu chưng cất tinh dầu Tinh dầu sả là một mặt hàng xuất khẩu

có giá trị và là nguyên liệu được dùng trong kỹ nghệ mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm Sả cho một loại tinh dầu chứa nhiều thành phần khác nhau Do đó, người ta chọn trồng những giống Sả đáp ứng mục đích sử dụng của tinh dầu Các loài Sả chanh

thuộc chi Cymbopogon thích ứng rộng với điều kiện sinh thái Sả Chanh được trồng

hầu hết ở khắp các tỉnh phía Bắc nước ta, tập trung ở một số nông trường như Việt Trung (Quảng Bình), Thạch Ngọc (Nghệ Tĩnh cũ), Cửu Long (Hà Sơn Bình cũ), Bắc Sơn (Bắc Thái cũ), v.v Sau năm 1975, cây Sả còn được nghiên cứu và trồng trọt

Sản lượng Sả thu được tại một số tỉnh trong nước:

Tại thôn Ba Bị, xã Hùng Tiến thuộc tỉnh Hòa Bình, mỗi năm 1 hecta (ha) Sả cho thu hoạch 3 vụ chính, năng suất đạt từ 12 – 14 tấn/ha, giá bán trung bình từ 7.000 – 8.000 đồng/kg

Tại xã Phú Tân thuộc tỉnh Tiền Giang một trong những xã tiên phong trong phong trào trồng sả với gần 150 ha trên nền đất lúa 1 vụ trước đây cho biết, với năng suất bình quân 17 - 20 tấn/ha/vụ và giá bán khoảng 3.000 đến 5.000 đồng/kg

1.1.3.2 Điều kiện trồng trọt

Sả là cây chịu hạn nhưng chịu ngập úng kém Khí hậu thích hợp đối với cây

Sả là 24 – 280C Cây Sả phát triển kém khi nhiệt độ dưới 100C Sả dễ trồng, không kén đất, thích nghi với nhiều loại điều kiện khí hậu Sả phát triển tốt ở nơi đất xốp, thô, có độ ẩm cao, chịu mát và ít nước, mỗi tháng chỉ 2-3 lần tưới

Cách trồng đem lại hiệu quả cao nhất là nên trồng hàng cách hàng 0,8m cây cách cây 0,7m Sau khi trồng từ 3 đến 4 tháng đã có thể thu hoạch Sả để ăn hoặc làm thuốc…

Theo như Koshima và các cộng sự (2006) đã nghiên cứu, thành phầncitral thiết yếu trong tinh dầu Sả thay đổi tùy thuộc vào tuổi của cây (6, 9, 12 và 15 tháng), và thành phần citral cao hơn tại6 và 15 tháng tuổi Kết quả tương tự cũng được quan sát thấy bởi Bezerra và các cộng sự (2008), người đã ghi nhận những thành phần hóa học trong tinh dầu thay đổi theo tuổi cây[22] Vậy nên tùy vào mụcđích sử dụng mà sẽ có thời gian thu hoạch hợp lý, nếu dùng Sả với mụcđích chế biến thì sau khi trồng 3 thángđã có thể thu hoạch, còn nếu dùng Sả đểđiều chế tinh dầu thì nên thu hoạch khi Sảđã trồng được 6 tháng trở lên

1.1.4 Thành phần hóa học của tinh dầu Sả Chanh

Các loại Sả khác nhau sẽ có thành phần hóa học khác nhau và hàm lượng tinh dầu cũng khác nhau, nhưng thường dao động từ 0,46 - 0,55% Trong thànhphần hóa học của tinh dầu Sả có rất nhiều nhóm hợp chất và thường có 2 nhóm chính:

Ancol:

+ Geraniol, (2,6-dimetil-2,6-octandien-8-ol)

+ Citronelal, (3,7-dimetil-6-octen-1-al), (d-Citronelal)

Bảng 1.1.Thành phần hóa học của tinh dầu Sả C.citratus và Sả C.nadus từ Togo [20]

Thành phần hóa học phụ thuộc vào các yếu tố sau:

+ Loài Sả: từ Bảng 1.1 thấy rằng, thành phần hóa học của tinh dầu Sả phụ thuộc vào loài Sả Một nghiên cứu đã cho ra kết quả như sau: mười chín hợp chất đã

được xác định trong mẫu dầu C citratus chiếm 99,8% trong hợp chất bao gồm

geranial (45,2%), neral (32,4%) và myrcene (10,6%) là thành phần chính Dầu này gồm hai hydrocarbon monoterpene (10,6%) và chín monoterpene oxy hóa (86,4%) Mẫu này xuất hiện tương tự như báo cáo trước đây về dầu chemotypes từ Togo (Koumaglo và cộng sự, 1996; Koba và cộng sự, 2003) Mười tám hợp chất đã được

xác định trong tinh dầu C.nardus chiếm 95,9% của các thành phần được phát hiện

bao gồm citronellal (35,5%), geraniol (27,9%) và citronellol (10,7%) là thành phần chính Dầu này bao gồm hai hydrocacbon monoterpene (1,9%) bảy monoterpene oxy hóa (79,0%), năm hydrocacbon sesquiterpene (12,3%) và bốn sesquiterpene oxy hóa

(2,6%) Thành phần này tương tự như báo cáo trước đây về dầuC.nardus từ Togo

(Koumaglo và cộng sự, 1996; Koba và cộng sự, 2003) [20]

+ Độ tuổi: Mint Innecco và các cộng sự (2003) đã quan sát thấy rằng tinh dầu tăng từ 80 đến 95 ngày sau khi trồng Đối với các thành phần chính, citral (geranial + neral), các cây Sả ở độ tuổi 6, 9 và 12 tháng cho thấy nồng độ citral cao hơn so với các cây Sả nhỏ tuổi hơn (3 tháng) Có lẽ tuổi của cây ảnh hưởng đến chất lượng của tinh dầu Sả[22]

+ Bộ phận khác nhau của cây Sả (thân, lá, hoa): một bài báo khoa họcđã nghiên cứu và chỉ ra đượcở các bộ phân khác nhau của cây Sả sẽ có thành phần hóa học khác

nhau, đối với loài SảC.martinii thì geraniol là thành phần chính (có 53,41% geraniol

trong tinh dầu chiết xuất từ lá và 69,63% geraniol trong tinh dầu chiết xuất từ hoa) [18].

1.1.5.Công dụng của cây Sả Chanh

Hiện nay, Sả Chanh và tinh dầu Sả Chanh được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực:

Trong thực phẩm: Sả được dùng để làm gia vị, ăn sống hay chế biến các món

ăn, ướp thịt, cá…Khi cho Sả vào làm gia vị, các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn trong Sả sẽ giúp cho món ăn lâu hư, bảo quản được lâu hơn Ngoài ra, Sả còn dùng

để nấu lấy nước uống, nước Sả có tác dụng ngừa ung thư, nó thúc đẩy các tế bào ung thư tự hủy diệt

Trong làm đẹp: Tinh dầu sả chứa chủ yếu hợp chất citral bao gồm neral và

geranial Theo nghiên cứu của các nhà khoa học, citral là một hoạt chất có khả năng tiêu diệt các tế bào ung thư trong cơ thể Nhờ đó các tế bào nang nuôi tóc sẽ được bảo

vệ khỏi nguy cơ bị tổn thương dẫn đến bệnh rụng tóc Xông hơi trị mụn làm trắng da với củ sả

Trong y học: Sả Chanh và tinh dầu Sả Chanh có công dụng chữa một số bệnh như:

+ Sả có vị cay, tính ấm có tác dụng làm ra mồ hôi, ấm bụng, giúp tiêu hoá, khỏi nôn, thông khí, sát trùng, khử uế, tiêu đờm Thường được chỉ định dùng điều trị các bệnh như đau đầu, đau bụng, ỉa chảy, thấp khớp, cầm máu, kinh nguyệt không đều, phù sau khi sinh Sả được sử dụng nhiều qua kinh nghiệm dân gian Lá Sả phối hợp với các loài cây có tinh dầu khác (Hương nhu, Húng chanh, Bưởi ) nấu nước dùng xông chữa cảm cúm, sốt Lá Sả dùng pha nước uống giải nhiệt và thông tiểu, tiêu thực

+ Phơi khô tán bột làm bột tiêu hoá (phối hợp với mạch nha), tẩy uế răng miệng, hôi nách (phối hợp với phèn phi) củ Sả nấu nước uống thông tiểu làm ra mồ hôi

+ Giảm đau: tinh dầu Sả được coi là một thuốc giảm đau làm giảm đau và chống viêm, giúp giảm đau ở cơ và khớp, cũng như đau răng và đau đầu do nhiễm virus như ho, cảm lạnh, cúm, sốt Nó cũng giúp chữa bệnh đau cơ thể mà hậuquả từ việchoạt động gắng sức

+ Sát trùng: Các đặc tính khử trùng của tinh dầu Sả được ứng dụng tốt cho các vết thương bên ngoài và nội bộ cũng như một thành phần của các loại kem khử trùng Các đặc tính khử trùng của dầu này làkhông để cho các vết cắt và vết thương bên ngoài và nội bộ trở nên tự hoại

+ Lợi tiểu: tinh dầu Sả tăng đi tiểu, cả về tần số và số lượng Điều này nghe có

vẻ không quan trọng nhưng nó có thể rất có lợi cho sức khỏe Khi một người đi tiểu, chất béo bị mất khỏi cơ thể, vì 4% khối lượng nước tiểu gồm các chất béo Rõ ràng, bạn càng đi tiểu nhiều, bạn càng mất chất béo Đi tiểu cũng thúc đẩy tiêu hóa và ức chế sự hình thành của khí dư thừa Nó loại bỏ nước dư thừa ra khỏi cơ thể và làm giảm sưng Đóng góp quan trọng nhất của nó là nó loại bỏ các độc tố khỏi cơ thể, không phải đề cập đến khả năng làm giảm huyết áp Đó là lý do mà hầu hết các loại thuốc dược phẩm cho hạ huyết áp gây đi tiểu thường xuyên Đi tiểu cũng giúp làm sạch thận

+ Theo một nghiên cứuđã nói rằng: tại Ấn Độ, Sả Chanh được sử dụng chữa cácvấn đề trong đường tiêu hóa (Alves và Souza, 1960) Ở những hòn đảo Mauricio vàở bán đảo Malay, người ta thường sử dụng trà từ Sả Chanh để chống lại bệnh cúm, sốt, viêm phổi, và để giải quyếtcác vấn đề dạ dày và bài tiết mồ hôi (Farmacologia, 1985).Tại Nigeria, nó được sử dụng như thuốc hạ sốt, nó cótác dụng chống co thắt (Olaniyi và cộng sự,1975) Tại Indonesia, Sả Chanh được chỉ định để chữa các bệnh vềtiêu hóa, thúc đẩy lợi tiểu, mồ hôi (Hirschorn, 1983) Tuy nhiên ở châu Phi vàChâu

Á, nó được coi như thuốc chữaho, sát trùng, giúpbài tiết mồ hôi, chống thấp khớp và điều trịđau lưng, bong gân và ho ra máu (Alves và Souza,1960) [21]

1.2 Giới thiệu về chất kháng khuẩn từ thực vật

1.2.1 Giới thiệu chất kháng khuẩn thực vật

Trong thiên nhiên, có rất nhiều cây cỏ có chất kháng sinh Nguồn dược liệu của nước ta vô cùng phong phú, trong đó có nhiều cây thuốc kháng sinh được Y học dân tộc dùng làm thuốc từ lâu Chúng thường là những cây cỏ rất quen thuộc, mọc hoang dại hoặc được trồng ngay trong vườn như: Hành, Tỏi, Hẹ, Kim ngân, Sâm đại hành, lá Móng tay,… được nhân dân ta dùng làm thuốc tiêu độc, tiêu viêm, sát khuẩn,

chữa các bệnh nhiễm khuẩn ngoài da, mụn nhọt, chốc lở, viêm họng, viêm phế quản

và nhiều bệnh nhiễm khuẩn khác Nhiều cây thuốc được nhân dân ta dùng chữa vết thương có kết quả tốt như Mỏ quạ, Nọc sởi, lá Vối, lá Bòng bong, Sắn thuyền, Lô hội, lá Trầu không, Sài đất…

Kinh nghiệm chữa bệnh của nhân dân ta rất quý Nhiều cây thuốc đã được các nhà khoa học nghiên cứu và tìm thấy những chất kháng sinh có tác dụng diệt nhiều

loại vi khuẩn như: dùng nước sắc lá Đơn tướng quân (tên khoa học là Syzygium sp.)

để chữa các chứng lở loét, mụn nhọt, mẩn ngứa, viêm họng, viêm phế quản… có kết quả tốt; dùng lá Trầu không chữa bỏng (giã nhỏ, vắt lấy nước bôi vào chỗ bỏng) hoặc dùng nước lá Trầu không rửa các vết thương thay thuốc sát khuẩn

Ưu điểm nổi bật của kháng sinh thực vật là rất ít độc, do đó không gây ra những tai biến nguy hiểm, nhiều khi chết người như thuốc kháng sinh tân dược Những tai biến do Penicillin, Streptomycin, Tetracyclin, … được y học nói đến nhiều, nhưng những tai biến do kháng sinh thực vật gây ra chưa thấy tài liệu nào nói đến Giới hạn an toàn về mặt độc chất của những kháng sinh thực vật lớn hơn kháng sinh tân dược nhiều

- Flavonoid: là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa Phần lớn có màu vàng (flavus có màu vàng) Tuy vậy, một số sắc tố

có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng được xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học chúng có cùng khung sườn

Các flavonoid thường dễ kết tinh và thường có màu Flavone có màu vàng nhạt hoặc màu cam; flavonol màu vàng nhạt đến màu vàng; chalone màu vàng đến cam

đỏ Các isoflavone, flavone, flavanonol, leucoantocyanidine và catechin kết tinh không màu Antocyanidine có màu đỏ, tím, xanh dương tạo màu cho nhiều loại hoa, trái

- Tinh dầu: tinh dầu trích ly từ thực vật có cấu trúc terpenoid Từ 2000 năm trước người ta đã biết sử dụng turpentine để trị ho Mentol là alcol terpen trích từ tinh dầu bạc hà có khả năng gây tê cục bộ, nên góp phần vào đặc tính trị ho của nó Các gia vị như: hồ tiêu, gừng, đinh hương, nhục đậu khấu bên cạnh mùi vị làm chúng có giá trị trong ngành thực phẩm, chúng còn có tác dụng kháng khuẩn Nhiều tinh dầu

có khả năng kháng khuẩn mạnh như tinh dầu rau ngổ Enhydra fluctuans; tinh dầu hồi

Illicium verum, tinh dầu quế Cinhamomum, tinh dầu long não Cinnamonium campo, tinh

dầu gừng Zingiber officinalist và tinh dầu nghệ Curcuma longa

- Saponin: là một loại glycosid phân bố khá rộng trong thực vật, có một số tính chất đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt, làm vỡ hồng cầu còn gọi là tính phá huyết Saponin thường

ở dạng vô định hình, có vị đắng Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy thường cao từ 2000C trở lên và có thể trên 3000C Saponin có thể bị kếttủa bởi acetat chì, hydroxid barium, sulfat amonium nên có thể lợi dụng tính chất này để cô lập saponin

Nhiều saponin steroid là nguyên liệu đầu để tổng hợp các chất hormon steroid

có hoạt tính cao Nhiều loại saponin có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn

1.2.2 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Sả Chanh

Trong dịch chiết Sả Chanh có chứa các thành phần kháng khuẩn chủ yếu sau: + Citral: là thành phần chính trong dịch chiết Sả, gồm hai đồng phân cis-citral (neral), trans-citral (geranial) Citral có khả năng kháng khuẩn rất mạnh có thể tiêu

diệt được cả vi khuẩn hiếu khí và kị khí như Staphylococcus aureus, Escherichia coli,

Salmonella… Geranial có hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn đồng phân neral nhưng

lại dễ bị oxy hóa và mất đi hoạt tính

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử Citral

+ Myrcene: myrcene có nhiều trong các loại tinh dầu thảo mộc như: sả, ớt, cà chua, xoài,… Trong dịch chiết Sả myrcene chiếm 10,2% Nếu citral trong dịch chiết

Sả có khả năng kháng các vi khuẩn gram dương, gram âm thì myrene không có khả năng kháng khuẩn, nhưng nó là tác nhân tăng cường hoạt động kháng khuẩn của citral khi trộn lại với nhau Myrcene kết hợp với terpineol thì hoạt tính rất mạnh, hỗn hợp này có thể kháng lại vi khuẩn Staphylococcus aureus rất tốt

+ Elemon: trong một bài báo nghiên cứu về thành phần hóa học tinh dầu Pơmu,

họ đã chỉ ra rằng trong tinh dầu Pơmu có chứa elemon đây là hợp chất có tác dụng đuổi muỗi, côn trùng, và có hoạt tính kháng khuẩn rất cao [4] Tương tự như vậy, trong tinh dầu Sả có chứa hợp chất elemon 0,6%, tuy chiếm hàm lương không cao nhưng cũng đã góp phần làm tăng hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Sả

+ Các hợp chất khác: ngoài ra trong dịch chiết Sả còn chứa rất nhiều thành phần hóa học khác như geraniol, citronellal, β-Elemene, Oxygenated sesquiterpene, β-Eudesmol…Đây cũng là những thành phần rất quan trọng góp phần trong việc tạo mùi thơm đặc trưng cho Sả, cũng như khả năng kháng một số vi sinh vật gây bệnh

+ Tinh dầu Sả có công dụng diệt côn trùng: một bài báo khoa học nói rằng, do tinh dầu có đặc tính dễ bay hơi, có mùi khó chịu, có thể gây độc cho côn trùng, tác động vào hệ thần kinh nội tiết và sinh sản của côn trùng, làm cho chúng chết đi [23]

+ Tinh dầu Sả có khả năng kháng nấm: một nghiên cứuđã nói về thành phần

hóa học và hoạt tính kháng nấm của tinh dầu SảC.naduscho kết quảCác hợp chất tích

cực nhất trong số 16 chất bay hơi được kiểm tra, bao gồm 6 thành phần chính của tinh dầu và 10 hợp chất monoterpene khác, trong đó có citronellal và linalool Citronellal và linalool ức chế hoàn toàn sự tăng trưởng của tất cả các chủng nấm thử nghiệm ở liều 112 mg / L [19]

1.2.3 Cơ chế kháng khuẩn

Cơ chế tác dụng chung của các chất có hoạt tính kháng khuẩn tương tự như cơ chế tác dụng của các chất kháng sinh, chúng có thể làm thay đổi tính thấm của màng

tế bào, ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn,

ức chế tổng hợp axit nhân, và ức chế chuyển hóa trong vi khuẩn Tùy vào tính chất kháng khuẩn của các chất này mà cơ chế tác dụng có thể là một hay tổng hợp của nhiều cơ chế trên và kết quả là làm suy yếu hoạt động sống của vi khuẩn, dẫn đến chết

Các chất có hoạt tính kháng khuẩn có tác động tương đối khác nhau trên vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương do cấu tạo thành tế bào của hai loại này khác nhau Thành phần chính của thành tế bào được chỉ ra trong Bảng 1.2

Bảng 1.2 Thành phần các chất cấu tạo nên thành tế bào vi khuẩn

Thành phần Tỷ lệ % đối với khối lượng khô của thành tế bào

Axit teicoic (Teichoic

Số liệu ở Bảng 1.2 cho thấy thành tế bào vi khuẩn gram dương chủ yếu cấu tạo bởi Peptidoglycan (chiếm 30-95%) và hàm lượng axit teicoic khá cao trong khi ở

vi khuẩn gram âm hàm lượng Peptidoglycan không lớn (chiếm 5-20%) nhưng nó lại

có một lượng protein cao và thêm thành phần lipit Tuy nhiên, so sánh về độ dày thì

vi khuẩn gram âm có thành tế bào mỏng hơn gram dương Hàm lượng Peptidoglycan trong vi khuẩn gram âm ít hơn nên thành tế bào vi khuẩn gram âm nhạy cảm với chất kháng khuẩn hơn

1.3 Giới thiệu các phương pháp ly trích tinh dầu Sả Chanh

1.3.1 Phương pháp dùng dung môi ngâm chiết

Phương pháp này sử dụng các dung môi như ethanol, aceton, nước để nhằm

tách tinh dầu Sả Chanh ra khỏi nguyên liệu

Cân một lượng nguyên liệu đã được xay nhỏ cho vào bình kín có nút đậy để tránh quá trình nguyên liệu bị oxy hóa, cho dung môi vào chiết trong khoảng thời gian nhất định, thường xuyên lắc đều để dung môi tiếp xúc với nguyên liệu nhiều hơn, hiệu quả chiết sẽ tốt hơn Sau đó lọc và ép thu dịch chiết

Ưu điểm của phương pháp làdễ thực hiện, đơn giản Thu được tinh dầu có mùi thơm tự nhiên, hiệu suất cao, không cần máy móc thiết bị nhiều Tuy nhiên, phương pháp này lại có nhượcđiểm đó là tốn nhiều thời gian

1.3.2 Phương pháp lôi cuốn hơi nước [14]

Đây là phương pháp đặc biệt để trích ly tinh dầu và những hợp chất dễ bay hơi

có trong nguyên liệu Dụng cụ gồm một bình cầu lớn để cung cấp hơi nước, hơi nước

sẽ được dẫn sục vào bình có chứa mẫu, hơi nước xuyên thấm qua màng tế bào nguyên liệu và lôi theo những cấu tử dễ bay hơi, hơi nước tiếp tục bay hơi và ngưng tụ bởi một ống sinh hàn, ta thu được hợp chất tinh dầu Dùng ete dầu hỏa hoặc ether ethylic

để ly trích tinh dầu ra khỏi hỗn hợp trên hoặc để yên một thời gian trong bình sẽ có

sự phân tách giữ hai pha tinh dầu và nước

1.3.3 Phương pháp chiết hồi lưu (soxhlet) [15]

Bộ chiết soxhlet dùng để hòa tan các hợp chất mong muốn vào dung môi, và không hòa tan các tạp chất vào dung môi đó Nếu các hợp chất mong muốn có mức hòa tan đáng kể vào trong dung môi, thì sau đó chỉ cần một quá trình lọcđơn giản là

có thể phân tách các hợp chất từ các chất không hòa tan Thông thường thì nguyên liệu rắn có chứa một vài hợp chất cần tách chiết sẽ được gói vào trong một loại giấy được làm từ giấy lọc dày, rồi được nạp vào buồng chính của bộ soxhlet

- Nguyên tắc hoạt động:

Bộ soxhlet sẽ được đặt vào một bình có chứa dung môi để chiết tách Ssau đó,

bộ soxhlet được lắp với một bình ngưng Dung môi được làm nóng để bay hơi Hơi dung môi sẽđi lên theo ống dẫn hơi và tràn vào bình trụ chiết Bình ngưng đảmbảo hơi dung môi được làm mát, ngưng tụ rồi rơi lại xuống bình trụ chiết chứa gói mẫu

Bình trụ chiết chứa mẫu sẽ từ từ được làm đầy bởi dung môi ấm, một vài hợp chất mong muốn sẽ được hòa tan vào dung môi ấm Khi bình trụ chiết gần như được làm đầy bởi dung môi, thì tự động dung môi sẽ theo ống xi-phông chảy xuống trở lại bình chứa dung môi Chu kỳ này được cho phép lặp lại nhiều lần trong giờ hoặc trong ngày

Trong mỗi chu kỳ, một phần các hợp chất không bay hơi sẽ hòa tan vào dung môi Sau nhiều chu kỳ, các hợp chất mong muốn sẽ được tập trung vào bình chưng cất

1.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết [15]

1.4.1 Dung môi

Qua nhiều nghiên cứu cho thấy rằng với mỗi dung môi khác nhau thì khả năng chiết tách không giống nhau Một số yếu tố của dung môi cóảnh hưởng đến quá trình chiết xuất là: độ phân cực, độ nhớt, sức căng bề mặt

- Độ phân cực của dung môi: dung môi kém phân cực thì dễ hòa tan nhữngchất

không phân cực, dung môi càng phân cực mạnh càng dễ hòa tan các chất phân cực

- Độ nhớt và sức căng bề mặt: độ nhớt càng thấp hoặc sức căng bề mặt càng

nhỏ thì dung môi càng dễ thấm sâu vào nguyên liệu, không cản trở quá trình khuếch tán chất cần thiết Độ nhớtcao sẽ cản trở quá trình khuếch tán của chất chiết làm giảm hiệu quả chiết

1.4.2 Nhiệt độ chiết

Theo công thức tính hệ số khuếch tán của Eintein, khi nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên Hơn nữa, khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạođiều kiệnthuận lợi cho quá trình chiết xuất Tuy nhiên, khi nhiệtđộ tăng sẽ gây bất lợi cho quá trình chiết xuất trong một số trường hợp sau:

- Đối với hợp chất kém bền ở nhiệt độ cao: nhiệt độ tăng cao sẽ gây phá hủy

một số hợp chất như vitamine, glycoside, alkaloid

- Đối với tạp chất: khi nhiệt độ tăng, không chỉ độ tan của chất tăng, mà độ tan

của tạp chất cũng tăng theo, khi đó dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp Nhất là đối với một số

tạp như gôm, chất nhầy Khi nhiệt độ tăng sẽ bị trương nở, tinh bột bị hồhóa, độ nhớt của dịch chiết sẽ bị tăng, gây khó khăn cho quá trình chiết xuất, tinh chế

- Đối với dung môi dễ bay hơi có nhiệt độ sôi thấp: khi tăng nhiệt độ thìdung

môi dễ bị hao hụt, khi đó thiết bị phải kín và phải có bộ phận hồi lưu dung môi

- Đối với một số chất đặc biệt có quá trình hòa tan tỏa nhiệt: khi nhiệt độtăng,

độ tan của chúng lại giảm Do đó để tăng độ tan thì cần phải làm giảm nhiệt độ

Từ những phân tích trên thấy tùy trường hợp cụ thể mà lựa chọn nhiệt độ chiết sao cho phù hợp (tùy thuộc vào các yếu tố như nguyên liệu chiết, dung môi, phương pháp chiết )

1.4.3 Thời gian chiết xuất

Khi bắt đầu chiết, các chất có khối lượng phân tử nhỏ thường là hoạt chất sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi nước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn (thường là tạp như: nhựa, keo ) Do đó nếu thời gian chiết ngắn sẽ không chiết hết hoạt chất trong dược liệu, nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản Tóm lại, cần lựa chọn thời gian chiết, thành phần dược liệu dung môi, phương pháp chiếtphù hợp

1.4.4 Độ mịn của nguyên liệu

Khi kích thước của nguyên liệu thô quá, dung môi sẽ khó thấm ướt được nguyên liệu, hoạt chất khó hòa tan vào dung môi Khi độ mịn của nguyên liệu tăng lên, bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu chiết và dung môi tăng lên, bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu chiết và dung môi tăng lên, theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán vào dung môi tăng lên, do đó thời gian chiết sẽ nhanh hơn Tuy nhiên thực tế nếu nguyên liệu chiết quá mịn sẽ gặp một số bất lợi sau:

- Nguyên liệu bị dính bết vào nhau tạo thành dạng bột nhão vón cục, khi đó sẽ làm chậm quá trình chiết xuất Mặt khác, khi lọc dịch chiết dịch sẽ chảy chậm hoặc không chảy được vì nguyên liệu dính bết vào nhau và do các hạt kích thước nhỏ bít kín lỗ chảy của màng lọc

- Nhiều tế bào thực vật bị phá hủy, dịch chiết bị lẫn nhiều tạp, gây khó khăn cho quá trình tinh chế và bảo quản

Từđó phải lựa chọn độ mịn nguyên liệu thích hợp, tùy trường hợp cụ thể, tùy vào nguyên liệu chiết, dung môi, phương pháp chiết Ví dụ: với nguyên liệuđã già cần xay mịn, với nguyên liệu nhiều chất nhầy, chất nhựa nên xay thô Với dung môi

dễ hòa tan nhiều tạp hoặc chiếtở nhiệt độ cao thì nguyên liệu không nên quá mịn

1.4.5 Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi góp phần quan trọng trong việc chiết xuất, tạođiều kiện khuếch tán các chất từ trong tế bào ra ngoài dung môi Nếu tỷ lệ NL/DM quá thấp dẫn đến tốc độ khuếch tán cơ chất chậm, có thể dẫn đến hiệu suất chiết thấp, ngược lại nếu tỷ lệ NL/DM cao quá sẽ tạo ra hiệu suất cao thời gian ngắn, nhưng tốn kém trong thu hồi dung môi và tốn dung môi

1.5 Nghiên cứu trong và ngoài nước về cây Sả Chanh

1.5.1 Nghiên cứu trong nước

Từ lâu cây Sả đã được biết đến như một loại gia vị trong ngành thực phẩm, nó làm tăng hương vị cho món ăn, giúp món ăn hài hòa và hấp dẫn hơn Bên cạnh đó, cây Sả được ông cha ta xem như là cây thuốc quý dùng để chữa các bệnh truyền nhiễm, các bệnh về đường tiêu hóa như đau bụng, tiêu chảy

Tuy nhiên, dịch chiết từ cây Sả thì hầu như ít được quan tâm, chỉ có vài bài được công bố như:

+ Phùng Thị Ái Hữu - Đại học Đà Nẵng đã nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học tinh dầu cây Sả Chanh ở quận Cẩm Lệ Đà Nẵng [6]

+ Nguyễn Quốc Châu Thanh - Đại học Cần Thơ đã khảo sát cácđiều kiện tốiưu khi ly trích tinh dầu Sả Chanh bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước, đồng thời phân tích thành phần hóa học của tinh dầu bằng máy sắc ký ghép khối phổ(GC – MS) Kết quả cho thấy thời gian ly trích tinh dầu thân Sả Chanh là 240 phút và lá Sả Chanh là

150 phút, thể tích nước cất là 500 ml, nhiệt độ là 1500C Thành phần chính của tinh dầu là cis–citral và trans-citral Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng tinh dầu Sả Chanh có khả năng chốngoxy hóa vàức chế khả năng phát triển của một số loạivi khuẩn, vi nấm

là khá tốt [3]

- Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội cũng đã nghiên cứu về lợi ích của cây Sả Chanh, nhưng khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ Sả vẫn là vấn đề đang được nghiên cứu

1.5.2 Nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới, hoạt tính kháng khuẩn của các loại tinh dầu thực vật đã được quan tâm và nghiên cứu từ rất lâu, và đã có những nghiên cứu được công bố

+ Năm 2003, Kazuhico Nakahara và các cộng sựđã nghiên cứu về thành phần

hóa học, khả năng kháng nấm của tinh dầu Sả chiết xuất từ loài SảC.nadus, Các thành

phần chính của dầu là geraniol (35,7% tổng số chất dễ bay hơi), trans-citral (22,7%), cis-citral (14,2%), geranyl axetat (9,7%), citronellal (5,8%) và citronellol (4,6%) Xét nghiệm kháng nấm sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch cho thấy tinh dầu

thô rõ rệt ức chế sự tăng trưởng của một số loài Aspergillus, Penicillium và Eurotium

ở liều 250 mg / L trong không khí [19]

+ Năm 2008, Luiz Cláudio Almeida Barbosa và các cộng sự đã nghiên cứu về

thành phần hóa học và công dụng của loài Sả C.citratus tại nước Brazil, Trong một

số tiểu bang của Brazil, Sả Chanh là cây thuốc phổ biến, phạm vi sử dụng phổ biến của nó là khá rộng, chẳng hạn như: phục hồi, tiêu hóa, hiệu quả chống lại cảm lạnh, giảm đau, chống viêm ống dẫn nước tiểu, lợi tiểu, chống co thắt, ra mồ hôi và chống

dị ứng thành phần hóa học của tinh dầu C.citratus thay đổi tùy theo nguồn gốc địa

lý, các hợp chất như hydrocarbon terpenes, rượu, xeton, este và chủ yếu là aldehyde, limonene một trong những hợp chất thường xuyên thấy nhất của monoterpene trong các loại tinh dầu, cũng được tìm thấy trong dầu Sả Chanh [21]

+ Năm 2009, D.Ganjewala đã nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính

sinh học của tinh dầu, các chi Cymbopogon (Poaceae) cho ra các loại dầu thiết yếu

quan trọng nhất Các loại dầu từ các loài sả được sử dụng rộng rãi để làm hương vị,

mỹ phẩm, xà phòng, chất tẩy rửa, nước hoa do hương chanh điển hình của tinh dầu Tinh dầu Sả và thành phần chất trong đó ví dụ citral, geraniol, citronellol, citronellal

và piperitone, đã được biết là có ấn tượng hoạt động kháng khuẩn, kháng nấm, diệt côn trùng, thuốc chống côn trùng trong một thời gian dài Tuy nhiên, các ý nghĩa sinh

học và dược lý của các loại tinh dầu đã được mở rộng nhanh chóng trong mười năm trước; chống viêm, chống ung thư, chống gốc tự do và hữu ích khác của tinh dầu hoạt động hiện nay đã được chứng minh [18].

+ Cũng vào năm 2009, Koffi Koba, Komla Sanda và các cộng sựđã nghiên cứu về hoạt động gây độc tế bào trong ống nghiệm từ tinh dầu của hai loại Sả

C.citratus vàC.nadus, thành phần phần trăm cho thấy các thành phần chính của các

loại tinh dầu mẫu lần lượt là geranial (45,2%), neral (32,4%) và myrcene (10,2%) cho

dầu C citratus vàcitronellal (35,5%), geraniol (27,9%) và citronellol (10,7%) cho dau

C.nardus Trong ống nghiệm sinh trắc nghiệm khả năng gây độc trên dòng tế bào của

con người HaCattiết lộ rằng độc tính của tinh dầu từ C citratus (IC50: 150 1) cao hơn so với tinh dầu từC.nardus (IC50: 450 μL.mL-1).Những kết quả thực

μL.mL-nghiệm đã chứng minh rằng, trong bốn thành phần chính của cả hai thử μL.mL-nghiệm các loại tinh dầu, neral, geranial và citronellal là có khả năng gây độc cao cho dòng tế

bào HaCaT Do đó, tác dụng gây độc tế bào của các loại dầu thiết yếu của C.citratus

và C nardus tìm thấy trong nghiên cứu này chắc chắn làdo thành phầncitral (neral và

geranial) [20]

+ Năm 2014, Christopher E.Ekpenyuong và các cộng sựđã nghiên cứu về cácứng dụng của tinh dầu Sả và khả năng gây độc đến sức khỏe con người, nghiên cứu trên thành phần của tinh dầu có ghi nhận sự hiện diện của tannin, saponin, flavonoid, phenol, anthraquinon, alkaloids, Deoxysugars và các thành phần tinh dầu khác nhau trong các loại thảo dược Chất chuyển hóa hoạt động thứ cấp của một số thành phần cũng có liên quan đến các tác dụng dược lý khác nhau của, bao gồm cả

độc tính của nó Tinh dầuC citratuslà tương đối an toàn cho tiêu dùng ở bất kỳ liều

lượng, tuy nhiên gần đây đã cóbằng chứng cho thấy trong thành phần tinh dầucó một

số hợp chất cóthể có khả năng gây độc cho người tiêu dùng C.citratusnên được sử

dụng thận trọng đối với các bệnh nhân bị bệnh thận và gan, phụ nữ mang thai hoặc cho con bú, bệnh nhân dùng thuốc kháng tiểu cầu hoặc rối loạn đông máu [17]

1.6 Giới thiệu về các chủng vi sinh vật

1.6.1 Escherichia coli

1.6.1.1 Phân loại E coli [2]

Vi khuẩn E coli thuộc:

E coli là một trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 2 x 0,6µm

đến 3 x 0,6µm Trong cơ thể động vật, chúng có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn Có khi thấy trong môi trường nuôi cấy có những trực khuẩn dài từ 4µm đến 8µm, những loại này thường gặp trong canh khuẩn già Phần

lớn E coli di động do có lông ở xung quanh thân nhưng có một số thấy không di động Vi khuẩn không hình thành nha bào, có thể có giáp mô Vi khuẩn E coli bắt

màu gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu

1.6.1.3 Tính chất nuôi cấy

Vi khuẩn E coli dễ dàng phát triển ở môi trường nuôi cấy thông thường, một

số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp nên người ta đã chọn chúng

để nghiên cứu về sinh vật học

E coli là trực khuẩn gram âm hiếu khí tùy ý, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ

5 – 400C, nhiệt độ thích hợp nhất là 370C pH thích hợp nhất là 7,2 – 7,4 phát triển được ở pH từ 5,5 – 8

Môi trường thạch thường: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt bóng láng, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2 -3 mm Nếu nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra

Môi trường nước thịt: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C vi khuẩn E coli phát triển

rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màng màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có mùi thối

Môi trường MacConkey: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, khuẩn lạc có màu cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường

Môi trường EMB (Eosin Methyl Blue): sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc màu tím đen có ánh kim

1.6.1.4 Khả năng gây bệnh của E.coli

Vi khuẩn E coli có thể gây ra bệnh viêm dạ dày, ruột hay gặp ở trẻ em E

coli có thể gây nhiễm trùng đường tiết niệu, đường gan, mật Nhiễm trùng vết thương,

vết bỏng, viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa, viêm xoang, viêm màng não mũ

ở trẻ sơ sinh, nhiễm khuẩn huyết

Staphilococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, Gram dương (+),

hình cầu, tụ thành chùm, đôi khi từng tế bào đơn hay từng đôi Trong tự nhiên,

Staphilococcus aureus thường được tìm thấy trên da, mũi, tóc hay lông của các loài

động vật máu nóng

Hầu hết các dòng Staphilococcus aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong

môi trường có nhiệt độ trên 150C, nhiều nhất khi tăng trưởng ở 35 – 370C

1.6.2.3 Tính chất nuôi cấy

Vi khuẩn S.aureus có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ rất rộng từ 7

– 480C, với nhiệt độ cực thuận là 30 – 450C, khoảng pH 4,2 – 9,3, với pH cực thuận

là 7 -7,5 và trong môi trường chứa trên 15% NaCl Tụ cầu bền vững khi có nồng độ đường cao, nhưng bị ức chế bởi nồng độ 60%, nồng độ từ 33 - 55%, tụ cầu vẫn phát

triển, trong khi các vi khuẩn khác như Shigella và Salmonella bị ức chế Ngoài ra,

chúng còn có khả năng bám dính tốt trên nhiều loại tế bào và máy móc thiết bị giúp gia tăng tính kháng của tụ cầu với sự sấy khô và lọc thấm Chính nhờ những đặc điểm

trên giúp S aureus có sự phân bố rộng, chủ yếu được phân lập từ da, màng nhày, tóc

và mũi của người và động vật máu nóng S aureus được cho là vi khuẩn khá mạnh

có thể sống tốt bên ngoài kí chủ Vi khuẩn này còn có mặt trong không khí, bụi và trong nước dù chúng thiếu tính di động và rất nhạy với thuốc kháng sinh và chất diệt

khuẩn Tuy nhiên, S aureus cũng khá nhạy với nhiệt độ, bị diệt ở 600C từ 2-50 phút tùy từng loại thực phẩm và là vi sinh vật cạnh tranh yếu, dễ bị các vi sinh vật khác ức chế

1.6.2.4 Khả năng gây bệnh của S.aureus

Khi ăn phải thực phẩm có chứa các độc tố này, sau 4 - 6 giờ người bị ngộ độc

có các triệu chứng tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 - 8 giờ Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như jambon, kem tổng hợp, nước súp (ít khi được xử lý ở nhiệt độ cao trên 400C) và các loại thủy sản, thực phẩm đóng hộp thường hay nhiễm loại vi sinh vật này Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trình chế biến

Vi khuẩn S.aureus là tác nhân gây nhiều bệnh nhiễm trùng như: mụn nhọt,

chốc lở, viêm da, viêm phổi, viêm não, viêm tủy xương, viêm cơ tim, viêm màng trong tim, viêm màng ngoài tim, đường tiết niệu, hệ thần kinh trung ương, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết thương hậu phẫu

Người tiêu dùng bị ngộ độc thực phẩm là do ăn uống trúng độc tố ruột của

S.aureus cư trú trong đường ruột chiếm ưu thế về số lượng S.aureus có thể bị nhiễm

từ người chế biến sẽ sinh sôi trong thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng thích hợp Khả năng trúng độc phụ thuộc vào số lượng độc tố, loại độc tố, khả năng kháng của cơ thể

1.6.3 Salmonella [11]

1.6.3.1 Đặc điểm hình thái của Salmonella

Hình 1.5 Vi khuẩn Salmonella

Salmonella là trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn có kích thước khoảng

0,4 – 0,6 x 1- 3 µm, không hình thành giáp mô và nha bào, có lông và di động được

Vi khuẩngram âm (-), lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indole, không phân giảiure, không có khả năng tách nhóm amin từ tryptophan hầu hết các chủng đều sinh H2S

1.6.3.2 Tính chất nuôi cấy

Salmonella là vi khuẩn hiếu khí tùyý nhưng phát triển tốt trong điều kiện hiếu

khí, chúng có thể sốngở nhiệt độ từ 5,2 – 46,20C và pH từ 3,7 – 9,5, nhưng phát triển tốt nhấtở 370C và pH 6,8 – 7,2 Salmonella dễ phát triển trên các môi trường dinh

dưỡng thông thường khi nuôi cấy trong khoảng 24 giờ, nhưng trên môi trường thạch BSA (Bismuth Sulfite Agar) thì phải nuôi cấy trong 48 giờ

Trên môi trường canh sau khi nuôi cấy 5 – 6 giờ thì làmđục nhẹ môi trường, sau 18 giờ làmđục đều, nếu nuôi cấy lâu hơn 24 giờ thì môi trường có lắng cặn

Trên môi trường thạch thường vi khuẩn có khuẩn lạc dạng S tròn, lồi, trơn láng, bờ đều, thường không màu hay màu trắng xám Đôi khi tạo khuẩn lạc dạng R, kích thước khuẩn lạc thường trong khoảng 2 – 4 mm

Trên môi trường thạch MacConkey vi khuẩnSalmonella mọc thành những

khuẩn lạc tròn, đường kính 2 - 3 mm, trong suốt, không màu, sáng, nhẵn bóng, hơi lồiở giữa

Trên môi trường BSA (Bismuth Sulfite Agar) Salmonella cho khuẩn lạc có

màuđen, thường cóánh kim bao quanh

1.6.3.3 Khả năng gây bệnh của Salmonella

Salmonella gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện đến mức cả triệu tế bào trong

một gam thực phẩm Các triệu chứng biểu hiện: nôn mửa, tiêu chảy Thời gian ủ bệnh

kể từ khi tiêu thụ thực phẩm cho đến khi các triệu chứng được biểu hiện là 12 - 36

giờ, triệu chứng ngộ độc kéo dài từ 2 đến 7 ngày Các loại sản phẩm có nguy cơ nhiễm

Salmonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và các sản phẩm từ trứng, thủy

sản Nguồn lây nhiễm các loại thực phẩm này thường là phân người và động vật

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu

- Cây Sả Chanh: mua tại chợ Vĩnh Hải – Thành phố Nha Trang

- Ba chủng vi sinh vật: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella

Địađiểm lấy chủng: Bộ sưu tập vi sinh vật phòng thí nghiệm Hóa sinh trườngĐại học Nha Trang

Địa điểm nghiên cứu

Các phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, phòngthí nghiệm Hóa sinh thuộc trung tâm thí nghiệm thực hànhtại trường Đại học Nha Trang

Thời gian nghiên cứu

Từ ngày 02/02/2015 đến ngày 07/06/2015

2.2 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

Dụng cụ

Đĩa petri: dùng để cấy vi khuẩn

Que cấy vòng: cấy phân lập vi khuẩn

Que cấy trang: dùng để trang đều vi khuẩn trên bề mặt thạch

Ống nghiệm: pha loãng vi khuẩn

+ Aceton 99,5%

+ Nước

Địa chỉ mua: cửa hàng hóa chất và dụng cụ thí nghiệm Hoàng Trang, 42 Hoàng Hoa Thám - Lộc Thọ - thành phố Nha Trang

- Môi trường cấy vi khuẩn: Nutrient agar (NA)

Địa chỉ cung cấp: Phòng thí nghiệm Hóa sinh trườngĐại học Nha Trang

Thiết bị nghiên cứu

+ Xuất xứ Tây Ban Nha

+ Độ chiếu sáng : 800 Lux trong buồng làm việc

+ Độ ồn khi hoạt động : < 55 dB

+ Màng lọc HEPA H14 – DOP – Class 10 với độ lọc hữu hiệu 99.999% cho các tiểu phân có kích thước > 0.3µm

+ Lưu lượng khí thổi 1000 m3/h theo phương thẳng đứng

+ Kích thước bên trong tủ : 1230 x 700 x 670 mm

+ Kích thước bên ngoài tủ : 1230 x 1290 x 845 mm

+ Có thể tự động chưng với bộ điều khiển chân không V – 850

+ Điện thế: 230V

+ Công suất: 120W

+ Tần số: 50/ 60Hz

+ Vận tốc: 20 – 280rpm

2.3 Nội dung nghiên cứu

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Sả

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Sả

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu

- Phương pháp thu mẫu: Sả được đặt mua từng ngày tại một hàng rau cố định

ở chợ Vĩnh Hải – thành phố Nha Trang, Sả đảm bảo cùng độ tươi, cùng kích thước, được thu hoạch và mua vào buổi sáng mỗi ngày

- Phương pháp xử lý mẫu: Sả mua về được cắt bỏ bớt lớp vỏ bên ngoài, lấy một đoạn khoảng 5 – 7 cm tính từ gốc lên thân, sau đó đem đi rửa sạch, để ráo nước, thái mỏng, rồi đem xay Thao tác phải được tiến hành nhanh, Sả sau khi xay nhỏ được cho vào bình có nắp đậy kín để các thành phần hóa học trong Sả không bị oxy hóa

Sử dụng phương pháp dùng dung môi ngâm chiết để tách chiết tinh dầu Sả Nguyên liệu được ngâm trong dung môi với một tỉ lệ xác định và ở một nhiệt độ, thời gian xác định

2.4.2 Bố trí thí nghiệm

2.4.2.1 Lập sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Tỉ lệ NL/DM Nhiệt độ Thời gian