Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết cây mò hoa trắng (clerodendrum fragrans vent ) đối với vi khuẩn e coli và salmonella spp phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị tiêu chảy và thử nghiệm điều trị

1.1 Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn và tồn dư kháng sinh trong sản 1.1.2 Vấn đề tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm chăn nuôi 5 1.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng sản phẩm thảo dượ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

PHẠM THANH XUÂN

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG DIỆT KHUẨN IN VITRO CỦA DỊCH CHIẾT CÂY MÒ HOA TRẮNG (Clerodendrum Fragrans Vent.) ĐỐI VỚI VI KHUẨN E coli và Salmonella spp PHÂN LẬP TỪ PHÂN

CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y

MÃ SỐ : 60.64.01.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

TS NGUYỄN THANH HẢI PGS.TS NGUYỄN VĂN THANH

HÀ NỘI – 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 16 tháng 11 năm 2014

Tác giả luận văn

Phạm Thanh Xuân

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, tạo điều kiện của tập thể lãnh đạo, các nhà khoa học, cán bộ, chuyên viên bộ môn Ngoại Sản Khoa Thú Y; tập thể Ban Lãnh đạo Khoa Thú y, Khoa Công nghệ Sinh học; cán bộ các phòng, ban chức năng Học viện Nông Nghiệp Việt Nam, tôi xin bày

tỏ lòng cảm ơn chân thành về sự giúp đỡ đó

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thanh Hải, PGS.TS Nguyễn Văn Thanh – những thầy giáo trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo cho Tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp và gia đình đã tạo điều kiện, động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học tập cũng như trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án này

Hà Nội, ngày 16 tháng 11 năm 2014

Tác giả luận văn

Phạm Thanh Xuân

1.1 Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn và tồn dư kháng sinh trong sản

1.1.2 Vấn đề tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm chăn nuôi 5 1.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng sản phẩm thảo dược trên thế giới và

1.3.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn, nấm, virus,

kí sinh trùng của một số loài thuộc chi Clerodendrum L 14

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1.3 Lợn con theo mẹ bị mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy 19

3.1 Kết quả kháng sinh đồ kiểm tra tính mẫn cảm của vi khuẩn với các kháng

3.3 Thu dịch chiết thân cây Mò hoa trắng trong các dung môi khác nhau và

3.4 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng

3.4.1 Tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng đối

với vi khuẩn E coli và Salmonella spp phân lập được từ phân lợn con

3.4.2 Tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng

trong dung môi ethanol 35% trên E coli chứa plasmid có gen kháng

3.5 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng

3.6 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng

trong dung môi ethanol 35% theo thời gian bảo quản 41 3.7 Kết quả thử nghiệm điều trị trên lợn con theo mẹ bị viêm ruột tiêu chảy 44

DANH MỤC BẢNG

2.3 Bảng tiêu chuẩn đánh giá khả năng mẫn cảm và kháng thuốc của vi khuẩn 23 3.1 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của 02 chủng vi khuẩn thử nghiệm với

3.2 Tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết rễ, thân, lá cây Mò hoa

3.3 Hiệu suất tách chiết của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng 33 3.4 Tác dụng diệt khuẩn của các dịch chiết thân cây Mò hoa trắng in vitro 35 3.5 Khả năng diệt khuẩn in vitro dịch chiết thân cây Mò hoa trắng khi

3.6 Tác dụng diệt khuẩn của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng trong dung

3.7 Kết quả thử nghiệm điều trị lợn con theo mẹ bị viêm ruột tiêu chảy 46

DANH MỤC HÌNH

2.1 Hệ nồng độ pha loãng cao đặc để xác định nồng độ tối thiểu tác dụng

3.1 Kết quả kháng sinh đồ với kháng sinh chuẩn trên vi khuẩn thử nghiệm 29 3.2 Dịch chiết rễ, thân, lá cây Mò hoa trắng trong dung môi ethanol 70% 30 3.3 Dịch chiết thân cây Mò hoa trắng trong các dung môi khác nhau 32 3.4 Hiệu suất chiết xuất thân cây Mò hoa trắng sử dụng các dung môi

3.5 Đường kính vòng vô khuẩn của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng

3.6 Tác dụng diệt khuẩn in vitro của các dịch chiết thân cây Mò hoa trắng

3.7 Tác dụng diệt khuẩn in vitro của các dịch chiết thân cây Mò hoa trắng 38 3.8 Khả năng diệt khuẩn in vitro dịch chiết thân cây Mò hoa trắng khi pha loãng 40 3.9 Đường kính vòng vô khuẩn của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng đối

3.10 Khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng

trong dung môi ethanol 35% sau 30 ngày bảo quản ở 40C 43 3.11 Hình ảnh lơn con theo mẹ mắc bệnh tiêu chảy do E.coli và Salmonella SPP 45 3.12 Tỷ lệ khỏi bệnh của lợn con theo thời gian điều trị 47

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Hiện tượng kháng thuốc và sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm động vật đang là mối quan tâm lớn trên toàn thế giới Kháng sinh tích lũy trong sản phẩm động vật không những gây độc tính mà có thể gây dị ứng cho người tiêu dùng Tại một số nước phát triển, việc sử dụng kháng sinh như chất tăng trưởng hay mục đích phòng bệnh đã bị cấm Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn và tác dụng phụ của kháng sinh trong điều trị đang là những thách thức trong y học (WHO 2014) Tổ chức y tế thế giới năm 1997 đã nhận định rằng nhiều hợp chất có nguồn gốc thực vật bản địa có khả năng thay thế thuốc kháng sinh Những nghiên cứu và trao đổi thông tin về thảo dược ngày càng được chú trọng (Amadou, 1998) So với các loại kháng sinh tân dược, kháng sinh có nguồn gốc thực vật (gọi là các phytocide) có nhiều ưu điểm như chưa phát hiện có hiện tượng kháng thuốc, không tồn dư trong thực phẩm, rất ít độc, dễ hòa tan trong nước, dễ sử dụng, bào chế giản đơn

(Seyyednejad et al., 2010) Thảo dược đang ngày càng chứng minh được vai trò

quan trọng của nó trong nền công nghiệp dược phẩm như là một giải pháp an toàn sinh học thay thế cho các thuốc hóa học tổng hợp (Mahesh et al., 2008; Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho, 2013)

Khuynh hướng chung của thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng là quay

về với thiên nhiên, tìm cách giảm sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gia súc, gia cầm, động vật thủy sinh và dần dần thay thế bằng thảo dược thân thiện Việt Nam

là một nước nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật phong phú và đa dạng, đang sở hữu

cả “kho vàng” dược liệu với gần 3.000 cây thuốc có thể dùng trực tiếp làm thuốc hay để tách chiết một số hoạt chất bào chế thuốc thành phẩm (Viện dược liệu quốc gia, 2013) Tuy nhiên nhiều cây thuốc đã có hiệu quả điều trị rõ rệt, nhưng cơ chế tác dụng vẫn chưa được giải thích và chứng minh Xu hướng chung hiện nay là kết hợp Đông y và Tây y với phương châm vừa áp dụng những kinh nghiệm chữa bệnh dân gian bằng thuốc nam, vừa nghiên cứu khảo sát các tính năng tác dụng của cây thuốc bằng cơ sở khoa học hiện đại (Đỗ Tất Lợi, 1999) Trong số đó, cây Mò hoa

trắng trong dân gian được sử dụng để trị vết thương ngoài da bị nhiễm trùng, kể cả

là bị nhiễm trùng bởi trực khuẩn mủ xanh cũng cho hiệu quả chữa bệnh tốt, vết thương mau lành (Đỗ Tất Lợi, 1999; Bùi Thị Tho và Nguyễn Thanh Hà, 2009) Nhiều nghiên cứu ngoài nước đã khẳng định cây Mò hoa trắng và các cây trong chi

Clerodendrum có tính kháng sinh, có khả năng chống lại nhiều loại vi khuẩn gây bệnh (Aleykytty et al., 2010; Jeenu et al., 2011;Venkatarismam et al., 2012; Leena and Aleykutty, 2012; Anandhi and Ushadevi., 2013)

Bệnh viêm ruột tiêu chảy là một bệnh khá phổ biến ở lợn con theo mẹ, một

trong những nguyên nhân gây bệnh chính là vi khuẩn E coli và Salmonella spp.(Bùi Thị Tho, 1996; Vũ Bình Minh, Cù Hữu Phú, 1999; Phạm Thế Sơn, Phạm Khắc Hiếu, 2008; Phạm Ngọc Thạch, 2009) Theo nhiều tác giả thì hiện nay nhiều

chủng vi khuẩn E coli và Salmonella spp gây bệnh tiêu chảy đã kháng lại nhiều

loại kháng sinh thường dùng trong thú y (Cù Hữu Phú và cs, 2004; Trương Quang

và cs, 2005; Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho, 2013)

Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết cây Mò hoa trắng (Clerodendrum Fragrans Vent.) đối với vi khuẩn

E coli và Salmonella spp. phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị tiêu chảy và thử nghiệm điều trị” được thực hiện với mục tiêu:

Lựa chọn bộ phận cũng như dung môi tốt nhất để thu dịch chiết cây Mò hoa

trắng có tác dụng diệt khuẩn in vitro đối với E coli và Salmonella spp., ngoài ra còn nghiên cứu khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết đối với E coli Top 10 có

chứa plasmid kháng đơn thuốc (ampicillin và kanamycin) Dựa trên kết quả nghiên

cứu khả năng diệt khuẩn in vitro tiến hành sử dụng dịch chiết cây Mò hoa trắng

trong điều trị lợn con theo mẹ bị mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy

2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

a Ý nghĩa khoa học của đề tài

Chứng minh một cách khoa học về khả năng kháng khuẩn của cây Mò hoa trắng Xác định được phổ kháng khuẩn của kháng sinh thực vật có trong cây Góp phần bổ sung cơ sở lý luận về tác dụng dược lý và ứng dụng trong dân gian của dược liệu Mò hoa trắng

b Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Thành công của nghiên cứu này giúp ta hiểu rõ hơn về khả năng ứng dụng

của cây Mò hoa trắng trong điều trị bệnh do vi khuẩn E coli, Salmonella spp gây

bệnh viêm ruột tiêu chảy của lợn con theo mẹ Trên cơ sở đó có thể ứng dụng rộng trong phòng và điều trị bệnh tiêu chảy ở lợn con theo mẹ bị mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy nói riêng và vật nuôi nói chung nhằm góp phần hạn chế sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn đồng thời giảm thiểu sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi, góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe cộng đồng

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn và tồn dư kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi

1.1.1 Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) ngày 30-4 ra cảnh báo kháng thuốc kháng sinh

là mối đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng Sau khi thu thập dữ liệu tại

114 quốc gia trên toàn cầu về tình trạng kháng thuốc, trong đó đặc biệt là kháng sinh, báo cáo của WHO nêu rõ mối đe dọa nghiêm trọng này không còn là dự báo cho tương lai mà đang diễn ra ở mọi khu vực trên thế giới, có nguy cơ ảnh hưởng tới mọi người dân ở mọi lứa tuổi và các quốc gia khác nhau Theo Trợ lý Tổng Giám đốc WHO, Keiji Fukuda, nếu không phối hợp hành động tức thời, thế giới sẽ đối mặt với một kỷ nguyên “hậu thuốc kháng sinh”, khi đó các bệnh truyền nhiễm thông thường hoặc những vết thương nhỏ trước đó có thể chữa trị được thì nay có thể gây chết người do kháng thuốc kháng sinh (WHO, 2014)

Có rất nhiều nguyên nhân gây ra hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi sinh vât, như sự sử dụng thuốc kháng sinh một cách bừa bãi, không đúng cách, không tôn trọng liều lượng và thời gian trị liệu, cũng như không chịu uống cho thật hết số thuốc như bác sĩ đã kê toa Ngoài ra việc lạm dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi thú y, canh nông và ngư nghiệp cũng dự phần không nhỏ trong sự hình thành của hiện tượng kháng kháng sinh Cuối cùng là vấn đề dùng các chất diệt khuẩn để chùi rửa quá thường xuyên, không đúng chỉ dẫn cũng có thể giúp sản sinh

ra những dòng vi khuẩn có tính kháng thuốc (A report from the American academy

of Microbiology, 2009)

Thuốc kháng sinh dược dùng để phòng và trị bệnh gia súc, nhưng phần lớn trên 90% thuốc được sử dụng như những chất kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi và ngư nghiệp Thuốc kháng sinh được trộn vào thức ăn hỗn hợp với những nồng độ thật thấp để giúp động vật mau lớn và tăng trọng nhanh Việc sử dụng quá bừa bãi thuốc kháng sinh từ nhiều năm nay đã làm phát sinh ra rất nhiều chủng vi

khuẩn mang tính kháng thuốc Vi khuẩn Salmonella đã đề kháng cùng một lúc với thuốc Ampicilline, Chloramphenicol, Streptomycine, và Tétracycline Vào cuối thập niên 90, tại Anh quốc vi khuẩn Salmonella typhimurium DT 104 đã hoành

hành dữ dội trong chăn nuôi Một thời gian sau đó, người ta đã phát hiện những vi khuẩn này ở người và điều tai hại nhất là chúng đã đề kháng với nhiều loại thuốc kể

cả với thuốc Trimethoprim sulfa và Fluoroquinolone Năm 1985, tại California trên

1000 người đã ngã bệnh vì ăn phải hamburger có nhiễm khuẩn Salmonella newport đề kháng với nhiều loại thuốc Ngày nay các vi khuẩn thông thường của

đường ruột như Entérobacter, Campylobacter, và E coli 0157 : H7 (bệnh

Hamburger ) cũng đã đề kháng với nhiều loại thuốc kháng sinh

Theo nghiên cứu của Phạm Khắc Hiếu và Bùi Thị Tho (1999) đã tìm thấy chủng vi khuẩn kháng lại 11 loại kháng sinh, đồng thời cũng chứng minh khả năng

di truyền tính kháng thuốc giữa các vi khuẩn thông qua plasmid

Theo nghiên cứu của Cù Hữu Phú và cs (1999), 80 - 90% vi khuẩn

Salmonella phân lập được kháng mạnh với Penicillin và Ampicillin

Nguyễn Ngọc Nhiên và cs (2000) khi nghiên cứu các chủng E coli phân lập

từ động vật bị tiêu chảy cho thấy hầu hết các chủng phân lập được đều kháng lại nhiều loại kháng sinh như Chloramphenicol, Sulfadimethoxine, Tetracycline

Các chủng vi khuẩn Salmonella có độ mẫn cảm cao với Furazolidon (100%),

Chloramphenicol (87,5%), ít mẫn cảm với Penicillin (25%) và hoàn toàn kháng lại Tetracyclin (Đỗ Trung Cứ và cs, 2001)

Nghiên cứu tính kháng kháng sinh của 106 chủng vi khuẩn phân lập được từ lợn con theo mẹ bị tiêu chảy ở một số tỉnh phía Bắc, Việt Nam, Đỗ Ngọc Thúy và

cs (2002) đã thu được kết quả các chủng có xu hướng kháng mạnh với các loại kháng sinh thông thường dùng để điều trị đặc biệt với Streptomycin lên tới 88,68% Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn với trên 3 loại kháng sinh là khá phổ biến (chiếm 90,57%)

1.1.2 Vấn đề tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm chăn nuôi

Ngày nay, chất kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong ngành nông nghiệp như chăn nuôi, trồng trọt, nuôi trồng thủy hải sản, có tác dụng rất lớn là giúp cho

vật nuôi trồng chống lại bệnh tật từ vi sinh vật Tuy vậy, chất kháng sinh như một con dao hai lưỡi Một mặt giúp sinh vật chông lại bệnh tật, mặt khác, có thể làm cho sinh vật xuất hiện phản ứng phụ, và đặc biệt là lượng chất kháng sinh tồn dư sinh vật có thể ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm, nhất là sức khỏe người tiêu dùng Với một lượng thực phẩm khổng lồ từ động vật đang được tiêu thụ trên thị trường, song ít ai nghĩ đến việc mỗi ngày trong cơ thể chúng ta đang phải tích lũy… dần dần dư lượng chất kích thích tăng trọng và thuốc kháng sinh trong từng miếng thịt động vật của các loại sản phẩm này Bởi trong chăn nuôi gia súc, gia cầm hiện nay, người dân sử dụng rất tùy tiện các loại thức ăn tăng trọng và thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa, trị bệnh và giúp vật nuôi mau ăn chóng lớn

Theo Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn TP HCM, trong đợt kiểm tra an toàn thực phẩm những tháng đầu năm 2014, cơ quan chức năng đã phát hiện nhiều mẫu thịt có tồn dư kháng sinh vượt ngưỡng Cụ thể, khi lấy ngẫu nhiên 60 mẫu thịt (30 mẫu thịt heo, 30 mẫu thịt gia cầm) từ TP HCM và các tỉnh đem về giết mổ tại 2

cơ sở giết mổ lớn trên địa bàn thành phố, cơ quan chức năng phát hiện 13/30 mẫu thịt heo (tỉ lệ 43,33%) có nguồn gốc từ Bình Dương, Bến Tre, Bình Thuận, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu và 1/30 mẫu thịt gia cầm (3,33%) có hàm lượng kháng sinh sulfadimidin vượt giới hạn cho phép (Báo người Lao Động, 2014)

Kháng sinh tetracycline trong 290 mẫu thịt lợn trên thị trường thuộc các quận huyện nội, ngoại thành Hà Nội được xác định bằng phương pháp kiểm tra khả năng

ức chế vi khuẩn trên đĩa thạch (agar inhibition test) với chủng Bacillus cereus (ACTT 11778) Các mẫu ghi ngờ được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatography; HPLC) 5.5% số mẫu nói trên cho kết quả dương tính (có tồn dư kháng sinh tetracycline) (Duong Van Nhiem, 2005)

1.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng sản phẩm thảo dược trên thế giới và Việt Nam

Trên thế giới, 265.000 loài thực vật được phát hiện, trong đó có 150.000 loài được phân bố ở các vùng nhiệt đới, 35.000 loài có ở các nước ASEAN Trong số này có ít nhất 6.000 loài được dùng làm thuốc Thuốc từ dược liệu được sử dụng không chỉ các nước Á Đông mà còn được tiêu thụ một lượng khá lớn ở các nước

Phương Tây Ở các nước có nền công nghiệp phát triển thì một phần tư số thuốc kê trong các đơn có chứa hoạt chất từ dược liệu Tại Mỹ năm 1980 giá trị số thuốc đó lên tới 8 tỉ đô la, tại thị trường Châu Âu lượng thuốc đông dược tiêu thụ cũng lên tới 2,3 tỉ đô la Nhiều biệt dược đông dược của Trung Quốc được tiêu thụ mạnh ở các nước phát triển Việt Nam cũng có một số mặt hàng đông dược xuất khẩu có uy tín

ở thị trường nước ngoài như hoa hòe, quế, sa nhân, dừa cạn, các loại tinh dầu hồi, quế, tràm…(Hoàng Thị Tuyết Nhung, 2012).Về sử dụng dược liệu, ở khu vực Đông

Á, Trung Quốc, Nhật Bản, cùng với Ấn Độ, là các nước tiêu thụ đông dược nhiều nhất Tại Trung Quốc, đông dược chiếm khoảng 30% lượng dược phẩm tiêu thụ, doanh số đông dược sản xuất tại Trung Quốc để tiêu thụ nội địa và xuất khẩu năm

2003 ước đạt 20 tỉ đô la Tại Nhật Bản, đông dược được gọi với tên “Kampo”, cũng được chấp nhận và sử dụng rộng rãi, với doanh số khoảng 1 tỉ đô la mỗi năm Ở khu vực Đông Nam Á, Indonesia là nước đứng thứ hai trên thế giới sau Brazil về đa dạng sinh học cây thuốc, có tới 90% số lượng cây thuốc trên thế giới được tìm thấy

ở đây Theo số liệu năm 1995, có 40% dân số Indonesia sử dụng đông dược, trong

đó có 70% sinh sống ở vùng nông thôn Các nước Đông Nam Á khác đều có tỉ lệ sử dụng đông dược đáng kể trong cộng đồng và hệ thống y tế Về nghiên cứu, cho tới nay đã có 0,5%, nghĩa là 1.300 cây được nghiên cứu một cách có hệ thống về thành phần hóa học và giá trị chữa bệnh (Viện Dược Liêu, 2005)

1.2.1 Tình hình nghiên cứu và sử dụng dược liệu trên thế giới

Việc tăng năng suất, sản lượng chăn nuôi một cách ồ ạt khiến dịch bệnh ngày càng trở thành vấn đề nhức nhối cho người chăn nuôi Để xứ lí vấn đề này, các loại hóa chất, kháng sinh được xem như là giải pháp đầu tiên được người chăn nuôi sử dụng để điều trị bệnh.Tuy nhiên, việc sử dụng các loại hóa chất, kháng sinh không đúng quy cách, liều lượng đang dẫn tới hiện tượng kháng thuốc Bên cạnh đó, việc tồn dư kháng sinh còn ảnh hưởng rất lớn tới sức khỏe con người.Trong những năm gần đây, xu hướng sử dụng thảo dược trong điều trị bệnh được sử dụng rộng rãi Hơn nữa việc sử dụng thảo dược có biên độ an toàn lớn và không ảnh hưởng tới sức khỏe con người Các chiết xuất từ thảo dược như hinokiticol, citral, allylisocyante được sử dụng rộng rãi trong bảo quản, điều trị bệnh do nấm, vi khuẩn gây ra

(Nguyễn Thị Vân Thái, 2006)

Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được công dụng diệt khuẩn của tỏi.Năm 1944, nhà khoa học Chester J Cavallito đã phân tích được hợp chất allicin trong tỏi có công dụng như thuốc kháng sinh Allicin chỉ có trong tỏi chưa nấu hay chế hóa Kháng sinh này mạnh bằng 1/5 thuốc penicillin, 1/10 thuốc tetraciline, có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn, xua đuổi hoặc tiêu diệt nhiều loại sâu bọ, kí sinh trùng, nấm độc Năm 1948, Machado cùng cộng sự đã chiết xuất

từ tỏi được garcillin, chất này không có mùi lưu huỳnh, không độc, ứng dụng tốt trong bệnh nhiễm trùng Shigella, Salmonella hoặc các bệnh kí sinh trùng như giun kim, giun đũa, giun tóc Một nghiên cứu khác tại Brazil năm 1982 đã chứng minh nước tinh chất của tỏi có thể chữa được nhiều bệnh nhiễm độc như bao tử, do thức

ăn có lẫn khuẩn

Năm 1880, Davaine đã bắt đầu nghiên cứu tính kháng khuẩn của lá Hồ

Đào đối với Bacillus anthracis.R.Koch (1887), nghiên cứu chứng minh tính

kháng khuẩn của nhiều loại tinh dầu Cũng trong thời gian này Chamberland chứng minh nhiều loại tinh dầu có tính kháng khuẩn, các thí nghiệm này được nhiều người như: Cadeae, Mennic, Bering, Reilling,… tiếp tục nghiên cứu Năm

1959, Horeak và Santavi chiết xuất từ cannabit sativa – Cannabinacea, được chất

cannabiriolic, dung dịch 10-15 µg/ml có tác dụng diệt khuẩn với vi khuẩn gây bệnh lao ở người, vi khuẩn Gram (+), đặc biệt vi khuẩn kháng lại penicillin

(Nguyễn Thị Vân Thái, 2006)

Một nghiên cứu khác của Tokin (1928) đã chứng minh nhiều chất bay hơi từ cây xanh như Phytocid có tác dụng với vi khuẩn, nhiều công trình nghiên cứu đã xác nhận rằng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật rất phong phú, có phạm vi ứng dụng rộng rãi (Viện Dược Liệu, 2003; Phan Xuân Thanh và cs, 2003; Mai Văn Tài, 2004)

Từ củ của cây Stephania cepharantha – Menispermaceae Năm 1934 Kondo

và cộng sự tách chiết một alkaloid có tên cepharantin, chất này có tác dụng với vi khuẩn lao ở nông độ 10-20 mg/ml Năm 1944 Gupta và Kahali đã chiết suất từ cây berberis vulgaris chất berberin, chất này có ảnh hưởng tốt với các kí sinh trùng do

Leishmannia tropica, Trypanosomanna equipendum gây ra Theo Schlederer (1962)

có thể tiêm dung dịch berberin 2% trị khỏi bệnh bouton dorient Ukita Mizuno và Tamura (1949) nhận thấy berberincos tác dụng tốt hơn sunfathiazon đối với

Staphylococcus aureus , Shigella, Gonococcus

Năm 1985, Khuê Lập Trung đã đưa ra 22 loài thảo dược, chủ yếu trong trị các bệnh về vi khuẩn, ngoại kí sinh trùng, bệnh đường ruột cho tôm, cá và nhuyễn thể như: Xuyên tâm liên, địa niên thảo, lưu xô tử, quản trọng, ngũ bội tứ, tiền thảo (Khuê Lập Trung, 1985)

Tại Thái Lan, Sataporn Direkbusarakom và cộng sự (1997) đã thử nghiệm

thành công khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược như: O.sanctum, C.alata, Tinospora cordifolia, Eclip ta alba, Tinospora cripspa, Psidium guajava, Clinacanthus nutans, Androgaphic panniculata, Moimonrdica charatina, Phyllanthus reticulates, P.pulcher, P.acidus, P debelis, P.amaus, P.debelis và P.urinaria đối với vi khuẩn vibrio ssp Tuy nhiên, chỉ có hai cây P.guarava và M.charantina có hiệu quả

ức chế đối với vibrio ssp Nồng độ ức chế tối thiểu của P.guarava là 0,625 mg/ml và M.charantina là 1,25 mg/ml (Nguyễn Thị Vân Thái, 2006)

Tại Trung Quốc, đã tách chiết được một loại Alkaloid từ cây xoan rừng có tên Yanatren hoặc sử dụng hạt với tên kosam, enkosamcos tác dụng điều trị lị amip Gần đây các nhà khoa học trên thế giới phát hiện thêm nhiều đặc tính quý

của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) trong việc chữa các bệnh về gan, mật, ung

thư… Thậm chí cả hiệu ứng ngăn ngừa và chống căn bệnh thế kỷ AIDS (Viện dược liệu, 2005)

Những hoạt chất có trong lá chè (Thea sinensis) ngoài những tác dụng thông

thường như giải cảm, tiêu độc, lợi tiểu người ta còn phát hiện thêm một giá trị đặc biệt đó là khả năng làm tăng sức đề kháng của trẻ em đối với vius gây bệnh viêm não Nhật Bản B

Các kết quả trên chỉ mới bước đầu thử nghiệm sàng lọc các loại thảo dược chưa xác định được thành phần nào trong thực vật có tác dụng trên virus và vi khuẩn

Hiện nay dược liệu có vai trò sau:

+ Dược liệu là nguồn cung cấp nguyên liệu cho việc bán tổng hợp một số hóa dược: từ chất diosgenin của củ mài để bán tổng hợp lên thuốc steroid được sử dụng nhiều trong lâm sàng

+ Nhiều hoạt chất quan trọng: quinin, morphin, ajmalin, vincaleucoblastin, emetin, strychnin… đều phải chiết ra từ dược liệu vì chưa tổng hợp được

+Dược liệu mở đường cho ngành công nghiệp hóa dược phát triển:

Biết được công thức của ephedrin hoá dược đã ngưng tụ acetyl carbinol với methylamin để có ephedrin tổng hợp

Dựa vào công thức của quinin trong vỏ canh-ki-na để tổng hợp rất nhiều dẫn chất trị ký sinh trùng sốt rét

Dựa vào artemisinin của cây thanh hao hoa vàng, các dẫn chất artesunat, arteether, artemether được bán tổng hợp cũng để trị ký sinh trùng sốt rét

Từ 1950-1980 thế giới đã thử tác dụng chống ung thư như: taxol (paclitaxe) của cây Taxus brevifolia Nutt, họ Taxaceae có tác dụng chữa ung thư buồng trứng ở thời kỳ tiến triển Năm 1992 ở Mỹ, Canada và Pháp đã sử dụng taxol trên lâm sàng Hiện nay người ta đang nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất mới từ taxol (Kingston et

al, 1990; Karpagam et al, 2009)

1.2.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng dược liệu ở Việt Nam

Từ xa xưa, dân ta đã biết dùng những cây cỏ quen thuộc trong vườn nhà để trị các bệnh thông thường như một số bệnh đường ruột, bệnh đường hô hấp, tiết niệu, trị mụn nhọt, rửa vết thương (Võ Văn Chi, 1996, 2002; Đỗ Tất Lợi, 2011) Theo y học cổ truyền phần lớn những cây thuốc có tác dụng chữa bệnh nhiễm khuẩn đã được xếp trong nhóm thuốc thanh nhiệt, giải độc, táo thấp, thuốc khử hàn,…như alicin trong tỏi, odorin trong hẹ… (Võ Văn Chi, 1996; Đỗ Tất Lợi, 2011)

Từ thế kỉ XIV, Đại y thiền sư Tuệ Tĩnh đã sử dụng nhiều thảo mộc như: tỏi, hẹ,

tô mộc, hạt cài, trầu không… để trị một số bệnh viêm nhiễm (Võ Văn Chi, 1996)

Từ giữa thế kỉ XX, theo kết quả nghiên cứu của Phạm Văn Ngữ (1956) trên

500 loài thuốc, đã khẳng định rằng nhiều cây thuốc có tác dụng kháng khuẩn rất lớn Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Hường và cộng sự (1959), trên 1000 cây thuốc, chỉ ra rằng kháng sinh thực vật sử dụng rất an toàn, có tác dụng mạnh,

nhóm nghiên cứu đã đưa ra chế phẩm cây tô mộc trị bệnh tiêu chảy

Theo Nguyễn Thượng Dong (2001), Việt Nam có 3.830 trên 10.368 loài thực vật có khả năng sử dụng làm thuốc Trong đó có khoảng 300 loài đang được khai thác, trồng và kinh doanh với số lượng lớn.Bên nhân y, công nghiệp dược sản xuất thuốc từ dược liệu hay hoạt chất từ dược liệu đang được Đảng và Nhà nước quan tâm và phát triển rất mạnh Bên cạnh đó còn có các vùng cao như: Sapa, Đà Lạt thuận lợi cho di nhập một số cây quý như: Actiso, Dương Địa Hoàng… nước ta có trên 3200 km bờ biển chạy từ Bắc vào Nam nên còn có rất nhiều hải sản quý dùng làm thuốc (Nguyễn Thượng Dong, 2001)

Hiện nay trên cả nước, mỗi năm cung cấp cho thị trường khoảng 15.600 tấn dược liệu (tính cả cây thuốc hoang dại là 27.700 tấn) Trong khi nhu cầu dược liệu

là 59.548 tấn/năm gồm: phục vụ công nghiệp dược 20.110 tấn, hệ thống chữa bệnh bằng y học cổ truyền 18.452 tấn và xuất khẩu 20.986 tấn Nhu cầu về dược liệu ngày càng tăng do hệ thống điều trị bằng phương pháp y học cổ truyền đã được WHO công nhận Nhiều nhà khoa học cho rằng, các hợp chất thiên nhiên do đã tồn tại trong tế bào sống của cây thuốc, nếu được phân lập thành nguyên liệu làm thuốc, chúng rất nhanh thích nghi với tế bào sống, có tác dụng chống lão hóa… Do đó khả năng hấp thu sẽ tốt và ít độc hơn so với các chất tổng hợp hóa học chưa bao giờ tồn tại trong tế bào sống

Ngày nay, nhiều cây thuốc đã có hiệu quả điều trị rõ rệt, nhưng cơ chế vẫn chưa được giải thích và chứng minh Xu hướng hiện nay là kết hợp giữa Đông Y và Tây Y với cách vừa áp dụng những kinh nghiệm chữa bệnh của ông cha ta bằng thuốc Nam, vừa nghiên cứu khảo sát các tính năng, tác dụng của cây thuốc bằng cơ

sở khoa học hiện đại (Đỗ Tất Lợi, 2011)

1.3 Cây Mò hoa trắng (Clerodendrum Fragrans Vent.)

Tên khoa học: Clerodendrum Fragrans Vent

Tên khác: Bạch đồng nữ, bần trắng, vậy trắng, mấn trắng, mò trắng

Họ: Cỏ roi ngựa (Verbenaceae)

Hình 1.1 Cây mò hoa trắng

1.3.1 Mô tả thực vật, phân bố, bộ phận dùng

Mô tả thực vật: Cây nhỏ cao khoảng 1 - 1,5m, thường rụng lá Lá mọc đối, lá

rộng hình trứng dài 10 - 20cm, rộng 8 - 18cm, đầu nhọn, phía cuống hình tim hay hơi phẳng, mép có răng cưa to, thô Mặt trên màu sẫm hơn, có lông ngắn, mặt dưới nhạt màu hơn, gần như bóng, trên các đường gân hơi có lông mềm Cuống lá dài khoảng 8cm Khi vò nát lá có thấy mùi hôi đặc biệt của cây mò

Hoa màu hồng nhạt hay trắng, có mùi thơm; hoa mọc thành hình mâm xôi gồm nhiều tán Đài hoa hình phễu, phía trên có xẻ thành 5 thùy, hình 3 cạnh tròn; tràng hoa hình ống nhỏ, có 4 nhị đính trên miệng ống tràng cùng với nhuỵ vượt quá tràng hoa Vòi nhị thường ngắn hơn chỉ nhị; bầu thượng dạng hình trứng

Quả hạch gần dạng hình cầu, dính với đài tồn tại bao ở ngoài

Hoa nở tháng 7, 8 và quả chín tháng 9,10

Phân bố sinh thái: Cây mọc hoang ở nhiều nơi, ở vùng núi lẫn đồng bằng Thu hái, sơ chế: Hái vào lúc cây đang và sắp ra hoa (tháng 8 và tháng 9), sấy

khô phơi âm can, có thể cùng rễ rửa sạch, phơi khô, xắt lát, sắc uống

Bộ phận dùng: Rễ sắc uống, thân và cuống lá nấu nước dùng để rửa bên

ngoài

1.3.2 Tác dụng dược lý

Năm 1968, Bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược khoa phối hợp với Viện YHDT nghiên cứu Bạch đồng nữ thấy có tác dụng hạ huyết áp do dãn mạch ngoại

vi, có tác dụng lợi tiểu và có khả năng ngăn chặn phản ứng viêm do Phenol gây ra trên tai thỏ

Bạch đồng nữ có tác dụng chống viêm cấp tính khá tốt, biểu hiện rõ rệt ở hiện tượng giảm phù trong mô hình gây phù thực nghiệm trên chuột với Kaolin Bạch đồng nữ có tác dụng chống viêm mạn tính tương đối yếu trên mô hình gây u hạt thực nghiệm với Amian ở chuột

Bạch đồng nữ không có tác dụng gây thu teo tuyến ức chuột non Tác dụng gây thu teo tuyến ức là một trong những đặc điểm của các thuốc ức chế miễn dịch Nước sắc 3/1 của Cleodendrum philippinum đã được thử kháng sinh đồ trên các chủng vi khuẩn phân lạp từ các vết thương nhiễm khuẩn, thấy có tác dụng ức

chế sự phát triển các vi khuẩn Pseudononas aeruginosa, Staphylococus aureus, Escherichia coli và các Proteus

Theo tài liệu nước ngoài, cuống lá, hoa và rễ Xích đồng nam Clerodendrum kaempferi có tác dụng chống co thắt hồi tràng cô lập súc vật thí nghiệm gây nên bởi Acetylcholin hoặc Histamin

Cả cây Bạch đồng nữ có các tác dụng kháng nguyên sinh vật trong thí

nghiệm của Entamoeba histolitica, chủng STA, hạ đường huyết trên chuột trắng và

gây giảm đau trong thí nghiệm tấm kim loại nóng của Edy và Leimbach Chất Clerodin chiết xuất chủ yếu từ cành non và lá Xích đồng nam có tác dụng diệt giun đất trong dung dịch nước trong vòng 30 phút (Viện Dược Liệu, 1993)

Nước sắc lá tươi của cây Clerodendrum philipinum được dùng rửa trực tiếp

lên vết thương nhiễm trùng rồi phủ gạc ( Không dùng phối hợp với kháng sinh nếu viêm nhiễm cư trú; có phối hợp với kháng sinh nếu nhiễm trùng toàn thân) Đa số bệnh nhân đều kháng với hầu hết các kháng sinh thông thường tác dụng của thuốc

đã làm giảm rõ phù nề quanh vết thương, không gây sốt, bệnh nhân lại thấy mát, dễ chịu, làm sạch nhanh vết thương, kể cả đối với trực khuẩn mủ xanh là loại nhiễm trùng dai dẳng, rất khó điều trị với dung dịch thuốc thông thường và làm tổ chức hạt mọc nhanh, vết thương mau lành, làm sẹo đẹp, không để lại sẹo lồi (Viện Dược Liệu, 1993)

1.3.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn, nấm, virus, kí sinh trùng của một số loài thuộc chi Clerodendrum L

Theo George and Pandalai (1949), dịch chiết cồn từ lá và hoa của loài

C.inerme có hoạt tính kháng lại Escheria coli và Staphylococcus Năm 1997, Mehdi

và cộng sự nghiên cứu dịch chiết cồn phần trên mặt đất sấy khô loài C.inerme L

cho thấy hoạt tính kháng virus mạnh, chống lại virus viêm gan B với ED50 là

16µg/ml Năm 1979, Sharma và Singh nghiên cứu tinh dầu từ lá của cây C.inerme

L cho thấy tinh dầu này có hoạt tính kháng nấm

Năm 1990, Toyota và cộng sự đã phân lập được Mi-saponin-A, một

triterpenoid saponin từ rễ cây C.wildii cho tác dụng kháng nấm mạnh đối với Clasdosporium cucumerium

Năm 1995, Roy và cộng sự đã phân lập được pectolinarigenin và chalcone

glucoside từ lá của loài C.phlomidis và cho thấy các chất này có tính kháng nấm

Năm 1995, Misra và cộng sự nghiên cứu dịch chiết n-hexan của loài

C colebrookianum với nồng độ 1000 và 2000ppm có hoạt tính kháng sinh mạnh,

chống lại nhiều vi khuẩn gram âm và gram dương như Staphylococus aureus, E coli

Năm 1996, Roy và cộng sự đã phân lập được hai flavonoids (cabruvin và

quercetin) từ rễ của loài C infortunatum và cho thấy 2 chất này đều có hoạt tính

kháng nấm mạnh

Năm 1999, Hoàng Thanh Hương và cộng sự đã lựa chọn 11 chủng vi khuẩn

điển hình với 5 đại diện gram âm (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Shigella flexneri, Protus mirabilis, Samonella typhy), 5 đại diện gram dương

(Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus pumillus, Staphylococcus aureus, Sarcina lutea ), 1 đại diện nấm (Candida albicans) và nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro của flavonoid toàn phần dịch chiết xuất từ lá của 3 loài bạch đồng nữ (Clerodendron fragrans), xích đồng nam (Clerodendron infortunatum), Bọ mẩy (Clerodendron cyrtophyllum) Tiến hành định tính kháng khuẩn với nồng độ dung

dịch flavonoid toàn phần là 50 mg/ml và đánh giá mức độ kháng khuẩn của flavonoid thong qua giá trị của đường kính vòng vô khuẩn sau 24 giờ kể từ khi cấy

vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy Kết quả thu được cho thấy đối với cả 3 loài, hoạt

tính kháng khuẩn của flavonoid toàn phần đối với các chủng vi khuẩn gram âm và gram dương là khá tốt nhưng tác dụng đối với nhóm vi khuẩn gram dương tỏ ra mạnh hơn so với gram âm Tác dụng kháng nấm yếu.Tính đặc hiệu cũng như mức

độ kháng khuẩn của các phân đoạn riêng biệt của flavonoid tỏ ra kém hơn so với flavonoid toàn phần Flavonoid toàn phần của dịch chiết xuất phát từ loài bọ mẩy có tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất Phối hợp flavonoid toàn phần của loài bạch đồng

nữ và xích đồng nam theo tỉ lệ 1:1 làm tăng khả năng kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gram âm Phối hợp flavonoid toàn phần của 3 loài trên theo tỉ lệ 1:1:1 làm tăng tác dụng kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gram dương

Năm 2001, Kim và cộng sự phân lập được hai chất phenyl propanoid

glycosides (acteosid và acteosid isomer) từ C trichotomum, có khả năng ức chế

mạnh enzyme integrase của virus HIV-1 với giá trị IC50 là 7,8±3,6µM và 13,7±6,0µM Năm 2004, Dorsaz và cộng sự phân lập được chất hydroquinone

diterpenoid mới từ lá C uncinatum Schinz, có hoạt tính kháng mạnh bào tử nấm

Theo kết quả nghiên cứu của Simonsen và cộng sự (2001), dịch chiết cồn của

thân, lá loài C.phlomidis ở Ấn Độ có hoạt tính chống kí sinh trùng sốt rét

Theo nghiên cứu của Aleykytty và cs (2010) và Leena and Aleykutty (2012)

dịch chiết rễ cây C Paniculatum Linn và C Infrtunatum Linn đều có khả năng diệt khuẩn in vitro đối với các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, Staphylococus aureus,

E coli và Klebsiella pneumoniae

Năm 2011, Leena and Aleykutty đã nghiên cứu dịch chiết lá cây C Paniculatum Linn khi sử dụng 05 dung môi khác nhau (ethyl acetate, alcohol, nước,

petroleum ether, chloroform) cho thấy, đối với vi khuẩn Vibrio parahaenolyticus cả năm dịch chiết đều có tác dụng diệt khuẩn in vitro Khi thử nghiệm trên vi khuẩn Salmonella newsport chỉ có 3 loại dịch chiết có tác dụng diệt khuẩn, còn dịch chiết

sử dụng dung môi petroleum ether, chloroform không thấy có tác dụng Riêng đối

với vi khuẩn E coli (O78) chỉ có dịch chiết sử dụng dung môi là nước và alcohol

mới có tác dụng diệt khuẩn

Kết quả nghiên cứu của Venkatarismam và cs (2012) cho thấy dịch chiết lá

cây C.philippinium Schauer có khả năng diệt khuẩn in vitro tốt ở nồng độ 100mg/ml trên cả 4 chủng vi khuẩn thử nghiệm E coli, S aureus, Bacillus và Klebsiella

Nghiên cứu của tác giả Anandhi và Ushadevi (2013) dịch chiết lá cây C Inerne L trong dung môi ethnol chỉ có tác dụng diệt khuẩn in vitro đối với vi khuẩn

P solanacearum và Xanthomonas citri, còn đối với vi khuẩn Salmonella typhi, Bacillus subtilis, K.pneumonia không có tác dụng diệt khuẩn

1.4 Bệnh viêm ruột tiêu chảy trên lợn con theo mẹ

Tiêu chảy là một hội chứng đa nguyên nhân (Trần Văn Huê, 2005; Nguyễn Thị Kim Lan và cs, 2006; Nguyễn Văn Sửu và Nguyễn Quang Tuyên, 2008; Nguyễn Văn Nguyên và Nguyễn Văn Sửu, 2011) thường xảy ra ở tất cả các lứa tuổi của lợn, nhưng tỷ lệ mắc bệnh, mức độ trầm trọng và tỷ lệ chết cao tập trung vào lợn con từ 4 tuần tuổi đến sau cai sữa 1 tháng Diễn biến tiêu chảy khá phức tạp (Nguyễn Văn Sửu và cs, 2008), nguyên nhân gây bệnh có thể do ký sinh trùng, vi rút (Tô Long Thành và Berbard, 2001; Lâm Thị Thu Hương, 2004; Thân Thị Đang

và cs, 2010) và vi khuẩn Đôi khi nhầm lẫn tiêu chảy do vi khuẩn với vi rút và ký sinh trùng do gần đây số vi khuẩn gây bệnh có khả năng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng (Phạm Khắc Hiếu, Bùi Thị Tho,1996; Cù Hữu Phú và cs, 2004) Trong hội chứng tiêu chảy của lợn con ở Việt Nam, các nghiên cứu đã xác

định có sự tham gia của 02 loại vi khuẩn chính là E coli, Salmonella (Đặng Xuân

Bình và Trần Thị Hạnh, 2001; Đỗ Trung Cừ và cs, 2003; Nguyễn Cảnh Dũng và Cù Hữu phú, 2011; Nguyễn Mạnh Phương và cs, 2012)

Một số nghiên cứu về vi khuẩn E coli gây hội chứng tiêu chảy

Theo nhiều nhà nghiên cứu khoảng 20 – 50% lợn con chết trong những ngày

sơ sinh do E coli gây nên, đôi khi tỷ lệ chết lên tới 10% (Niconxki V.V, 1986)

Để xác định vai trò của một E coli gây ra một bệnh nào đó, cần kiểm tra độc lực và các yếu tố gây bệnh mà chủng E coli đó có được Do vậy, kết quả những nghiên cứu về độc lực, yếu tố gây bệnh của E coli chính là đánh giá khả năng gây

bệnh của nó (Lê Văn Tạo và cs, 2002)

Cù Hữu Phú và cs (2004) đã kết luận, vi khuẩn E coli là nguyên nhân chính gây bệnh tiêu chảy của lợn con theo mẹ, các chủng E coli có thể mang tổ hợp các

yếu tố gây bệnh

Khi nghiên cứu về vai trò gây bệnh của vi khuẩn E coli trong hội chứng tiêu

chảy ở lợn 1- 60 ngày tuổi, tác giả Trương Quang (2005) đã kết luận 100% mẫu

phân lợn bị tiêu chảy phân lập được E coli với số lượng gấp 2,46 -2,73 lần (ở lợn 1-

21 ngày tuổi) và 1,88 -2,1 lần (ở lợn 22 -60 ngày tuổi) so với lợn không tiêu chảy

Tỷ lệ các chủng vi khuẩn E coli phân lập từ lợn bị tiêu chảy có độc lực mạnh và các

yếu tố gây bệnh cao hơn rất nhiều so với lợn không bị tiêu chảy Cụ thể yếu tố bám dính 93,33% so với 33,33%; khả năng dung huyết 53,33% so với 25,92%

Tìm hiểu nguyên nhân chủ yếu gây bệnh tiêu chảy lợn con, kết quả nghiên cứu của Hồ Soái và cs (2005) cho thấy, 100% mẫu phân lợn tiêu chảy phân lập

được E coli với số lượng gấp 2,37 lần (ở lợn 1-45 ngày tuổi) và gấp 2,31 lần (ở lợn

45 -60 ngày tuổi) so với lợn bình thường không tiêu chảy Độc lực của vi khuẩn E coli phân lập được gây chết chuột từ 50 – 100% sau 6 – 36 giờ

Một số nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella gây hội chứng tiêu chảy

Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn con theo mẹ thường ít gặp, nguyên

nhân là do trong máu của lợn có hàm lượng kháng thể cao được cung cấp bởi sữa đầu của lợn me và có hoạt động bảo hộ cho đến khi lợn con cai sữa (Bergeland, 1980)

Bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn Salmonella gây ra chủ yếu cho lợn con cai

sữa với các triệu chứng điển hình là nhiễm trùng huyết và viêm ruột ỉa chảy Vi khuẩn có thể gây bệnh cho lợn bởi nhiều Serotype có sãn trong tự nhiên, nhưng với

bệnh tiêu chảy của lợn con sau cai sữa thì chỉ phát hiện 2 Serotype là S.choleraesuis

và S Typhimurim Trong các chủng vi khuẩn Salmonella thường xuyên gây bệnh cho lợn thì S.choleraesuis chiếm 95%, S Typhimurim chiếm 4% và dưới 1% thuộc

về các chủng khác (Wilcock và Schwartz, 1992)

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Nội và cs (1989), có tới 82,8% đến 100%

số lợn tiêu chảy phân lập được vi khuẩn Salmonella gây bệnh Kết quả nghiên cứu

của Lê Văn Tạo và cs (1993) cho thầy từ 50 mẫu bệnh phẩm từ lợn tiêu chảy, đã

phân lập được 16 chủng Salmonella spp, trong đó có 8 chủng thuộc S.choleraesuis,

2 chủng thuộc S Enteritidis, 1 chủng thuộc S Typhimurim

Tác giả Cù Hữu Phú và cs (2004) khi nghiên cứu lợn tiêu chảy ở các cơ sở chăn nuôi tập trung của các tỉnh miền Bắc đã thấy tỷ lệ phân lập được vi khuẩn

Salmonella gây bệnh lên đến 80% số mẫu xét nghiệm

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Cây Mò hoa trắng

Cây Mò hoa trắng được thu hái tại xã Khánh Lợi, Yên Khánh, Ninh Bình Mẫu cây đã được PGS.TS Bùi Thị Tho giảng viên của Bộ môn Nội - Chẩn - Dược - Độc chất, Khoa Thú y, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam giám định

Cây được thu hái vào lúc cây sắp ra hoa vào tháng 8/2013

Cây được thu hái vào những ngày khô ráo, khoảng từ 7 – 10 giờ sáng

Cây tươi thu hái về được rửa dưới vòi nước sạch (2-3 lần) rồi rửa với nước cất, dược liệu chia thành ba bộ phận lá, thân, rễ được sấy khô ở 400C

Mẫu khô được nghiền thành bột mịn (<0,5mm)

Bột dược liệu đựng trong túi nilon bảo quản trong bình hút ẩm

2.1.2 Vi khuẩn thử nghiệm

+ Vi khuẩn E coli và Salmonella spp gây bệnh phân lập từ phân lợn con

theo mẹ bị viêm ruột tiêu chảy được cung cấp bởi Bộ môn Vi trùng Viện Thú y

+ Vi khuẩn E coli Top 10 chứa plasmid pJET 1.2/blunt có gen kháng ampicillin của hãng Fermetas (E coli Top 10 pJET 1.2/blunt) và vi khuẩn E coli Top 10 chứa plasmid pPS1 có gen kháng kanamycin của Cornell University (E coli Top 10 pPS1), được bảo quản trong tủ -800C, do Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật, Học viện Nông nghiệp Việt Nam cung cấp

2.1.3 Lợn con theo mẹ bị mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy

+ Lợn con theo mẹ lựa chọn trong thí nghiệm là những lợn con mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy đơn thuần không có biểu hiện triệu chứng của các bệnh truyền nhiễm

2.1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: Từ tháng 10/2013 đến tháng 09/2013

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm bộ môn Ngoại Sản Khoa Thú Y,

Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật Khoa CNSH

2.1.5 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, môi trường

Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị sử dụng trong quá trình thí nghiệm gồm có:

- Buồng cấy vô trùng, nồi hấp khử trùng, tủ sấy, tủ ấm, cân phân tích, máy

nghiền, máy ly tâm, máy cô quay chân không, máy đo mật độ quang

- Các dụng cụ thủy tinh dùng trong quá trình thí nghiệm gồm có: bình tam

giác 100ml, 250ml, cốc thủy tinh loại 100ml, loại 250ml, đĩa petri đường kính 10

cm, pipet, đũa thủy tinh, lọ đựng mẫu, giá thí nghiệm, bình đựng mức 10ml, 100ml…

- Các dụng cụ khác: giấy lọc, vải màn, phễu lọc

Hóa chất

+ Các dung môi chiết xuất: ethanol 35%, ethanol 70%, axit acetic 5% và

aceton 70%

+ Giấy tẩm kháng sinh do công ty TNHH Nam Khoa sản xuất

+ Dung môi pha chất tan: Dimethyl sulfoxide (DMSO)

+ Môi trường Luria–Bertani (LB) dạng lỏng, được hấp khử trùng trong các

bình tam giác

+ Môi trường LB rắn, được hấp tiệt trùng để nguội tới 400- 500C, đổ vào đĩa petri có đường kính 10 cm, với độ dày là 4 ± 0,2 mm

2.2 Nội dung nghiên cứu

+ Làm kháng sinh đồ kiểm tra tính mẫn cảm của vi khuẩn với các kháng sinh thông dụng

+ Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết rễ, thân, lá cây Mò hoa trắng sử dụng dung môi ethanol 70% trên vi khuẩn E coli và Salmonella spp., phân

lập từ phân lợn con theo mẹ bị viêm ruột tiêu chảy

+ Thu dịch chiết thân cây Mò hoa trắng trong các dung môi khác nhau và đánh giá hiệu suất chiết xuất

+ Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng

chiết trong các dung môi khác nhau

- Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng đối với vi khuẩn E coli và Salmonella spp phân lập được từ phân lợn con theo mẹ

bị viêm ruột tiêu chảy

- Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa trắng trong dung môi ethanol 35% trên E coli chứa plasmid có gen kháng kháng sinh

- + Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa

trắng trong dung môi ethanol 35% khi pha loãng

- + Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thân cây Mò hoa

trắng trong dung môi ethanol 35% theo thời gian bảo quản

- + Điều trị thử nghiệm điều trị trên lợn con theo mẹ bị viêm ruột tiêu chảy

2.3 Phương pháp nghiên cứu

+ Thu dịch chiết lá, thân, rễ cây Mò hoa trắng: Bột lá, thân, rễ cây Mò hoa

trắng được chiết với ethanol 70%, bột thân cây Mò hoa trắng còn được chiết bằng các dung môi khác nhau (ethanol 35%, ethanol 70%, axit acetic 5% và aceton 70%) bằng phương pháp ngâm chiết ở nhiệt độ phòng với cùng một tỷ lệ (20g bột khô/200ml dung môi), mỗi ngày được lắc đảo 2 lần Sau 72 giờ thu dịch chiết lọc

qua vải màn và giấy lọc Whatman No.1 Thu dịch chiết đem cô quay hút chân không để loại bỏ hoàn toàn dung môi, tới khi khối lượng của bình cô quay không đổi Cao cô toàn phần đã loại bỏ hết dung môi bảo quản ở 40C Lấy 1g cao cô toàn phần pha với 10ml Dimethyl sulfoxide (DMSO), dùng đũa thủy tinh khuấy tan hoàn toàn ta được dung dịch có nồng độ 100mg/ml

+ Nuôi cấy vi khuẩn E coli, Salmonella spp trên môi trường rắn và lỏng

Vi khuẩn được cấy vạch trong môi trường LB đặc, trên đĩa petri ủ 370C/24 giờ, chọn khuẩn lạc đơn điển hình Khuẩn lạc đơn được nuôi cấy trong bình tam giác với môi trường LB lỏng, ủ ở 370C, với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 12 - 14h; thu dịch khuẩn (mật độ vi khuẩn phải đạt 108 tế bào/ml là đạt chuẩn)

+ Xác định mật độ vi khuẩn

Mật độ vi khuẩn sau khi nuôi cấy trong môi trường LB lỏng được xác định theo phương pháp đo mật độ quang ở λ= 600ɳm

Mật độ vi khuẩn được xác định theo công thức:

[Số tế bào/ml] = OD600x(Hệ số chuyển đổi)x(Hệ số pha loãng)

Trong đó: OD600 giá trị đo được ở bước sóng: λ=600 nm

Hệ số chuyển đổi được mặc định là: 5x108

+Kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn thí nghiệm bằng phương pháp kháng sinh đồ khuyếch tán trên đĩa thạch và đánh giá kết

quả theo tiêu chuẩn CLSI 2010 (Bảng 3.3)

+ Kiểm tra tác dụng diệt khuẩn của các dịch chiết bằng phương pháp kháng sinh đồ khuyếch tán trên đĩa thạch của Kirby-Bauer

Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng Khi mật độ vi khuẩn đạt

108 tế bào/ml, lắc đều bình chứa vi khuẩn, dùng pipetman hút 100µl canh khuẩn nhỏ vào giữa đĩa thạch, dùng que thủy tinh tráng đều cho đến khi mặt thạch khô Sau 15 phút đục lỗ trên mặt thạch với đường kính 6mm/lỗ, đục cách nhau khoảng 30mm Mỗi lỗ thạch, nhỏ 100µl dịch chiết, đặt đĩa vào tủ ấm ở 370C/24 giờ đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn, rồi tính số bình quân

Bảng 2.3 Bảng tiêu chuẩn đánh giá khả năng mẫn cảm và kháng thuốc

của vi khuẩn [tiêu chuẩn CLSI 2010]

Giới hạn đường kính vùng ức chế (mm)

+ Pha loãng các nồng động cao: Chuẩn bị sẵn 10 ống nghiệm sạch, vô trùng,

cho vào mỗi ống 5 ml DMSO, đánh số thứ tự từ 1 đến 10 Ống nghiệm 1, được cho thêm 5ml dung dịch cao lỏng nồng độ 100mg/ml

Trộn đều dịch chiết trong ống nghiệm 1, sau đó hút 5 ml chuyển sang ống nghiệm 2, trộn đều; chuyển tiếp 5 ml từ ống nghiệm 2 sang ống nghiệm 3, trộn đều;… đến ống nghiệm thứ 10, trộn đều và bỏ đi 5 ml

Hình 2.1 Hệ nồng độ pha loãng cao đặc để xác định nồng độ tối thiểu tác dụng

trên vi khuẩn thử nghiệm

+ Phương pháp điều trị thử nghiệm

Lô 1 (30 lợn con) được điều trị bằng thuốc kháng sinh gentamycin theo phác

đồ (phác đồ I): gentamycin 5 mg/kg thể trọng, cho uống ngày 2 lần Vitamin B1 2,5% 5ml/con/ngày tiêm bắp Hộ lý chăm sóc để chuồng trại khô ráo, thoáng mát, sạch sẽ, cung cấp đủ nước sạch, không cho lợn mẹ ăn thức ăn chứa chất tanh cho tới khi lợn con khỏi bệnh)

Lô 2 (30 lợn con) được điều trị theo phác đồ (phác đồ II): bằng dịch chiết thân cây Mò hoa trắng sử dụng dung môi ethanol 35% với liều lượng 25mg/kg thể trọng, các thuốc bổ trợ, thời gian điều trị, chế độ hộ lý chăm sóc nuôi dưỡng giống như phác đồ I Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ khỏi (phân lợn thành khuôn, các chỉ tiêu lâm sàng (thân nhiệt, tần số hô hấp và tần số tim đập) trở lại bình thường)

và thời gian điều trị

2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần Số liệu thu được

xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Excel 2007