Nghiên cứu sự biểu hiện protein nucleocapsid của vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trên vi khuẩn e coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGUYỄN THỊ VÂN ANH NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN NUCLEOCAPSID CỦA VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRÊN VI KHUẨN E. COLI LUẬN VĂN THẠC SĨ Hµ Néi - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGUYỄN THỊ VÂN ANH NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN NUCLEOCAPSID CỦA VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRÊN VI KHUẨN E. COLI CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ : 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. NGUYỄN THỊ MINH HUYỀN 2. TS. NGUYỄN HỮU ðỨC Hµ Néi - 2013 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố trong bất kì công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Vân Anh Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành ñến TS. Nguyễn Thị Minh Huyền Phòng Công nghệ Tế bào ðộng Vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và TS. Nguyễn Hữu ðức Phó trưởng Khoa Công nghệ sinh học, Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội ñã tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Với tình cảm sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Quang Huấn Trưởng phòng Công nghệ Tế bào ðộng Vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng toàn thể cán bộ nghiên cứu trong phòng ñã ñã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn các Thầy Cô trong khoa Công nghệ sinh học, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã truyền ñạt cho tôi kiến thức trong quá trình học tập. ðể thực hiện ñược nghiên cứu này, tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ từ ñề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam hướng Công nghệ sinh học với mã số ñề tài VAST02.02/12-13. Cuối cùng, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới gia ñình, bạn bè ñã luôn quan tâm, cổ vũ cho tôi vững bước trên con ñường học tập và nghiên cứu. Hà Nội, tháng 9 năm 2013 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Vân Anh Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv MỤC LỤC Lời cam ñoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục bảng vii Danh mục hình viii PHẦN 1 ðẶT VẤN ðỀ 1 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Giới thiệu chung về PRRS 3 2.1.1 Khái quát về PRRS 3 2.1.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 6 2.1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước 11 2.1.4 Tình hình dịch Tai xanh ở Việt Nam 16 2.2 Protein Nucleocapsid 20 2.3 Biểu hiện gen ở vi khuẩn E.coli 20 2.3.1 Biểu hiện gen ở vi khuẩn E.coli 20 2.3.2 Vector biểu hiện 22 2.3.3 Cơ chế cảm ứng biểu hiện bằng IPTG 27 PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1 Vật liệu 29 3.1.1 Sinh phẩm 29 3.1.2 Mồi 29 3.1.3 Hóa chất 29 3.1.4 Kháng sinh và các môi trường sử dụng 29 3.1.5 ðệm và dung dịch 30 3.2 Phương pháp nghiên cứu 30 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v 3.2.1 Tạo vector biểu hiện 30 3.2.2 Khảo sát ñiều kiện biểu hiện gen ORF7 mã hóa protein N của vi rút PRRS 36 3.2.3 Phương pháp kiểm tra ñộ hòa tan của protein N và tối ưu hóa ñiều kiện biểu hiện của protein N 38 3.2.4 Phương pháp tinh sạch protein N tái tổ hợp (Hochuli và cs, 1988) 39 3.2.5 Phương pháp ELISA (Rosalyn Yalow, 1971) 40 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 4.1 Kết quả tạo và chọn lọc vector tái tổ hợp mang ñoạn gen ORF7 41 4.1.1 Kết quả tạo vector tái tổ hợp mang ñoạn gen ORF7 41 4.1.2 Kết quả chọn lọc vector tái tổ hợp mang ñoạn gen ORF7 44 4.2 Khảo sát sự biểu hiện của gen ORF7 trong E.coli BL21 46 4.2.1 Biểu hiện gen ORF7 trong E.coli BL21(DE3) 46 4.2.2 Kết quả khảo sát ñiều kiện biểu hiện của protein N 49 4.2.3 Kết quả kiểm tra ñộ hòa tan của protein Nucleocapsid 53 4.3 Kết quả tinh sạch protein tái tổ hợp 55 4.4 Kết quả kiểm tra hoạt tính của protein tái tổ hợp 57 4.4.1 Kết quả phản ứng ELISA 57 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 KẾT LUẬN 59 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC, BÀI BÁO CÓ LIÊN QUAN ðẾN LUẬN VĂN 65 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ARN Acid ribonucleic ATP Acid adenosin triphosphat bp Base pair (cặp base nitơ) CBB Coomasie Brilliant Blue dNTP Deoxyribonucleotide DBB Denaturing binding buffer DNA Acid Deoxyribo Nucleic DWB Denaturing wash buffer E. coli Escherichia coli ELISA Enzyme Linker Immuno Sorbent Assay EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid EtBr Ethidium Bromide GB1 G protein Domain B1 GST Glutathione-S -Transferase IPMA Immunoperoxidase Monolayer Assay IPTG Isopropyl β- D- 1- Thiogalactopyranoside kDa Kilo Dalton LB Luria Broth MVL Modified live virus MBP Maltose Binding Protein OD Optical Dentisy ORF Open Reading Frame PCR Polymerase Chain Reaction PRRS Porcine Reproductive And Respiratoy Syndrome TBS Tris-buffered saline TAE Tris acetic acid- EDTA TE Tris EDTA TRX Thioredoxin Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1 Thành phần phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn 31 3.2 Thành phần hỗn hợp phản ứng gắn DNA 33 3.3 Thành phần phản ứng PCR 35 3.4 Thành phân gel phân tách: 37 3.5 Thành phần gel cô mẫu 38 4.1 Bảng dự kiến khối lượng protein ñược tổng hợp 49 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Hình ảnh ñại thực bào khi bị PRRS xâm nhập 3 2.2 Hình ảnh ñại thực bào chưa bị PRRS xâm nhập 3 2.3 Sơ ñồ hệ gen của vi rút PRRS 6 2.4 Sơ ñồ Sự hình thành cầu nối disuldide trong chu chất ở E. coli . 22 2.5 Sơ ñồ quá trình cắt protein fusion ra khỏi protein mục tiêu 27 2.6 Sơ ñồ cơ chế ñiều hòa của T7 promotor 28 4.1 Sơ ñồ tạo vector tái tổ hợp 41 4.2 ðiện di ñồ sản phẩm PCR với cặp mồi MHF/R 42 4.3 ðiện di ñồ kết quả cắt mở vòng 5 vector biểu hiện 43 4.4 ðĩa khuẩn lạc biến nạp sản phẩm lai giữa ñoạn gen ORF7 và các vector biểu hiện vào tế bào khả biến E. coli DH 5α. 45 4.5 ðiện di ñồ sản phẩm PCR từ khuẩn lạc sau biến nạp các vector tái tổ hợp mang gen ORF7 46 4.6 ðĩa khuẩn lạc khi biến nạp các vector tái tổ hợp vào E. coli BL21 47 4.7 ðiện di protein kiểm tra các mẫu biểu hiện trong 5 hệ thống vector tái tổ hợp 48 4.8 Ảnh hưởng của nồng ñộ IPTG ñến sự biểu hiện của protein tái tổ hợp 50 4.9 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn trước khi cảm ứng ñến sự biểu hiện của protein tái tổ hợp 51 4.10 Ảnh hưởng thời gian thu mẫu sau cảm ứng ñến sự biểu hiện của protein tái tổ hợp 52 4.11 ðiện di protein kiểm tra ñộ hòa tan của protein tái tổ hợp trong các hệ thống vector khi biểu hiện ở 37 o C 53 4.12 ðiện di protein kiểm tra ñộ hòa tan của protein tái tổ hợp trong các hệ thống vector khi biểu hiện ở 30 o C 54 4.13 ðiện di protein Nucleocapsid sau khi tinh sạch qua cột Ni-NTA 56 4.14 Biểu ñồ kết quả xác ñịnh khả năng nhận biết và gắn kết của phức hệ kháng nguyên kháng thể bằng kỹ thuật ELISA 58 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 1 PHẦN 1. ðẶT VẤN ðỀ Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên lợn (Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome – PRRS) lần ñầu tiên ñược phát hiện Bắc Mĩ tại Hoa Kì và Canada năm 1987, vài năm sau ñó là ở các nước châu Âu, xuất hiện ở châu Á năm 1991 (Kaffaber K, 1999). Năm 1997 vi rút PRRS ñược phát hiện ở Việt Nam trên ñàn lợn nhập từ Mỹ. Gần ñây các ổ dịch xảy ra tại Thụy ðiển, Nam Phi, Nga, Trung Quốc và Việt Nam với chủng ñộc lực cao, diễn biến ngày càng phức tạp. Năm 2007, dịch PRRS chính thức ñược công bố tại tỉnh Hải Dương của nước ta và từ ñó ñến nay dịch vẫn liên tục xảy ra ở nhiều ñịa phương trên cả nước. Chính vì vậy việc chẩn ñoán sớm các ổ dịch là vấn ñề quan trọng giúp ngăn cản sự biến chủng và sự lan truyền của vi rút PRRS. Vi rút PRRS ñược phân lập và ñịnh danh vào năm 1991, chuỗi hệ gen ñầy ñủ ñược xác lập vào năm 1993. Bộ gen của vi rút PRRS dài khoảng 15kbp bao gồm 9 ORF (Open Reading Frame), trong ñó ORF1a và ORF1b mã hóa protein polymerase (GP1a và GP1b), ORF2a, ORF2b, ORF3 và ORF4 mã hóa các protein chức năng. ORF5 mã hóa protein GP5 (25kDa) là glycoprotein vỏ ngoài, ORF6 mã hóa protein M (18kDa) là protein vỏ ngoài, ORF7 mã hóa protein N (15kDa) là protein cấu trúc (Dea và cs, 2000; Mengeling W.L và cs, 1996; Yoon K.J và cs, 1995). Trong 3 protein cấu trúc thì protein N (15kDa) là protein cơ bản nhất ñược phát hiện với lượng lớn trong các tế bào bị nhiễm, chiếm khoảng 20 – 40% lượng protein có trong hạt vi rút (Mengeling W.L và cs, 1996) và protein N là protein gây ñáp ứng kháng thể sớm nhất (Plana-Duran J và cs, 1997), hầu hết những xét nghiệm chẩn ñoán bệnh PRRS chủ yếu là phát hiện kháng thể kháng lại protein này (Meteu E và cs, 2008). Hiện nay, việc chẩn ñoán sớm hội chứng PRRS thường sử dụng Kit ELISA HerdCheck 2XR (IDEXX) của Mỹ, ñây ñược coi là tiêu chuẩn vàng ñể phát hiện kháng thể kháng vi rút PRRS có ñộ nhạy cao, ñặc hiệu và nhanh chóng. Phương pháp này có thể phát hiện ñược kháng thể kháng vi rút PRRS trên lợn sau 9 ngày nhiễm , tuy nhiên Kit ELISA này có giá thành khá ñắt. Ở nước ta việc chẩn ñoán [...]... phù h p Nghiên c u s Vi t Nam, chúng tôi ti n hành ñ tài: bi u hi n protein Nucleocapsid c a vi rút gây h i ch ng r i lo n sinh s n và hô h p l n trên vi khu n E coli. ” M c tiêu: ðưa ñư c gen ORF7 mã hóa protein Nuclecapsid c a vi rút PRRS vào các vector bi u hi n, thu nh n s bi u hi n c a các protein tái t h p trong các h th ng vector và tinh s ch protein tái t h p N i dung nghiên c u: T o 5 vector... c a vi rút PRRS nguyên th y: VR2332 (dòng B c M ) hay Lelystad (dòng Châu Âu) (Mardassi H và cs, 1996) Protein Nucleocapsid (N) mang tính kháng nguyên cao và là protein ña d ng trong h t vi rút (Costers S và cs, 2009) Protein N là protein cơ b n nh t c a vi rút, ñư c phát hi n v i lư ng l n trong các t bào b nhi m và chi m kho ng 20 – 40% lư ng protein có trong h t vi rút Protein N là protein gây ñáp... a protein tái t h p, giúp tinh s ch protein tái t h p m t cách d dàng, nh n di n các phân t protein m c tiêu và làm tăng kh năng bi u hi n c a protein tái t h p Trong nghiên c u này chúng tôi s d ng b n protein fusion: Maltose Binding Protein (MBP), G protein Domain B1 (GB1), Thioredoxin (Trx) và Glutathione-S -Transferase (GST) Maltose Binding Protein (MBP) là m t protein thu c h maltose c a Escherichia... Lan là do vi c s d ng tinh l n nh p n i ñã b nhi m vi rút PRRS ho c là do các ñàn nh p n i mang vi rút PRRS Mengeling và cs (1996), Mengeling và cs (1998) nghiên c u v vaccine ch ng l i PRRS Kh ng ñ nh vi rút vaccine kích thích ñáp ng mi n d ch ch m, vi rút vaccine có th truy n qua nhau thai, truy n t con ñư c tiêm vaccine sang con không tiêm vaccine Vezina và cs (1996), Yoon và cs (1995) ñã nghiên c... và dòng B c M gây ra PRRS Tác gi ñã ñ t tên cho vi rút gây ra PRRS Châu Âu là Lelystad Benfield (1992) ñã mô t , ñ t tên cho vi rút gây b nh B c M là VR- 2332 và ñưa ra ñ c tính c a PRRSV như s c ñ kháng c a PRRSV Tác gi kh ng ñ nh PRRSV thích h p pH t 6,5- 7,5 Benfield (1992); Saito (1996) ñã kh ng ñ nh vi rút gây PRRS có quan h h hàng g n v i vi rút vi m ñ ng m ch ng a, vi rút tăng enzyme lactate... c m (Open reading frame – ORF) C u trúc vi rút bao g m 2 gen mã hóa cho các protein không c u trúc (Nsp – non-structure protein) và b y gen mã hóa cho các protein c u trúc và ch c năng (structure protein gene) ORF1a và ORF1b là các gen mã hóa protein không c u trúc – chi m kho ng 75%, kích thư c phân t nh , có ho t tính sao chép và polymerase ORF1a ñư c d ch tr c ti p trong khi ORF1b ñư c d ch b i... nhóm C và G vi khu n Streptococcus gi ng như Protein A nhưng v i ñ c ñi m khác nhau Protein G mi n B1 có kh i lư ng phân t 6,2kDa, nhi u protein khi bi u hi n trong E. coli không hòa tan ñã tr nên hòa tan khi h p nh t v i mi n GB1 (http://en.wikipedia.org/wiki /Protein_ G) Hình 2.5 Sơ ñ quá trình c t protein fusion ra kh i protein m c tiêu (Ngu n: http://en.wikipedia.org/wiki/Maltose-binding _protein) 2.3.3... (EU) và dòng B c M (NA) tương ng là 14934 và 15412 nucleotide Cũng gi ng như các nhà nghiên c u trư c ñây v c u trúc h gen PRRSV, h gen c a vi rút PRRS Thái bao g m: 2 vùng không phiên mã (ñ u 5’- và ñuôi 3’-), 8 ORF, trong ñó 2 gen không c u trúc là ORF1a và ORF1b (Nsp – Nonstructure protein) và ORF2 – 7 là các gen mã hoá protein c u trúc D a trên trình t h gen, cây ph h di truy n cho th y trong 2 ch... o 5 vector tái t h p pET28a/ORF7, pSV278/ORF7, pET30GB1/ORF7, pGEX4T1/ORF7, pET28TRX/ORF7 mang ño n gen ORF7 mã hóa cho protein Nucleocapsid c a vi rút PRRS Bi u hi n và kh o sát các ñi u ki n bi u hi n: N ng ñ IPTG, m t ñ vi khu n, nhi t ñ và th i gian thu m u có kh năng nh hư ng t i s bi u hi n ño n gen ORF7 trong vi khu n E coli BL21 (DE3) Ki m tra ñ hòa tan và tinh s ch protein tái t h p Ki m tra... các ch ng vi rút PRRS có s khác bi t di truy n ñáng k , ñó là 2 ch ng g c nguyên th y Châu Âu (lo i I, ñi n hình là vi rút Lelystad –EU type) và B c M (lo i II, vi rút VR-2332 – NA type) – là hai nguyên m u c a vi rút PRRS (Andreyev V G và cs, 1997) Hai ki u gen khác nhau – hai bi n ch ng vi rút PRRS B c M và châu Âu gây ra các h i ch ng lâm sàng tương t nhau, nhưng chúng th hi n 2 ki u gen riêng bi . Nucleocapsid của vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trên vi khuẩn E. coli. ” Mục tiêu: ðưa ñược gen ORF7 mã hóa protein Nuclecapsid của vi rút PRRS vào các vector biểu hiện, . NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN NUCLEOCAPSID CỦA VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRÊN VI KHUẨN E. COLI CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ. Tình hình nghiên cứu trong nước 11 2.1.4 Tình hình dịch Tai xanh ở Vi t Nam 16 2.2 Protein Nucleocapsid 20 2.3 Biểu hiện gen ở vi khuẩn E. coli 20 2.3.1 Biểu hiện gen ở vi khuẩn E. coli 20