PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.2.Kết quả chọn lọc vector tái tổ hợp mang ựoạn gen ORF
Sau khi biến nạp sản phẩm lai vào tế bào vi khuẩn Ẹ coli chủng DH5α, nhờ
sự trợ giúp của bộ máy tổng hợp trong tế bào, các vector tái tổ hợp ựược nhân lên với số lượng lớn. Dịch tế bào ựược cấy trải trên môi trường LB ựặc có bổ sung
kháng sinh chọn lọc, ủ ở 370C qua ựêm nhằm chọn lọc các chủng mang vector tái tổ
Hình 4.4. đĩa khuẩn lạc biến nạp sản phẩm lai giữa ựoạn gen ORF7 và các vector biểu hiện vào tế bào khả biến Ẹ coli DH5α.
Trên 5 ựĩa biến nạp ựều thấy xuất hiện những dòng khuẩn lạc mọc riêng rẽ. Những khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc sẽ ựược kiểm tra sự gắn gen mong muốn bằng cách PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với mồi của gen MHF/R. Mỗi ựĩa biến nạp vector tái tổ hợp chọn ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc ựể tiến hành phản ứng PCR. Kết quả cho thấy sản phẩm PCR từ hầu hết các khuẩn lạc ựược chọn là 1 băng ựặc hiệu rõ nét, kắch thước khoảng 390 bp trùng với kắch thước của gen ORF7 ựã cài vào 5 vector biểu hiện (hình 4.5). Kết quả chọn dòng ựã ựược khẳng ựịnh lại bằng cách ựọc trình tự của gen. Kết quả giải trình tự cho thấy gen ựược chèn vào ựúng là ựoạn gen ORF7 ựã ựược thiết kế với trình tự như sau:
atgccaaataac aacggcaagc agcaaaagaa aaagaagggg aatggccagc cagtcaatca gctgtgccaa atgctgggta agatcatcgc ccaacaaaac cagtccagag gcaagggacc ggggaagaaa aataggaaga aaaacccgga gaagccccat ttccctctag cgactgaaga tgacgtcagg catcacttta cccctagtga gcggcaattg tgtctgtcgt cgatccagac tgccttcaat cagggcgctg gaacttgtgc cctgtcagat tcagggagga taagttacac tgtggagttt agtttgccga cgcaacatac tgtgcgtctg atccgcgcca cagcatcacc ctcagcatga
Hình 4.5. điện di ựồ sản phẩm PCR từ khuẩn lạc sau biến nạp các vector tái tổ hợp mang gen ORF7
(M: Maker DNA 1 kb của Fementas; 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15: Sản phẩm PCR của khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pET28a, pSV278, pET30GB1, pGEX4T1,
pET28TRX)
Như vậy chúng tôi ựã thiết kế và chọn lọc thành công các dòng vector tái tổ hợp mang ựoạn gen ORF7 mong muốn. Các dòng vector ựược chọn sẽ biến nạp vào
vi khuẩn Ẹ coli chủng BL21 ựể kiểm tra khả năng biểu hiện.