PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1.Tạo vector biểu hiện
đoạn gen mã hóa protein N (ORF7) của vi rút PRRS ựã ựược gắn vào
vector tách dòng pUC57 và thiết kế có hai ựầu dắnh với 2 enzyme giới hạn BamHI
và XhoỊ đoạn gen này ựược cắt với hai enzyme trên sau ựó ựược gắn vào các
vector biểu hiện pET28a, pSV278, pET30GB1, pGEX4T1, pET28TRX ựã ựược
cắt mở vòng cùng 2 enzyme ựó theo phương pháp gắn gen truyền thống với
enzyme T4 ligasẹ
Các vector tái tổ hợp sẽ ựược biến nạp và chọn dòng trong tế bào Ẹ coli
DH5α. Kết quả chọn dòng ựược khẳng ựịnh bằng phương pháp ựọc trình tự (gửi tại
công ty M acrogen, Hàn Quốc). Các vector biểu hiện ựã chọn lọc ựược biến nạp vào
tế bào Ẹ coli BL21 ựể biểu hiện gen.
3.2.1.1. Phương pháp cắt DNA (Scheller và cs, 1997) Nguyên tắc:
Phương pháp cắt DNA dựa vào khả năng nhận biết và cắt các trình tự ựặc hiệu từ 4 - 8 bp của các enzyme cắt giới hạn ựể cắt các ựoạn DNA ở vị trắ xác ựịnh, tạo thành những ựoạn DNA có ựầu bằng hoặc ựầu dắnh, có kắch thước xác ựịnh ựể làm nguyên liệu và kiểm tra trong phản ứng gắn.
Cách tiến hành:
Trong ựề tài sử dụng các enzyme cắt: BamHI, XhoỊ Chế phẩm enzyme
thường ựược pha trong dung dịch ựệm với thành phần và pH môi trường thắch hợp cho hoạt ựộng của enzymẹ
Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt DNA trong plasmid pUC57 và phản ứng
cắt mở vòng 5 vector biểu hiện bằng enzyme giới hạn BamHI và XhoỊ Toàn bộ hỗn
hợp ựược giữ ở 37oC trong vòng 4h.
Bảng 3.1. Thành phần phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn
Thành phần Thể tắch (ộl)
DNA plasmid (3ộg/ộl) 15
Buffer 05
BamHI/ XhoI 03
H2O 27
Tổng thể tắch 50
3.2.1.2. Phương pháp ựiện di DNA trên gel agarose (Kirkpatrick, 1990) Nguyên tắc:
DNA tắch ựiện âm có khả năng chuyển ựộng trong ựiện trường theo chiều từ cực âm ựến cực dương. Tốc ựộ chuyển ựộng của chúng trong ựiện trường có hiệu ựiện thế không ựổi phụ thuộc hai yếu tố dạng tồn tại của DNA và kắch thước DNẠ Các DNA có kắch thước càng lớn thì chuyển ựộng càng chậm. Trong một phạm vi nhất ựịnh của nồng ựộ gel agarose, kắch thước phân tử tuyến tắnh với quãng ựường dịch chuyển của DNA trên gel agarosẹ Thường các ựoạn gen có kắch thước từ 300- 10.000 bp có thể ựược phân tách trên gel agarose 0,8%.
DNA trên gel agarose ựược phát hiện bằng cách nhuộm với Ethidium Bromide (EtBr) và quan sát dưới tia UV.
Cách tiến hành:
Chuẩn bị gel agarose 0,8%: cân 0,8g bột agarose hòa vào dung dịch ựệm
TAE 1X. đun nóng cho agarose tan hoàn toàn. để nguội xuống khoảng 500C, ựổ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
vào khuôn ựã ựặt sẵn răng lược với ựộ dày thắch hợp. để bản gel ựông lại và ổn ựịnh hoàn toàn. Gỡ lược ra, ựặt bản gel vào bể ựiện di chứa sẵn dung dịch ựệm TAE
1X sao cho ựệm ngập hoàn toàn bản gel. Tra mẫu: lấy 1 thể tắch dung dịch chứa DNA thắch hợp (chứa khoảng 1-2ộg DNA), trộn với màu và tra vào các giếng của
bản gel.điện di: chạy ựiện di ở hiệu ựiện thế cố ựịnh 100V, quan sát sự di chuyển
của màu ựể biết khi nào thì dừng lạị Thông thường sẽ dừng lại khi chất chỉ thị màu chạy ựược khoảng 2/3 chiều dài bản gel.
Phát hiện các băng DNA: bản gel ựược lấy nhẹ ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng ựộ 2 ộg/ml trong khoảng 5 phút, sau ựó lấy bản gel ra tráng qua nước cất rồi quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại có bước sóng 360 nm.
3.2.1.3. Phương pháp thu ựoạn DNA từ gel agarose Nguyên tắc:
đề tài sử dụng Kit thu ựoạn DNA từ gel agarose của hãng fermentas. Phương pháp dùng các dung dịch ựệm khác nhau ựể gắn DNA lên màng và giải hấp DNẠ
Cách tiến hành:
Mẫu DNA sau khi ựiện di trên gel agarose ựem soi dưới ánh sáng tử ngoại và
cắt thu băng quan tâm, xác ựịnh khối lượng miếng gel ựã cắt, bổ sung ựệm QG theo
tỷ lệ 300ộl/100 mg gel ựã cắt. Ủ ở 50oC, 10 phút, trong quá trình ủ ựảo ống 2-3 lần.
Chuyển dịch sang cột thôi gel và ly tâm tốc ựộ 12.000v/p trong 1 phút, loại dịch ly tâm. Bổ sung 500ộl ựệm QG và ly tâm 12.000v/p trong 1phút. Rửa cột bằng 750ộl ựệm PE và ly tâm 1 phút. Loại dịch và ly tâm thêm 1 phút ựể loại hoàn toàn dịch.
Chuyển cột sang ống ependof mới và bổ sung 30-50ộl H2O, ựể ở nhiệt ựộ phòng 2
phút. Ly tâm 12.000v/p, 1 phút, thu dịch.
3.2.1.4. Phương pháp gắn DNA (Struhl, 1985) Nguyên tắc:
Do khả năng xúc tác hình thành liên kết giữa nhóm 5Ỗ Ờ phosphate và 3Ỗ Ờ
OH tự do nên enzyme T4 DNA ligase có thể gắn nối hai phần từ DNA có ựầu dắnh
Cách tiến hành:
Bảng 3.2. Thành phần hỗn hợp phản ứng gắn DNA
Thành phần phản ứng Thể tắch
T4 DNA ligase buffer 10x 02ộl
Vector ựã mở vòng (3ộg/ộl) 03ộl
đoạn gen (2ộg/ộl) 07ộl
T4 DNA ligase 01ộl
H2O 07ộl
Tổng thể tắch 20ộl
Cho ựệm, vector ựã mở vòng, ựoạn gen vào ống eppendoft trộn nhẹ nhàng.
Enzyme cho vào sau cùng. Hỗn hợp phản ứng ựuợc ủ ở 16oC qua ựêm.
3.2.1.5. Phương pháp biến nạp plasmid vào Ẹ coli (Hanahan, 1983) Nguyên tắc:
Dưới vào tác dụng của CaCl2, thành tế bào ựang ở thời kỳ sinh trưởng trở nên (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
xốp, tạo ựiều kiện cho DNA có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi sốc nhiệt.
Cách tiến hành:
Chuẩn bị tế bào khả biến: chủng tế bào ựược cất giữ ở -75oC cấy vạch tế bào
trên ựĩa môi trường LB ựặc, ủ ựĩa cấy qua ựêm ở 37oC. Nhặt một khuẩn lạc nuôi
cấy trong 2ml môi trường LB lỏng. Cấy chuyển 2% dịch nuôi tế bào qua ựêm ở
37oC, 200v/ph trong 90 phút ựến mật ựộ ựạt 0,5-0,7. Chuyển dịch 1,5 ml dịch tế bào
sang ống eppendoft vô trùng, ựể trên ựá 10 phút, ly tâm thu sinh khối (5000v/ph,
4oC trong 10 phút). Loại dịch nổi và hòa tan cặn tế bào trong 300ộl CaCl2 100mM,
100mM, búng nhẹ cho tan hết tế bàọ để ống tế bào trong ựá trước khi sử dụng khoảng 30 phút.
Biến nạp vào Ẹ coli bằng phương pháp sốc nhiệt: Bổ sung hỗn hợp dung
dịch phản ứng ligase vào ống eppendoft chứa 60 ộl tế bào khả biến, ựặt trên ựá 30
phút.Sốc nhiệt ở 42oC, 60 giây, sau ựó ựặt ngay ống tế bào vào ựá và ựể 2 phút.Bổ
sung 250ộl môi trường LB, nuôi lắc (200 v/ph) ở 37oC trong 1 giờ. Cấy trải 150 ộl
dịch tế bào nuôi cấy trên ựĩa petri có môi trường thạch LB chứa kháng sinh chọn
lọc. Nuôi ở tủ ấm ở 370C qua ựêm.
3.2.1.6. Tách chiết plasmid của vi khuẩn Ẹ Coli (Birnboim and Doly, 1979) Nguyên tắc:
Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid là một bước thắ nghiệm quan trọng trong các nghiên cứu nhân dòng phân tử cũng như trong hàng loạt nghiên cứu khác của lĩnh vực sinh học phân tử. Các plasmid thường ựược tinh sạch từ môi trường nuôi cấy dịch thể ựược chuẩn bằng cách nuôi cấy một khuẩn lạc ựơn mang plasmid. Có nhiều phương pháp ựược sử dụng ựể tách chiết plasmid như sử dụng các loại sol, tách bằng Kit chuyên dụng. Các phương pháp này cho phép thu nhận DNA plasmid ở dạng tương ựối tinh sạch. Phương pháp ựược sử dụng ở ựây là tách DNA plasmid bằng Kit của hãng Fermentas với mục ựắch thu nhận ựược DNA plasmid có ựộ tinh sạch cao nhất.
Cách tiến hành:
Hút 1,5ml dịch nuôi cấy vào ống eppendorf. Ly tâm 12000 v/phút trong 1 phút, loại dịch, thu cặn tế bàọ Bổ sung 250ộl Resuspension Solution, votex. Bổ sung 250ộl dung dịch Lysis Solution, ựảo nhẹ 4 Ờ 6 lần. Bổ sung 350ộl dung dịch Neutralization Solution, ựảo nhẹ 4 Ờ 6 lần. Ly tâm 12000 vòng/phút, trong 5 phút. Hút dịch nổi, chuyển sang ống mới và ựưa lên cột, ly tâm 12000 v/phút trong 1 phút. Bổ sung 500ộl Wash Solution, ly tâm 12000 v/phút trong 1 phút loại dịch. Bước này lặp lại 2 lần. Tiếp tục ly tâm cột không 12000 v/phút trong 1 phút. Chuyển cột sang ống eppendorf mới, bổ sung 50ộl Elution Buffer, ựể yên trong 2
phút. Ly tâm 12000 v/phút, 2 phút, bỏ cột và giữ dịch trong ống eppendorf ở 4oC. Kiểm tra bằng ựiện di trên gel agarose 0,8%.
3.2.1.7. Phương pháp PCR (Kary Mullis, 1985) Nguyên tắc:
PCR phản ứng chuỗi trùng hợp nhờ enzyme DNA-polymerase do Karl Mullis
phát minh năm 1983. Thực chất ựây là một phương pháp tạo dòng in vitro, nhằm
mục ựắch thu nhận một lượng lớn bản sao của một trình tự xác ựịnh. Cơ sở của
phương pháp PCR là dựa vào ựặc tắnh hoạt ựộng của DNA-polymerase. Trong thực
nghiệm, sử dụng ựoạn mồi có khả năng bắt cặp bổ sung với một ựầu của mạch
khuôn và DNA-polymerase sẽ nối dài mồi ựể hình thành mạch mớị Các ựoạn DNA
mới lại ựược sử dụng làm khuôn, sau một chu kỳ thì số lượng ựoạn DNA ựược nhân lên theo cấp số nhân.
Cách tiến hành:
Trộn phản ứng PCR với ựầy ựủ các thành phần: DNA khuôn, cặp mồi, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
dNTPs, Taq polymerase, MgCl2, dung dịch ựệm. Thành phần phản ứng như sau:
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Nồng ựộ Thể tắch Dung dịch ựệm 10X 2,5 ộl Mồi F 10 pmol/ộl 1,0 ộl Mồi R 10 pmol/ộl 1,0 ộl DNA khuôn 10-100 ng/ộl 1,0 ộl
Taq-polymerase 5 unit/ộl 0,5 ộl
dNTPs 10 nM 2,5 ộl
MgCl2 25 mM 2,5 ộl
BSA 1X 1 mg/ml 4,0 ộl
Chạy máy PCR với chu trình nhiệt như sau: Biến tắnh ở 94oC - 2 phút; Thực
hiện 30 chu kỳ phản ứng với chu trình nhiệt: biến tắnh 94oC Ờ 45 giây, bắt cặp 50-60oC
Ờ 45 giây, kéo dài 72oC Ờ 8 phút ựể hoàn tất phản ứng; sau ựó mẫu ựược giữ ở 4oC.
3.2.1.8. Phương pháp xác ựịnh trình tự nucleotide của DNA (Sanger, 1991) Nguyên tắc:
Sử dụng dideoxynucleotide (đNTP) có ựánh dấu huỳnh quang ựể làm ngừng
các mạch ựơn DNA ựang ựược tổng hợp một cách ngẫu nhiên. Enzyme DNA
polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch ựơn DNA ựang tổng hợp ở vị trắ 3Ỗ-OH, khi gặp đNTP (không có nhóm 3Ỗ-OH) thì phản ứng tổng hợp bị ngừng lạị Kết quả phản ứng tổng hợp nên các ựoạn DNA dài ngắn khác nhau 1 nucleotide, có thể phân tách nhờ ựiện di trên gel polyacrylamide, phát hiện các đNTP ựã ựánh dấu nhờ tia lazẹ
Cách tiến hành:
Thực hiện phản ứng PCR. Chạy máy giải trình tự và xử lý kết quả.