PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
MHF: AGTGCCTCGAGCGAGCCGCGCATG
XhoI
Như vậy với cặp mồi MHF/R, sản phẩm sau khi khuếch ựại bằng phản ứng
PCR sẽ có 2 vị trắ nhận biết của 2 enzyme giới hạn BamHI và XhoI nằm ở hai ựầu
của gen. Kết quả của phản ứng PCR thể hiện ở hình 4.2.
Hình 4.2. điện di ựồ sản phẩm PCR với cặp mồi MHF/R
(M: Marker DNA 1 kb của Fermentas, 1: Sản phẩm PCR)
Kết quả PCR thu ựược một băng ựặc hiệu, sáng rõ nét kắch thước khoảng 390bp phù hợp với tắnh toán lý thuyết, sản phẩm PCR ựược cắt trực tiếp với 2 enzyme cắt giới
500bp
Sản phẩm PCR
hạn BamHI và XhoI ựể tạo ựầu dắnh. Sản phẩm cắt ựược tinh sạch bằng Kắt tinh sạch của fermantas.
Với mục tiêu biểu hiện và tinh sạch ựược lượng lớn protein tái tổ hợp phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi tiến hành nối ựoạn gen mục tiêu với 5 vector biểu hiện nhằm tìm ra hệ thống vector biểu hiện mạnh và khả năng tạo protein tái tổ hợp có ựộ hòa tan caọ Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 5
vector pET28a, pSV278, pET30GB1, pGEX4T1, pET28TRX ựây là những vector
biểu hiện có nhiều ưu ựiểm như: có khả năng tạo số lượng bản sao lớn trong tế bào chủ, có promotor hoạt ựộng mạnh, có gen kháng kháng sinh làm nhân tố chọn lọc
các tế bào mang vector tái tổ hợp. Các vector pSV278, pET30GB1, pGEX4T1,
pET28TRX là những vector fusion, khi protein tái tổ hợp ựược biểu hiện nó sẽ ựược gắn cùng với protein fusion làm tăng ựộ hòa tan của protein tái tổ hợp. 5
vector này cũng ựược cắt mở vòng với 2 enzyme BamHI và XhoI, sản phẩm cắt
ựược tinh sạch bằng Kắt tinh sạch của fermantas, sản phẩm sau tinh sạch ựiện di trên gel agarose nồng ựộ 0,8% (hình 4.3).
Hình 4.3. điện di ựồ kết quả cắt mở vòng 5 vector biểu hiện
(M: Maker DNA 1 kb; 1, 3, 5, 7, 9: Các vector pET28a, pSV278, pET30GB1, pGEX4T1, pET28TRX; 2, 4, 6, 8, 10,: Sản phẩm cắt mở vòng các vector pET28a,
pSV278, pET30GB1, pGEX4T1, pET28TRX)
Các vector tồn tại ở 3 trạng thái: siêu xoắn, thẳng và vòng do vậy khi ựiện di các vector này sẽ chạy với tốc ựộ khác nhaụ Ở trạng thái thẳng vector chạy nhanh nhất sau ựó ựến siêu xoắn và cuối cùng là ở dạng vòng. Chắnh vì vậy khi ựiện di vector gốc (ựường chạy số 1, 3, 5, 7, 9) ta sẽ thấy xuất hiện 3 băng. Khi cắt mở vòng với 2 enzyme giới hạn các vector trở về cùng một dạng thẳng nên trên ựiện di ựồ ta thấy xuất hiện 1 băng duy nhất (ựường chạy số 2, 4, 6, 8, 10) ựiều này chứng tỏ 5 vector ựã ựược cắt mở vòng hoàn toàn.
Sau khi thu nhận ựoạn gen ORF7 chứa ựầu dắnh của 2 enzyme giới hạn và 5 vector biểu hiện ựã ựược mở vòng chúng tôi tiến hành phản ứng nối giữa gen ORF7
lần lượt vào 5 vector biểu hiện pET28a, pSV278, pET30GB1, pGEX4T1,
pET28TRX dưới sự xúc tác của enzyme T4 ligase. Enzyme này xúc tác cho phản
ứng nối giữa ựầu 3Ỗ-OH với ựầu 5Ỗ-Phosphate của phân tử DNA tạo thành phân tử
DNA hoàn chỉnh. Phản ứng gắn ựược tiến hành ở 220C trong 2 giờ. Kết quả phản
ứng gắn có thể xảy ra các khả năng: ựoạn gen ORF7 tồn tại ựộc lập trong hỗn hợp, vector tự ựóng vòng và sản phẩm mong muốn là ựoạn gen ORF7 ựã gắn ựược vào vector. Muốn chọn lọc ựược vector tái tổ hợp chúng tôi tiến hành biến nạp sản phẩm
lai vào vi khuẩn Ẹ coli chủng DH5α.