Vectơ dùng ựể biểu hiện gen ở Prokaryot ựược thiết kế ựầy ựủ bao gồm tập hợp các nhân tố di truyền ựược sắp xếp hợp lý nhằm ựiều khiển tối ưu cả quá trình phiên mã, dịch mã ựể tổng hợp nên protein từ gen ngoại laị Ngoài ra, vectơ còn
phải chứa gen mã hóa cho protein có chức năng dùng làm dấu hiệu chọn lọc. Gen thường ựược sử dụng trong vectơ biểu hiện là gen kháng chất kháng sinh. Gen này tạo ựiều kiện thuận lợi cho việc nhận biết các dòng tế bào mang plasmit. đối với plasmit tự sao chép, một trình tự không thể thiếu ựó là tâm sao chép. Tâm sao chép quyết ựịnh số lượng bản copy của plasmit trong một tế bàọ để tạo ựiều kiện thuận lợi cho việc ựưa các ựoạn gen vào vectơ biểu hiện theo ựúng chiều của promotơ, trên vectơ luôn phải chứa vùng ựa nối (polylinker region) mang các trình tự của enzym hạn chế có tần số xuất hiện thấp trên các gen cấu trúc.
Promotơ (vùng khởi ựầu phiên mã - Promotơ)
Có nhiều loại promotơ khác nhau ảnh hướng tới mức ựộ biểu hiện gen ở
Ẹcoli. Các promotơ có khả năng biểu hiện gen cao có những ựặc ựiểm chung như sau : (1) promotơ phải là promotơ mạnh có khả năng tạo protein ngoại lai lớn hơn 10 ựến 30% protein tổng số của tế bào; (2) promotơ chỉ hoạt ựộng phiên mã gen ở mức ựộ cơ sở (phiên mã khi không cảm ứng) với mức ựộ nhỏ tối ựạ Promotơ bị ức chế cao khi không ựược cảm ứng là ựiều kiện quan trọng ựể biểu hiện các protein ựộc hoặc có hại ựối với sự sinh trưởng của tế bào; (3) promotơ ựược cảm ứng theo cách ựơn giản nhưng lại hiệu quả caọ
Terminatơ (Vùng kết thúc phiên mã)
Quá trình phiên mã ựược bắt ựầu từ promotơ sau ựó sợi mARN ựược kéo dài ựến khi gặp một trình tự ựặc hiệu, tại ựó quá trình phiên mã bị dừng lạị Trình tự ựặc hiệu ựó là vùng kết thúc phiên mã. Có 2 cơ chế dừng phiên mã là cơ chế giảm tốc ựộ phiên mã và cơ chế dừng không ựặc hiệụ Vị trắ giảm phiên mã mang ựặc ựiểm của một terminatơ ựơn giản, ựược gắn giữa promotơ và gen cấu trúc ựầu tiên trong một operon. Vì vị trắ giảm phiên mã là yếu tố ựiều khiển âm (negative regulatory elements) nên thường không ựược sử dụng trong hệ biểu hiện.
Quá trình dừng phiên mã không ựặc hiệu có thể xuất hiện trong bất kỳ một quá trình phiên mã nào ựó do có chứa trình tự trên ARN thông tin giống với trình tự của terminatơ một cách ngẫu nhiên. Các yếu tố chống lại sự dừng phiên mã cũng
ựược ựưa vào vectơ biểu hiện ựể chắc chắn ựoạn ARN thông tin ựược tổng hợp có ựộ dài ựầy ựủ. Nói chung, ựể quá trình này diễn ra thì cần phải có nhân tố khác của
chủng chủ (vắ dụ protein Q, N của Bacteriophagơ ặ, Protein NusA của Ẹ coli) và
một vị trắ ựặc hiệu tại ựó polimerase bị thay ựổị Quá trình dừng phiên mã có sự tham gia của nhiều yếu tố như trình tự ADN, cấu trúc bậc 2 của ARN vừa ựược tổng hợp và một số nhân tố trong tế bào chủ như P, Nus A, Nus B.
Peptit tắn hiệu (signal peptite)
Các protein ngoại lai ựược tổng hợp trong tế bào Ẹ coli cần thiết phải ựược
tiết ra ngoài vì : (1) Ẹ coli tiết rất ắt protein ra ngoài môi trường nên protein ngoại
lai nếu ựược tiết ra sẽ có ựộ tinh sạch cao, vì vậy tiện cho quá trình tinh sạch sau nàỵ (2) Protein tiết ra ngoài khoang chu chất có khả năng hình thành cấu trúc bậc 4 ựúng ựể trở thành protein có hoạt tắnh sinh học. Quá trình cuộn xoắn và hình thành cầu disulfit của protein nằm trong tế bào thường bị hạn chế và dẫn ựến sai hỏng trong cấu trúc protein. (3) Protein khi ựược tiết ra ngoài sẽ tránh bị phân cắt bởi một số Protease có trong tế bàọ
để ựược tiết ra khỏi màng trong tế bào, các chuỗi polipeptit bắt buộc phải có trình tự peptit tắn hiệu nằm ở tận cùng ựầu N. Thông thường chuỗi peptit tắn hiệu ựược cấu tạo gồm 3 vùng: vùng tận cùng ựầu N, vùng tận cùng ựầu C và vùng kỵ nước. Mỗi vùng có tối ựa 20 axit amin và tối thiểu là 2 axit amin ựối với vùng N, 8 axit amin ựối với vùng kỵ nước và 6 axit amin ựối với vùng C.
Thường thì peptit tắn hiệu của protein có nguồn gốc từ các chủng khác sẽ
không ựược nhận biết tốt bởi các nhân tố trong hệ tiết của Ẹ colị Vì vậy, trên
vectơ biểu hiện, người ta thiết kế chuỗi peptit tắn hiệu nằm ngay sau vùng SD và tiếp ựó là trình tự vùng ựa nối ựể ựưa gen quan tâm vào vectơ.
Hiện nay, trong các vectơ biểu hiện các ựoạn peptide tắn hiệu ựược sử dụng rộng rãi ựể vận chuyển hiệu quả các protein ngoại lai qua màng trong tế bào có
nguồn gốc từ các protein tiết của Ẹ coli như OpmA, OmpA, OpmT, PelB, ư-
trong vectơ biểu hiện nhằm ựảm bảo cho nó ựược gắn với ựầu N của protein quan tâm. Tuy nhiên, trong một số trường hợp vẫn xảy ra hiện tượng chuỗi polipeptit bị mắc trong khi vận chuyển qua màng và bị protease thủy phân.
Một trong những vectơ hệ pET hay ựược sử dụng là vecơ pETT22b(+) chứa peptit tắn hiệu pelB có ựộ dài 33 axit amin và nó có tác dụng hướng protein vừa ựược tổng hợp tới màng. Sau khi protein ra khỏi màng trong, peptit tắn hiệu bị cắt bỏ bởi protease tại một vị trắ xác ựịnh.
Tâm sao chép (Ori)
Số lượng bản sao của plasmit trong tế bào phụ thuộc vào nhân tố khởi ựầu
sự sao chép ADN tại một vị trắ ựặc hiệu gọi là tâm sao chép (Ori). đối với các
plasmit sao chép tự do trong tế bào chủ, số lượng bản sao ắt nhất cũng bị ảnh hưởng
bởi tốc ựộ sinh trưởng của tế bào Ẹ co1i có khả năng tạo 10-12 bản sao/tế bàọ
Những plasmit ựa phiên bản thường bị mất ựi qua các thế hệ tế bào (10-5 - 10-6 trên
một thế hệ) khi tế bào mang plasmit ựược nuôi cấy trong môi trường không có áp lực chọn lọc hoặc gen trên plasmit mã hóa cho protein gây ựộc cho tế bàọ
Dấu chuẩn chọn lọc
để tiện lợi cho việc nhận ra các tế bào biến nạp có mang plasmit, thông thường người ta sử dụng môi trường nuôi cấy mà ở ựó chỉ có tế bào có tắnh trạng chọn lọc nhất ựịnh mới có thể sinh trưởng ựược. Có một cách giúp dễ dàng nhận biết các thể biến nạp mang plasmit biến nạp ựó là ựưa các ựoạn gen kháng kháng sinh vào plasmit ựó. Sự có mặt của plasmit trong tế bào giúp cho tế bào sống sót trên môi trường có chất kháng sinh. Vì vậy, gen kháng kháng sinh có mặt ở hầu hết các vectơ tách dòng hiện ựang ựược sử dụng như dấu chuẩn chọn lọc.
Vùng ựa nối (Polylinker region)
Vùng ựa nối bao gồm trình tự nhận biết ựặc hiệu của các enzim hạn chế hay ựược sử dụng giúp cho quá trình ựưa ựoạn gen ngoại lai vào vectơ biểu hiện trở nên dễ dàng. Hầu hết trình tự của các enzim hạn chế trong vectơ biểu hiện ựều ựược ựặt theo ựúng khung ựọc và nằm sau ựoạn peptit tắn hiệu (Signal peptit). để tiện cho
việc ghép nối các ựoạn gen cần biểu hiện, các ựiểm nhận biết của các enzym hạn chế trong vùng ựa nối ựược thiết kế sao cho chúng chỉ tồn tại như những vị trắ duy
nhất trên toàn bộ phân tử plasmit (Lê Quang Huấn và Lã Thị Huyền, 2009).
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng ựến khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp
trong Ẹ coli. Gold L (1990) ựã chỉ ra một trong những yếu tố ảnh hường ựến sự
biểu hiện của protein tái tổ hợp ựó là các protein dung hợp (protein fusion). Protein fusion có chức năng : Cải thiện ựộ hòa tan của protein tái tổ hợp, giúp tinh sạch protein tái tổ hợp một cách dễ dàng, nhận diện các phân tử protein mục tiêu và làm tăng khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bốn protein fusion: Maltose
Binding Protein (MBP), G protein Domain B1 (GB1), Thioredoxin (Trx) và
Glutathione-S -Transferase (GST).
Maltose Binding Protein (MBP) là một protein thuộc họ maltose của
Escherichia coli, có nhiệm vụ cho sự hấp thu và dị hóa hiệu quả của maltodextrins. MBP có khối lượng phân tử xấp xỉ 42,5 kDạ MBP ựược sử dụng ựể làm tăng ựộ tan
của protein tái tổ hợp biểu hiện trong Ẹ coli. Ngoài ra, MBP có thể tự ựược sử dụng
ựể tinh sạch protein tái tổ hợp. MBP liên kết với cột amylose trong khi tất cả các protein khác chảy quạ Phức hợp MBP-protein mục tiêu có thể ựược thôi ra bằng tách rửa cột với maltosẹ Khi protein tái tổ hợp thu ựược trong dạng tinh khiết, các
protein mục tiêu sẽ ựược cắt khỏi MBP bằng enzyme Thrombin (hình 2.5)(
http://en.wikipediạorg/wiki/Maltose-binding_protein).
Glutathione S-transferase (GST) là một protein fusion với khối lượng phân tử 26kDạ GST cuộn gấp nhanh, ổn ựịnh và hòa tan cao do vậy chuỗi ADN thường ựược tắch hợp vào vector biểu hiện ựể sản xuất protein tái tổ hợp. Kết quả của quá trình biểu hiện từ vector này là một protein dung hợp GST gắn với protein mục tiêụ Trong ựó protein GST ựược hợp nhất vào ựầu N của protein tái tổ hợp. Ngoài ra, protein fusion GST có thể ựược tinh sạch hoặc phát hiện dựa vào ái lực với glutathione (http://www.piercenet.com/browsẹcfm?fldID=4A8ADF29-5056-8A76- 4EC6-63375BA024E7).
Thioredoxin (TRX) là một loại protein oxi hóa khử ựược biết ựến trong tất cả các sinh vật. Nó ựóng vai trò trong nhiều quá trình sinh học quan trọng, bao gồm cả tắn hiệu oxi hóa khử. Ở người, nó ựược mã hóa bởi gen TXN. đột biến ở gen TXN gây tử vong ở giai ựoạn bốn tế bào của phôi thai ựang phát triển. Thioredoxin có khối lượng phân tử 19,5kDa (http://en.wikipediạorg/wiki/Thioredoxin).
Protein G là một protein miễn dịch với khối lượng phân tử 65kDa biểu hiện
trong nhóm C và G vi khuẩn Streptococcus giống như Protein A nhưng với ựặc
ựiểm khác nhaụ Protein G miền B1 có khối lượng phân tử 6,2kDa, nhiều protein
khi biểu hiện trong Ẹcoli không hòa tan ựã trở nên hòa tan khi hợp nhất với miền
GB1 (http://en.wikipediạorg/wiki/Protein_G).
Hình 2.5. Sơ ựồ quá trình cắt protein fusion ra khỏi protein mục tiêu
(Nguồn: http://en.wikipediạorg/wiki/Maltose-binding_protein)