PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.2.1.Biểu hiện gen ORF7 trong Ẹ coli BL21(DE3)
Vi khuẩn Ẹ coli BL21(DE3) với những ưu ựiểm: mức ựộ biểu hiện cao, chi
phắ thấp, ựiều kiện nuôi cấy ựơn giản, tăng trưởng nhanh và khi biểu hiện có thể tối ưu hóa các ựiều kiện một cách dễ dàng ựược chúng tôi lựa chọn ựể biểu hiện protein tái tổ hợp. Ngoài ra protein Nucleocapsid có khối lượng phân tử thấp, trong phân tử
không có hiện tượng glycosyl hóa phù hợp ựể biểu hiện trong Ẹ colị
Các dòng vector tái tổ hợp pET28a/ORF7, pSV278/ORF7, pET30GB1/ORF7,
pGEX4T1/ORF7, pET28TRX/ORF7 ựược ựưa vào chủng biểu hiện Ẹ coli BL21 (DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt. Dịch tế bào sau ựó ựược cấy trải trên môi
trường LB ựặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc, ủ 37oC, qua ựêm. Sau thời gian ủ,
trên ựĩa xuất hiện các dòng khuẩn lạc riêng rẽ (Hình 4.6).
Hình 4.6. đĩa khuẩn lạc khi biến nạp các vector tái tổ hợp vào Ẹ coli BL21 (DE3)
Trên mỗi ựĩa biến nạp chọn một khuẩn lạc ựem nuôi hoạt hóa trong môi
trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc, lắc 200 v/ph ở 37oC qua ựêm. Cấy
chuyển 2% dịch hoạt hóa sang môi trường mới, có bổ sung kháng sinh chọn lọc,
nuôi lắc 37oC, ựến khi OD ựạt 0,6 thì tiến hành cảm ứng với IPTG nồng ựộ cuối là
0,3mM. Thu mẫu trước cảm ứng và sau cảm ứng 4 giờ ựể kiểm tra sự biểu hiện của protein mong muốn. Dịch tế bào sau ựó ựược ly tâm 12.000 v/ph ựể thu sinh khối tế bàọ
Tế bào ựược xử lý và ựiện di trên gel polyacrylamidẹ Sau ựó, bản gel ựược nhuộm màu, tẩy màu và quan sát kết quả (Hình 4.7).
đoạn gen ORF7 với kắch thước 390bp mã hóa cho protein Nucleocapsid có khối lượng phân tử 14kDạ Kết quả trên ựiện di ựồ cho thấy, tất cả các mẫu sau cảm ứng ựều xuất hiện 1 băng khác biệt với mẫu trước cảm ứng.
Hình 4.7. điện di protein kiểm tra các mẫu biểu hiện trong 5 hệ thống vector tái tổ hợp
(M: Marker protein; 1, 3, 5, 7, 9: Protein tổng số trước khi cảm ứng; 2, 4, 6, 8, 10: Protein tổng số sau khi cảm ứng của chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp
pET28a, pSV278, pET30GB1, pGEX4T1, pET28TRX)
Ở ựường chạy số 2 là mẫu protein biểu hiện trong vector pET28a/ORF7 có khối lượng phân tử khoảng 18kDa, ựây là hệ thống vector thường không có protein fusion tuy nhiên bộ ba mở ựầu dịch mã protein trên vector nằm khá xa vị trắ MCS (vị trắ chèn ựoạn gen) chắnh vì vậy protein ựược tổng hợp có khối lượng phân tử lớn hơn so với tắnh toán.
Bốn hệ thống vector còn lại là những hệ thống vector fusion, do vậy khối lượng phân tử của protein biểu hiện sẽ bằng khối lượng phân tử của protein fusion cộng với khối lượng phân tử của protein mục tiêụ Ở ựường chạy số 4 là mẫu protein biểu hiện trong vector pSV278/ORF7 có khối lượng phân tử khoảng 57kDa, ựường chạy số 6 là mẫu protein biểu hiện trong hệ thống pET30GB1/ORF7 khối
lượng phân tử khoảng 21kDa, ựường chạy số 8 là mẫu protein pGEX4T1/ORF7 có
57kDa 18kDa 21kDa 41kDa 33kDa 116kDa 66kDa 45kDa 18kDa 25kDa 35kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
khối lượng phân tử khoảng 41kDa, ựường chạy số 10 là mẫu protein pET28TRX có khối lượng phân tử 34 kDạ Các protein có kắch thước tương ựương như với tắnh toán lý thuyết (bảng 4.1). điều này chứng tỏ protein mục tiêu ựã ựược biểu hiện thành công trong 4 hệ thống vector fusion.
Bảng 4.1. Bảng dự kiến khối lượng protein ựược tổng hợp
Tên vector Tên protein fusion
Khối lượng phân tử protein fusion Khối lượng phân tử protein mục tiêu Dự kiến khối lượng protein ựược tổng hợp pSV278 Maltose Binding Protein (MBP)
42,5kDa 14kDa 56,5kDa
pET30GB1 G protein Domain B1
(GB1)
6,2kDa 14kDa 20,2kDa (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
pGEX4T1 Glutathione-S - Transferase (GST)
26kDa 14kDa 40kDa
pET28TRX Thioredoxin (Trx) 19,5kDa 14kDa 33,5kDa
Như vậy, chúng tôi ựã biểu hiện thành công protein tái tổ hợp trong các hệ
thống vector pET28a/ORF7, pSV278/ORF7, pET30GB1/ORF7, pGEX4T1/ORF7,
pET28TRX/ORF7 với mức ựộ biểu hiện tương ựối caọ