2.3.1. Biểu hiện gen ở vi khuẩn Ẹ coli
Vào những năm 1970, các thắ nghiệm sản xuất protein tái tổ hợp ựầu tiên ựã thành công ở vi khuẩn như hormon somatostatin, sau ựó là insulin ựều có giá trị cao ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và công nghệ sinh học. Hiện nay,
protein tái tổ hợp do có những ưu thế nổi bật về tốc ựộ tăng trưởng, ựạt ựược mật ựộ tế bào cao, phát triển trên môi trường ựơn giản, rẻ tiền, các ựặc tắnh di truyền ựược hiểu biết rõ, sản lượng protein sản xuất cao (có thể lên ựến 50%), có nhiều chủng ựột biến, nhiều vector tạo dòng thắch hợp và thao tác di truyền dễ dàng.
Protein tái tổ hợp ựược sản xuất ở Ẹ coli có thể thực hiện theo ba hướng:
sản xuất nội bào (tế bào chất), trong chu chất và sản xuất ngoại bàọ Trong ựó, sản xuất protein tái tổ hợp trong nội bào là chiến lược ựược sử dụng phổ biến nhất. Protein tái tổ hợp tạo ra có thể ở dạng tan hay không tan (thể vùi), do ựó khuyết ựiểm chủ yếu của chiến lược này là hình thành protein ở dạng thể vùi không có hoạt tắnh, ựặc biệt là khi biểu hiện vượt mức. Protein mục tiêu sau khi thu nhận phải ựược tái gấp cuộn ựể có hoạt tắnh. Nhiều cải tiến ựã ựược tiến hành như nuôi cấy vi sinh vật ở nhiệt ựộ thấp, thay thế các acid amin, sử dụng các
chủng Ẹ coli khác nhau, ựồng biểu hiện với chaperone gấp cuộn, thay ựổi
pH, nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện ở ựiều kiện stress...
Biểu hiện ở tế bào chất
Hầu hết protein ựược biểu hiện ở Ẹ coli ựều ựược thiết kế biểu hiện ở tế
bào chất của tế bàọ Việc biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chất của Ẹ coli
gặp nhiều khó khăn như protein thường ựược tạo ra ở dạng không tan, không có
hoạt tắnh sinh học gọi là thể vùi (inclusion body), tế bào chất của Ẹ coli không
có cơ chế thúc ựẩy sự hình thành cầu nối disulfideẦ Tuy nhiên, hiện nay việc
biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chất của Ẹ coli vẫn là phương án ựược
sử dụng phổ biến nhất do mức ựộ biểu hiện cao hơn so với các vị trắ khác trong tế bào, việc thiết kế plasmid cũng ựơn giản hơn. Ngoài ra, hiện nay người ta cũng phát triển nhiều phương pháp nhằm cải thiện tắnh tan của protein trong
tể bào chất như ựồng biểu hiện các phân tử chapreron; sử dụng các chủng Ẹcoli
ựột biến gen trx...
Biểu hiện ở chu chất
các enzyme xúc tác cho việc hình thành liên kết disulfidẹ Tuy nhiên trong khoang chu chất lượng protein thường ựược biểu hiện với hiệu suất thấp. Mặt khác, ựể protein có thể chuyển từ màng trong ra ngoài khoang chu chất là ựoạn peptide
tắn hiệụ Không phải peptide tắn hiệu nào cũng hoạt ựộng tốt trong tế bào Ẹ
coli. Khi tăng sự tổng hợp peptide tắn hiệu sẽ làm giảm mức ựộ biểu hiện của
protein ựể tránh tình trạng ùn tắc hệ thống vận chuyển qua màng, làm tăng sự tổng hợp protein ựóng vai trò chuyển màng. Bên cạnh ựó khi biểu hiện ở chu chất, protein cũng có thể tồn tại ở dạng thể vùị
Hình 2.4. Sơ ựồ Sự hình thành cầu nối disuldide trong chu chất ở Ẹ colị
Tiết ra môi trường
Ẹ coli tiết rất ắt (hầu như không có) protein ra ngoài môi trường nuôi cấỵ Protein ựược ựịnh hướng tiết ra ngoài môi trường sẽ phải qua hai màng: màng
trong và màng ngoài của Ẹ colị Cơ chế chuyển qua màng là rất ựặc hiệụ Người ta
cho rằng có hai cách ựể ựịnh hướng protein ựược tiết ra ngoài môi trường ựó là sử dụng con ựường tiết sẵn thông qua việc sử dụng các ựoạn peptide tắn hiệu; cách thứ hai là sử dụng các yếu tố thẩm thấu ảnh hưởng tới việc tiết protein có lựa chọn nhưng lại hạn chế ựược tắnh thấm của màng ngoàị Nhìn chung protein tạo ra bằng những phương pháp này là rất hiếm gặp.