PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.4. Phương pháp tinh sạch protei nN tái tổ hợp (Hochuli và cs, 1988)
Nguyên tắc :
Protein Nucleocapsid ựược tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực trên cột Ni-NTA của hãng Invitrogen.
Cách tiến hành:
đầu tiên, lượng tế bào biểu hiện protein Nucleocapsid thu ựược trong 500 ml
môi trường ựược hòa lại vào 40 ml dung dịch ựệm lysis ựã làm lạnh trước ở 40C
(thành phần của dung dịch ựệm lysis gồm có: 50 mM Phosphate natri, 300 mM Natri clorua pH 8.0). Tế bào ựược ựặt trên ựá và phá bằng sóng siêu âm với máy siêu âm SONICS vibra cell (USA) ở ựiều kiện 9.5 mm tip, 3 lần 1 phút pulse, ựộ lớn 100%. Sau khi siêu âm xong, dịch tế bào ựược ựem ựi ly tâm tốc ựộ cao (13 000
vòng/phút, trong 30 phút ở 40C) ựể loại bỏ cặn và xác tế bào không hòa tan trong
dung dịch ựệm lysis. Dịch trong thu ựược sau khi ly tâm ựược dùng ựể ựưa qua cột Ni-NTA ựể tinh sạch protein. Các bước tinh sạch trên cột Ni-NTA ựược thực hiện như sau: Cột Ni-NTA trước tiên ựược cân bằng với ựệm lysis (thể tắch dùng gấp khoảng 3 lần thể tắch cột), dịch tế bào ựược ựưa lên cột và cho chảy từ từ qua cột ựể protein có ái lực với Ni-NTA có thể bám vào cột. Sau ựó ựệm rửa ựược ựưa qua cột ựể rửa những thành phần không có ái lực hoặc bám không ựặc hiệu trên cột (ựệm rửa gồm có 50 mM Na-Pi, 300 mM NaCl, 10% glycerol, pH 8.0, với 5 mM và 10 mM Immidazol), mỗi loại ựệm ựược rửa với thể tắch gấp ắt nhất 50 lần thể tắch cột. Bước tiếp theo protein trên cột ựược thôi ra khi dùng gradient nồng ựộ của
Immidazol (50, 100, 200, 500 mM Immidazol trong dung dịch rửa như ở trên), mỗi phân ựoạn ựược thu với thể tắch gấp 2 lần thể tắch cột. Sau ựó tất cả các phân ựoạn ựược ựiện di trên gel polyacrylamide ựể kiểm tra sự có mặt của protein và ựánh giá hiệu suất của việc tinh sạch.