M 21 tcu 3 21 tcu 21 tcu 3 21 tcu
4.3. Kết quả tinh sạch protein tái tổ hợp
Tinh sạch protein là một bước quan trọng ựể thu nhận protein mục tiêụ Có rất nhiều phương pháp tinh sạch khác nhau như sắc ký lọc gel, sắc ký trao ựổi ion, sắc kắ ái lựcẦtuy nhiên, sắc ký ái lực ựược xem là phương pháp hiệu quả nhất. Vì phương pháp này dựa vào ái lực liên kết ựể thu nhận protein, do ựó hiệu quả tinh sạch cao hơn.
Các protein tái tổ hợp ựược tổng hợp trong các hệ vector ựược gắn thêm ựuôi
6xHistidine gọi tắt ựuôi His-tag, ựuôi His-tag có ái lực với Ni2+. Chắnh vì vậy trong
nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hệ thống tinh sạch Ni-NTA của invitrogen. Ni2+
gắn với hỗn hợp NTA (Nitrilotriacetic) là giá thể ựể tinh sạch protein tái tổ hợp. Theo hướng dẫn của hãng Invitrogen việc tinh sạch protein tiến hành theo 3 phương pháp: native, denaturing và hybrid. Tinh sạch trong ựiều kiện native áp dụng ựối với các protein hòa tan do vậy protein giữ ựược nguyên hoạt tắnh. Trong ựiều kiện denaturing áp dụng ựối với các protein ở dạng không hòa tan (thể vùi). điều kiện biến tắnh hybrid áp dụng ựối với các protein khi chưa biết rõ dạng hòa tan hay chưa hòa tan, phương pháp này thường ựược sử dụng cho các protein ở dạng chưa hòa tan, kết quả cuối cùng là thu ựược protein ở trạng thái hòa tan. Chúng tôi lựa chọn hệ thống vevtor biểu hiện pSV278/ORF7 ựể tinh sạch protein tái tổ hợp do protein này có khả năng hòa tan tốt nhất so với các protein biểu hiện trong các hệ thống vector còn lạị Do protein tái tổ hợp có ựộ hòa tan cao nên chúng tôi lựa chọn phương pháp tinh sạch native ựể protein vẫn giữ ựược hoạt tắnh.
Sự gắn kết ái lực giữa ựuôi his-tag với Ni2+ sẽ giữ lại protein tái tổ hợp, những protein khác sẽ bị rửa trôi bằng Imidazol ở nồng ựộ thấp. Sau ựó protein tái tổ hợp ựược giải hấp bằng Imidazole ở nồng ựộ cao và thu lại ựể kiểm trạ Các bước
ựược tiến hành như sau: Tế bào Ẹ coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp
pSV278/ORF7 ựược nuôi cấy trong 50ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng
sinh chọn lọc, nuôi lắc ở 37oC ựến khi mật ựộ ựạt 0.6 tiến hành cảm ứng bằng IPTG
ựến nồng ựộ cuối 0,1mM, sau 3 giờ cảm ứng tiến hành thu mẫụ Dịch tế bào ựược ly tâm 6.000 v/ph trong 20 phút ựể thu sinh khốị Cặn tế bào sẽ ựược hòa tan trong 8ml ựệm phá tế bào, siêu âm phá tế bào và tiến hành tinh sạch theo ựiều kiện native của hãng Invitrogen. để kiểm tra kết quả tinh sạch, các mẫu trước cảm ứng, sau cảm
ứng và tinh sạch lấy mỗi mẫu 40 ộl, bổ sung ựệm SDS sample 5X, biến tắnh 100oC,
sau ựó tiến hành ựiện di trên gel polyacrylamidẹ Kết quả ở hình 4.13 cho thấy mẫu protein tái tổ hợp pSV278/ORF7 sau khi tinh sạch chỉ còn lại 1 băng duy nhất, ựúng với kắch thước ban ựầu (57kDa), không còn lẫn các protein khác. Như vậy có thể khẳng ựịnh, chúng tôi ựã tinh sạch thành công protein tái tổ hợp trong hệ biểu hiện pSV278/ORF7 với hiệu quả tinh sạch tương ựối caọ
Hình 4.13. điện di protein Nucleocapsid sau khi tinh sạch qua cột Ni-NTA
(M: Marker; giếng 1: Tế bào trước cảm ứng; giếng 2: Tế bào sau khi cảm ứng; giếng 3 và 4: protein fusion MBP và Nucleocapsid sau khi tinh sạch)