PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.2.Khảo sát ựiều kiện biểu hiện gen ORF7 mã hóa protei nN của virút PRRS
Theo hướng dẫn của hãng Novagen (hãng cung cấp vector pET), ựiều kiện biểu hiện ban ựầu ựược ựưa ra là hoạt hóa 1% chủng ựến khi mật ựộ ựạt 0,6-0,8 thì
cảm ứng IPTG ở nồng ựộ 0,1-1mM, nuôi lắc ở 37oC, sau 3-4h protein sẽ ựược biểu
hiện. Với mục ựắch thu ựược lượng lớn protein tái tổ hợp chúng tôi tiến hành khảo
sát ựiều kiện biểu hiện nhiệt ựộ nuôi cấy ở 37oC và 30oC, mật ựộ ựạt 0,4 ; 0,6 ; 0,8,
nồng ựộ IPTG 0,1 ; 0,3 ; 1mM, thu mẫu sau 3 giờ, 5 giờ và qua ựêm.
3.2.2.1. Phương pháp biểu hiện gen trong tế bào Ẹ Coli (Tabor và Richardson, 1985), (Studier và Mofatt, 1986)
Nguyên tắc:
Nuôi cấy các khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp trong môi trường có chất cảm ứng ựể protein tái tổ hợp có thể ựược tổng hợp. Sau ựó, kiểm tra protein tái tổ hợp bằng phương pháp ựiện di trên gel polyacrylamide ựể phát hiện băng protein tái tổ hợp.
Cách tiến hành:
Lấy 1 khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp cho vào môi trường LB lỏng chứa kháng
sinh thắch hợp, nuôi lắc 200 v/p, 37oC, qua ựêm. Cấy chuyển sang môi trường LB
lỏng chứa kháng sinh với tỷ lệ chủng là 2%. Nuôi lắc 200 v/p với các ựiều kiện như
sau: nhiệt ựộ nuôi cấy ở 37oC và 30oC khi mật ựộ vi khuẩn ựạt 0,4 ; 0,6 ; 0,8 thì cảm
ứng nồng ựộ IPTG 0,1 ; 0,3 ; 0,5mM, thu mẫu sau 3 giờ, 5 giờ và qua ựêm sau khi cảm ứng biểu hiện.
3.2.2.2. Phương pháp ựiện di protein (Laemmli, 1970) Nguyên tắc:
Phức hợp thu ựược sau khi biến tắnh protein bằng SDS có ựiện tắch âm nhờ ựó, hỗn hợp protein sau khi biến tắnh có thể chuyển ựộng trong ựiện trường theo chiều từ cực âm ựến cực dương và tách các băng theo kắch thước trên gel polyacrylamidẹ
Cách tiến hành:
Chuẩn bị gel ựiện di polyacrylamide:
Bảng 3.4. Thành phân gel phân tách:
Thành phần Thể tắch H2O 1,230ml Tris-HCl (3M; pH 8) 0,625ml Acrylamid (30%) 2,100ml Glycerol (50%) 1,000ml APS (10%) 25,000ộl SDS (10%) 25,000ộl Temed 4,000 ộl
Bảng 3.5. Thành phần gel cô mẫu Thành phần Thể tắch H2O 0,85ml Tris-HCl (pH 6,8; 1 M) 156,25ộl Acrylamide (30%) 212,50ộl APS (10%) 12,50ộl SDS (10%) 6,25ộl Temed 1,00ộl
Xử lý mẫu: Hút 1ml dịch tế bào sau cảm ứng ly tâm 12.000 v/p, thu cặn tế
bàọ Hòa lại cặn trong 40ộl H2O + 10ộl SDS Sample 5X, biến tắnh ở 100oC trong 5
phút. Tra 15ộl mẫu vào mỗi giếng của bản gel.
Chạy ựiện di: điện di theo chiều thẳng ựứng với cường ựộ dòng ựiện 40mA, trong thời gian khoảng 40 phút.
Nhuộm bản gel: sử dụng dung dịch CBB ựược pha trong dung dịch tẩy gel. Sau ựó tẩy bản gel và xác ựịnh kết quả.
3.2.3. Phương pháp kiểm tra ựộ hòa tan của protein N và tối ưu hóa ựiều kiện biểu hiện của protein N