Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp GP5 m của virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực tập, hồn thiện khóa luận tốt nghiệp, Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam em nhận đƣợc nhiều quan tâm giúp đỡ tận tình giáo viên hƣớng dẫn,cùng thầy cán nghiên cứu phịng thí nghiệm Viện, với nỗ lực cố gắng thân, em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Chu Hồng Hà, Viện trƣởng Viện Cơng nghệ sinh tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực khóa luận Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới NCS.ThS Nguyễn Thị Minh Hằng, PGS.TS Phạm Bích Ngọc giúp đỡ, giảng dạy, đem đến cho em kiến thức quý báu Công nghệ sinh học, ngƣời tạo cho em hội quý báu để thực niềm say mê nghiên cứu khoa học giáo viên hƣớng dẫn em trình thực tập tốt nghiệp Nội dung đề tài khóa luận nằm đề tài nghiên cứu sinh NCS.ThS Nguyễn Thị Minh Hằng Em xin chân thành cảm ơn ThS Hồ Thị Thƣơng, ThS Nguyễn Thu Giang toàn thể cán bộ, học viên, sinh viên Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện làm việc, giúp đỡ truyền đạt để lại cho em kiến thức, kinh nghiệm làm việc quý báu cần thiết cho thân sau Trong trình học,thực tập, hồn thiện, hồn thành chƣơng trình học khóa luận tốt nghiệp chun ngành Cơng nghệ sinh học Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp, Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập, nghiên cứu giảng dạy em kiến thức tảng làm phong phú thêm nguồn kiến thức thân em nhƣ tiền đề công việc tƣơng lai sau em bƣớc khỏi cánh cổng đại học v Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình bạn bè, ngƣời ln bên cạnh động viên, góp ý cho em suốt trình học tập hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 05 tháng năm 2018 Sinh viên Trần Thị Ngọc vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN v MỤC LỤC vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ix DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xi MỞ ĐẦU 12 Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh lợn tai xanh 1.1.3 Tình hình dịch bệnh lợn tai xanh 1.1.4 Sản xuất vacxin phòng dịch bệnh lợn tai xanh 11 1.2 Hệ thống biểu protein tái tổ hợp thực vật 13 1.3 Sản xuất protein tái tổ hợp tạm thời phƣơng pháp agroinfiltration 15 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 17 2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 17 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2 Vật liệu nghiên cứu 17 2.2.1 Chủng vi khuẩn 17 2.2.2 Các vector vật liệu thực vật 17 2.2.3 Các cặp mồi sử dụng 18 2.3 Hóa chất, thiết bị 18 2.3.1 Hoá chất 18 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Phƣơng pháp khuếch đại gen phản ứng PCR 19 2.4.2 Phản ứng nối ghép gen (ligation) 20 2.4.3 Biến nạp plasmid vào tế bào E coli A tumefaciens 21 vii 2.4.4 Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 22 2.4.5 Tách chiết tinh plasmid 22 2.4.6 Cắt plasmid kiểm tra enzyme cắt giới hạn 24 2.4.7 Phƣơng pháp biểu tạm thời 24 2.4.8 Tách chiết protein tổng số 25 2.4.9 Phƣơng pháp điện di SDS-Page lai miễn dịch Western blot 25 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Thiết kế vector tách dòng pRTRA tái tổ hợp gen mã hóa kháng nguyên GP5-M gắn kết Elastin like-polypeptide 27 3.1.1 Kết khuếch đại đoạn gen gp5-m kỹ thuật PCR 27 3.1.2 Tạo vector tách dịng pRTRA tái tổ hợp gen mã hóa kháng ngun GP5M gắn kết Elastin like-polypeptide 27 3.1.3 Thiết kế vector chuyển gen pCB301 tái tổ hợp gen mã hóa kháng nguyên GP5-M gắn kết Elastin like-polypeptide 30 3.1.4 Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector pCB301-gp5-m100xELP tái tổ hợp 32 3.2 Kết biểu gen gp5-m thuốc N benthamiana 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 Kết luận 36 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT bp Base pair CMV Cauliflower mosaic virus cDNA Complementary DNA DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetra-Acetate acid EtBr Ethidium Bromide HA Hemagglutinin Kb Kilobase KDa Kilodalton LB Luria and Bertani PBS Phosphate-buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction PCS Polycloning site RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease SAP Shrimp alkaline phosphatase SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris Acetate EDTA Taq DNA polymerase Thermus polymerase v/p vòng/phút ix aquaticus DNA DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 18 Bảng 2.2 Thành phần tham gia phản ứng PCR 19 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nối ghép gen 20 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt plasmid enzyme cắt giới hạn 24 x DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Đặc điểm hình thái virus PRRS Hình 1.2 Mơ hình cấu trúc khung đọc mở hệ gen virus PRRS Hình 1.3 Cây N benthamiana 13 Hình 2.1 Xâm nhiễm phƣơng pháp hút chân không 34 Hình 3.1 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen gp5-m phản ứng PCR 27 Hình 3.2 Colony-PCR chọn dòng tế bào E.coli mang plasmid pRTRA-gp5-mELP 28 Hình 3.3 Kiểm tra sản phẩm cắt vector pRTRA-gp5-m-ELP tái tổ hợp enzyme giới hạn HindIII 29 Hình 3.4 Bản đồ cấu trúc vector tách dịng pTRA35S-gp5-m –ELP 30 Hình 3.5 Kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pCB301-gp5-m-ELP tái tổ hợp enzyme cắt giới hạn HindIII 31 Hình 3.6 Bản đồ cấu trúc vector chuyển gen pCB301-gp5-m-100xELP 32 Hình 3.7 Colony-PCR 33 Hình 3.8 Xác định biểu kháng nguyên GP5-M Western blot 35 xi MỞ ĐẦU Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) bệnh truyền nhiễm nguy hiểm virus gây ra, có khả lây lan nhanh gây thiệt hại nặng nề cho ngành kinh tế Ở Việt Nam, bệnh đƣợc gọi bệnh “lợn tai xanh” lợn mắc bệnh thƣờng bị xung huyết tai, lúc đầu đỏ sẫm sau tím xanh Đặc trƣng bệnh tƣợng sẩy thai lợn nái chửa triệu chứng bệnh đƣờng hô hấp, đặc biệt lợn cai sữa Bệnh đƣợc phát lần Hoa Kỳ năm 1987 Sau xuất nhiều nƣớc chăn nuôi lợn theo phƣơng thức công nghiệp: Canada (1987); Nhật Bản (1989); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Anh, Pháp (1991); Đan Mạch (1992)… Từ năm 1992, bệnh gây ổ dịch lớn nhiều nƣớc khác thuộc Bắc Mỹ, châu Âu châu Á, gây tổn thất lớn cho nghề chăn nuôi lợn giới Ở Việt Nam, lần phát đƣợc huyết dƣơng tính với PRRS đàn lợn nhập từ Hoa Kỳ năm 1997 (Tô Long Thành, 2007) Sau nhiều năm khơng có dịch, đến đầu tháng năm 2007, lần dịch bệnh bùng phát dội tỉnh Hải Dƣơng, sau lan nhanh sang tỉnh lân cận nhƣ Hải Phịng, Thái Bình, Hƣng n, Bắc Ninh, Bắc Giang Quảng Ninh Cho đến nay, dịch bệnh bùng phát rộng khắp ba miền nƣớc, gây thiệt hại nặng nề kinh tế nhƣ vấn đề an sinh xã hội cho địa phƣơng PRRS bệnh virus gần nhƣ đồng thời đƣợc tìm thấy Mỹ châu Âu vào cuối năm 1980 đầu năm 1990, tƣơng ứng Cho đến nay, PRRS lan rộng toàn giới với đặc điểm dịch bệnh đặc hữu nƣớc nuôi lợn, gây thiệt hại kinh tế lớn năm Nghiên cứu phát triển vaccine PRRS hiệu đầu nghiên cứu lâm sàng năm gần Mặc dù vắc-xin sống biến đổi (MLV) vaccine bất hoạt có sẵn thị trƣờng đƣợc sử dụng rộng rãi Đã khơng có báo xii cáo cho thấy virus sống có khả trở lại độc lực gây triệu chứng giống nhƣ PRRS suốt thời gian tồn đàn lợn sau chủng ngừa Vaccine giết chết cung cấp khả miễn dịch bảo vệ vững cấp độ đàn Có yêu cầu cấp bách để phát triển văcxin hiệu thay đổi chiến lƣợc chống lại bệnh Thiết kế virus tái tổ hợp phƣơng pháp phổ biến hữu ích Vacine thực vật hay cịn goị vaccine ăn đƣợc (edible vacine) sản phẩm công nghệ sinh học đại Thực chất vacine thực vật vacine tiểu đơn vị đƣợc sản xuất dựa hệ thống thực vật để thu protein kháng nguyên mong muốn So với hệ thống sản xuất vacine truyền thống, vacine thực vật có nhiều ƣu điểm nhƣ: dễ dàng tăng quy mô sản xuất thu sinh khối; kháng nguyên biểu thực vật ổn định nhiệt độ phòng nên dễ bảo quản sử dụng; dùng qua đƣờng miệng nhƣ ăn tƣơi nấu chín an tồn; đặc biệt vacine ăn đƣợc kích thích sản xuất kháng thể hệ thống niêm mạc ruột hiệu vacine tiêm Từ sở lựa chọn đề tài “Nghiên cứu biểu protein tái tổ hợp GP5-M virus PRRS gây Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn” Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn 1.1.1 Giới thiệu chung Bệnh xâm nhiễm vào lợn lứa tuổi, tỷ lệ Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRS viết tắt của: Porcine reproductive and respiratory syndrome) hay gọi bệnh lợn tai xanh bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, lây lan nhanh làm chết nhiều lợn, bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành chăn ni lợn nƣớc nói riêng giới nói chung Bệnh xâm nhiễm vào lợn lứa tuổi, tỷ lệ chết thay đổi theo nhóm lợn khác từ 20-100% Thời gian ủ bệnh 2-5 tuần Tốc độ lây lan nhanh vòng 3-5 ngày từ vài cá thể nhiễm bệnh dẫn đến đàn bị nhiễm bệnh Sự lây lan bệnh chủ yếu thông qua tiếp xúc trực tiếp lợn bệnh lợn khỏe mạnh Virus gây bệnh có dịch mũi, nƣớc bọt, tinh dịch (trong giai đoạn nhiễm trùng máu), phân, nƣớc tiểu phát tán môi trƣờng Ở lợn mẹ mang trùng, virus lây nhiễm cho bào thai từ giai đoạn thai kỳ trở đi, virus đƣợc thải qua nƣớc bọt sữa Virus phát tán thơng qua hình thức: vận chuyển lợn mang trùng, theo gió (có thể xa tới km), bụi, bọt nƣớc, dụng cụ chăn nuôi dụng cụ bảo hộ lao động nhiễm trùng, thụ tinh nhân tạo số lồi chim hoang Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn lần đƣợc ghi nhận Hoa Kỳ vào năm 1987, vào thời điểm đó, có mẫu bệnh phẩm lợn phân lập virus nhƣng chủng khơng có độc tính chƣa xác định đƣợc bệnh nên gọi “bệnh bí hiểm” (MD: Mystery Swine) sau có tên lần lƣợt nhƣ sau:  Bệnh tai xanh lợn (MDS: Mystery Swine Disease)  Bệnh dịch 89 lợn Plasmid tái tổ hợp đƣợc tạo từ phản ứng lai s đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli DH5α phƣơng pháp sốc nhiệt để chọn lọc, nhân nhanh plasmid với số lƣợng lớn Để biết chắn plasmid đƣợc biến nạp thành công, tiến hành nuôi vi khuẩn sau biến nạp tách plasmid khuẩn biến nạp vector tái tổ hợp (các plasmid cho kết dƣơng tính với colony-PCR), sau kiểm tra cắt enzyme giới hạn HindIII, đồng thời giữ dòng glycerol 100% bảo quản -80oC để phục vụ cho nghiên cứu Hình 3.5 Kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pCB3 1-gp5-m-ELP tái tổ hợp enzyme cắt giới hạn HindIII M- Marker DNA; 1-6 Sản phẩm cắt plasmid pCB301-gp5-m-ELP Kết điện di kiểm tra gel agarose 0,8 % cho vạch băng sáng, rõ, khơng đứt nét Các vạch băng trùng với kích thƣớc mong muốn mà theo lý thuyết kích thƣớc pCB301 5508 bp, cassette biểu mang gen gp5-m 3487 bp Qua đó, chúng tơi khẳng định thiết kế thành công vector chuyển gen pCB301-gp5-m-ELP Các vector đƣợc biến nạp thành công vào vi khuẩn E.coli chủng DH5α Hình 3.6 thể cấu trúc vector chuyển gen pCB301-gp5m-ELP 31 Hình 3.6 Bản đồ cấu trúc vector chuyển gen pCB301-gp5-m-100xELP 3.1.4 Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector pCB301-gp5-m100xELP tái tổ hợp Vector tái tổ hợp pCB301-gp5-m-100xELP đƣợc biến nạp vào A tumefaciens phƣơng pháp xung điện Sản phẩm trình biến nạp đƣợc cấy trải đĩa chứa môi trƣờng LB đặc bổ sung kháng sinh 50 mg/l Rifamycin, 50 mg/l Carbenicilin, 50 mg/l Kanamycin Các dịng khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc chọn lọc phản ứng colony-PCR 32 Hình 3.7 Colony-PCR M: Marker; (+): đối chứng dƣơng; 1-6: sản phẩm colony-PCR nhân gen gp5-m Kết colony-PCR từ khuẩn lạc cho vạch băng với kích thƣớc khoảng 1056 trùng kích thƣớc lý thuyết tính tốn gen mã hóa kháng ngun GP5-M (hình 3.7) Nhƣ vậy, chúng tơi thiết kế thành công cấu trúc vector biểu mang gen mã hóa kháng nguyên GP5-M dƣới điều khiển constitutive promoter 35S CaMV tạo chủng Agrobacterium mang vector chuyển gen pCB301-gp5m-ELP tƣơng ứng Các chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng để chuyển gen gp5-m vào mô thuốc phƣơng pháp Agroiniltration nhằm tổng hợp prtein kháng nguyên virus gây bệnh lợn tai xanh thực vật, phục vụ mục đích sản xuất vaccine tiểu đơn vị phịng bệnh lợn tai xanh có nguồn gốc từ thực vật 3.2 Kết biểu gen gp5-m thuốc N benthamiana Chủng A tumefaciens mang vector tái tổ hợp pCB301 chứa cassette biểu 35S-gp5-m-100xELP đƣợc sử dụng để biểu protein GP5-M mô thuốc phƣơng pháp biểu tạm thời 33 (a) (b) Hình 3.8 Xâm nhiễm phƣơng pháp hút chân khơng (a): Cây bị nhấn dìm bình chứa vi khuẩn bên bình hút chân không; (b): Cây trƣớc (bên phải) sau (bên trái) hút chân không Để đánh giá mức độ hoạt động vector mang gen mã hóa cho protein tái tổ hợp GP5-M, thuốc sau đƣợc biến nạp Agrobacterium vector hỗ trợ mang gen mã hóa cho protein HcPro PRRS (hình 3.8) đƣợc ni chăm sóc điều kiện phù hợp Chủng vi khuẩn mang vector pCB301-gp5-m-ELP với chủng vi khuẩn mang vector hỗ trợ biểu gen HCPro đƣợc nuôi đến nồng độ khuẩn đạt OD=0.5 đƣợc xâm nhiễm vào thuốc 6-8 tuần tuổi phƣơng pháp hút chân không Mẫu s đƣợc thu sau ngày xâm nhiễm để tách protein Mức độ biểu GP5-M đƣợc đánh giá phƣơng pháp lai miễn dịch Kết thể Hình 3.9 34 Hình 3.9 Xác định biểu kháng nguyên GP5-M Western blot Sử dụng anticmyc-antibody; M: marker protein 10-170 kDa; 1: Dịch chiết protein chứa kháng nguyên GP5-M; (-): Dịch chiết wild type Trên hình ảnh Westent-blot vạch băng màu nâu đen có kích thƣớc khoảng 89,9 kDa giếng với kích thƣớc protein GP5-M theo tính tốn lý thuyết Nhƣ vậy, protein GP5-M đƣợc biểu thành công phƣơng pháp agroinfiltration Kết lần khẳng định thiết kế thành công vector pCB301-gp5-m-ELP gen mã hóa cho protein GP5M hoạt động dƣới hỗ trợ vector mang gen mã hóa cho protein HCPro 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Thiết kế thành công vector chuyển gen pCB301-gp5-m-ELP Tạo thành công chủng A.tumefaciens mang vector tƣơng ứng Biểu tạm thời protein tái tổ hợp GP5-M phƣơng pháp agroinfiltration thành công Kiến nghị Trên sở kết đạt đƣợc, để tiếp tục phát triển kết nghiên cứu, đề xuất số kiến nghị sau: - Nghiên cứu tìm phƣơng pháp tinh phù hợp mang lại hiệu cao với protein GP5-M - Tiếp tục biểu tinh quy mô lớn protein GP5-M, nhằm định hƣớng ứng dụng cho việc sản xuất vacxin hệ - Tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm chuột, lợn để đánh giá mức độ chất lƣợng protein tái tổ hợp - Ứng dụng hệ thống biểu tạm thời phƣơng pháp agroinfiltration để biểu protein tái tổ hợp khác thực vật 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Arakawa, T., Chong,D.K., Merritt, J.L., and Langridge,W.H (1997) Expression of cholera toxin B subunit oligomers in transgenic potato plants Transgenic Research 6:403-413 Berinstein,A., Vazquez-Rovere,C., Asurmendi,S., Gomez,E., Zanetti,F., Zabal,O., Tozzini,A., Conte,G.D., Taboga,O., Calamante,G., Barrios,H., Hopp,E., and Carrillo,E (2005) Mucosal and systemic immunization elicited by Newcastle disease virus (NDV) transgenic plants as antigens Vaccine 23:5583-5589 Botner, A., Nielsen, J., Oleksiewicz, M.B., Storgaard, T (1999) Heterologous challenge with porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) vaccine virus: no evidence of reactivation of previous Europe-an-type PRRS virus infection Vet Microbiol 68, 187–195 Brenneis, A., Gaudreau, L., Seifert, M., Karl, H., Brandt, M S., Huebl, H., Garrido, J A., Koppens, F H., and Holleitner, A W (2015) Ultrafast electronic readout of diamond nitrogen-vacancy centres coupled to graphene, Nat Nanotechnol 10, 135-139 Chang, C.-K., Wu, C.-C., Wang, Y.-S., and Chang, H.-C (2008) Selective extraction and enrichment of multiphosphorylated peptides using polyarginine-coated diamond nanoparticles, Anal Chem 80 Chen J., Skehel J J., Wiley D C (1999) N- and C- terminal residues combine in the fusion-pH influenza hemagglutinin HA(2) subunit to form an N cap that terminates the triple strained coiled coil Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of the America, 96(16): 89678972 Chia MY, Hsiao SH, Chan HT, Do YY, Huang PL, Chang HW, Tsai YC, Lin CM, Pang VF, Jeng CR (2010) Immunogenicity of recombinant GP5 protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus expressed in tobacco plant Vet Immunol Immunopathol 135:234-242 Chu Hoàng Hà Báo cáo tổng kết đề tài: “Nghiên cứu tạo giống ăn kháng bệnh virus phổ rộng kỹ thuật chuyển gen đa đoạn” Đề tài thuộc chƣơng trình trọng điểm cấp nhà nƣớc CNSH (KC04), 2007-2009 Chu Hoàng Hà Báo cáo tổng kết đề tài:” Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên virus gây bệnh lợn tai xanh thuốc Nicotiana benthamiana phƣơng pháp agroinfiltration” Đề tài cấp Viện công nghệ sinh học, 2013-2014 10 Cục thú y (2008), “Báo cáo tổng kết cơng tác phịng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm năm 2007 phƣơng hƣớng 2008” 11 Curtiss,R.I., and Cardineau,C.A (1990) Oral immunisation by transgenic plants World Patent Application 1990, WO90/02484 12 Daniell H, Streatfield SJ, Wycoff K (2001) Medical molecular farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants Trends Plant Sci 6:219-226 13 Dean Ho, C.-H K W., and Edward Kai-Hua Chow (2015) Nanodiamonds: The intersection of nanotechnology, drug development, and personalized medicine, Science Advances Vol 14 Dea S., Gagnon C.A., Mardassi H., Pirzadeh B., Rogan D., Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates, Arch Virol.145 (2000), 659 -688 15 Đậu Ngọc Hào, Văn Đăng Kỳ, Nguyễn Văn Long, Tiêu Quang , Một số đặc điểm dịch tễ hội chúng rối loạn sinh sản hô hấp lợn từ cuối tháng đến đầu tháng 7/2008 số tỉnh nƣớc Khoa học kỹ thuật thú y, tập XV, (2008) 14-20 16 Fischer R., Schumann,D., Zimmermann,S., Drossard,J., Sack,M., and Schillberg,S (1999) Expression and characterization of bispecific single-chain Fv fragments produced in transgenic plants European Journal of Biochemistry 262:810-816 17 Fischer,R., and Emans,N (2000) Molecular farming of pharmaceutical proteins Transgenic Research 9:279-299 18 Floss,D.M., Falkenburg,D., and Conrad,U (2007) Production of vaccines and therapeutic antibodies for veterinary applications in transgenic plants: an overview Transgenic Research 16:315-332 19 Floss, D.M., Mockey, M., Zanello, G., Brosson, D., Diogon, M., Frutos, R., Bruel, T., Rodrigues, V., Garzon, E., Chevaleyre, C., Berri, M., Salmon, H., Conrad, U., and Dedieu, L (2010a) Expression and immunogenicity of the mycobacterial Ag85B/ESAT-6 antigens produced in transgenic plants by elastin-like peptide fusion strategy J Biomed Biotechnol 2010: 1-15 20 Gleba Y, Klimyuk V, Marilloinnet S (2007) Viral vectors for the expression of proteins in plants Curr Opin Plant Biol 18: 134-141 21 Ha Y., Stevens D J., Skehel J J., Wiley D C (2001) X-ray structure of H5 avian and H9 swine influenza virus hemagglutinin bound to avian and human receptor analogs Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of the America, 98(20): 11181-11186 22 Horimoto T., Kawaoka Y (1995) The hemagglutinin cleavability of a virulent avian influenza virus by subtilisin like endoproteases is influenced by the amino acid immediately downstream of the cleavage site Virology, 102210(2): 466-470 23 Hou YH, Chen J, Tong GZ, Tian ZJ, Zhou YJ, Li GX, Li X, Peng JM, An TQ, Yang HC (2008) A recombinant plasmid co-expressing swine ubiquitin and the GP5 encoding-gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus induces protective immunity in piglets Vaccine 26:1438–1449 24 Hồ Thị Thƣơng, Nguyễn Thu Giang, Chu Thị Kim Hoàng, Phạm Thị Vân, Phạm Bích Ngọc, Đinh Duy Kháng, Chu Hoàng Hà, Nghiên cứu biểu tạm thời kháng nguyên GP5 virus gây bệnh lợn tai xanh thuốc (Nicotiana benthamiana) phƣơng pháp agro-infiltration Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 31, (1) (2015) 25 Hsieh, C C., Guo, J Y., Hung, S U., Chen, R., Nie, Z X., Chang, H C., and Wu, C C (2013) Quantitative Analysis of Oligosaccharides Derived from Sulfated Purification and Glycosaminoglycans by Matrix-Assisted Laser Nanodiamond-Based Desorption/Ionization Affinity Mass Spectrometry, Anal Chem 85, 4342-4349 26 Ito, T A., Cacioppo, J T., & Lang, P J (1998) Eliciting affect using the International Affective Picture System: Bivariate evaluation and ambivalence Personali and Social Psychology Bulletin 24, 855- 879 27 Jani D, Meena LS, Rizwan UHQM, Singh Y, Sharma AK and Tyagi AK (2002) Expression of cholera toxin B subunit in transgenic tomato plants Transgenic Res 1: 447-454 28 Jiang W, Jiang P, Li Y, Tang J, Wang X, Ma S (2006a) Recombinant adenovirus expressing GP5 and M fusion proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus induce both humoral and cell-mediated immune responses in mice Vet Immunol Immunopathol 113:169–180 29 Johansen L.K and Carrington, J.C (2001) Silencing on the spot: Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system Plant Physiol 126: 930–938 30 Kalepu, S., and Nekkanti, V (2015) Insoluble drug delivery strategies: review of recent advances and business prospects, Acta pharmaceutica Sinica B 5, 442-453 31 Kazi, S (2014) A Review Article on Nano diamonds Discussing Their Properties and Applications International Journal of Pharmaceutical Science Invention, 3(7), 40-45 ISSN: 2319 – 6718 32 Keawcharoen J., Amonsin A., Oraveerakul K., Wattanodom S., Papravasit T., Kamda S., Lekakul K., Pattanarangsan R., Noompanth S., Fouchier R A., Osterhaus A D., Payungpom S., Theamboonler A., Poovorawan Y (2005) Characterization of hemagglutinin and neuraminidase genes of recent influenza virus isolates from different avian species in Thailand Acta virologica, 49(4): 277-280 33 Knowles, H S., Kara, D M., and Atature, M (2014) Observing bulk diamond spin coherence in high-purity nanodiamonds, Nature materials 13, 2125 34 Kucsko, G., Maurer, P C., Yao, N Y., Kubo, M., Noh, H J., Lo, P K., Park, H., and Lukin, M D (2013) Nanometre-scale thermometry in a living cell, Nature 500, 54-U71 35 Li Y, Lopez P, Durand P, Ouazzani J, Badet B, Badet Denisot MA (2007) An enzyme-coupled assay for amidotransferase activity of glucosamine6-phosphate synthase Anal Biochem 370(2):142-6 36 Mason,H.S., and RNAtzen,C.J (1995) Transgenic plants as vaccine production systems Trends in Biotechnology13:388-392 37 Mason,H.S., and Arntzen,C.J (1995) Transgenic plants as vaccine production systems Trends in Biotechnology 13:388-392 38 Meng XJ (2000) Heterogeneity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: implications for current vaccine efficacy and future vaccine development Vet Microbiol 74:309–329 39 Nilubol D, Platt KB, Halbur PG, Torremorell M, Harris DL (2004) The effect of a killed porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccine treatment on virus shedding in previously PRRSV infected pigs Vet Microbiol 102:11–18 40 Nguyễn Thị Minh Hằng, Hồ Thị Thƣơng, Nguyễn Thu Giang, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà, Biểu tinh protein M virus prrs gây bệnh lợn tai xanh công nghệ biểu tạm thời thuốc Nicotinana benthamiana Công nghệ sinh học 15 (3), Chấp nhận đăng (2017) 41 Nguyễn Thị Minh Hằng, Hồ Thị Thƣơng, Nguyễn Thu Giang, Phạm Bích Ngọc, Nguyễn Trung Nam, Chu Hồng hà Tách dịng đồng biểu gen mã hóa hai loại kháng nguyên vỏ GP5ecto (vùng ngoại bào) M virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp lợn Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 150-158 42 Perevedentseva, E., Cai, P J., Chiu, Y C., and Cheng, C L (2011) Characterizing Protein Activities on the Lysozyme and Nanodiamond Complex Prepared for Bio Applications, Langmuir 27, 1085-1091 43 Phạm Bích Ngọc (2017) Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp virus gây bệnh cúm H7N9 thuốc (Nicotiana sp.) phƣơng pháp agroinfiltration phục vụ cho mục đích tạo vacxin hệ 44 Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hồng Hà, Lê Trần Bình (2009) Tạo thuốc chuyển gen kháng virus CMV kỹ thuật RNAi Tạp chí CNSH 6(4A):679-687 45 Phan, H.T., and Conrad, U (2011) Membrane-based inverse transition cycling: An improved means for purifying plant-derived recombinant proteinelastin-like polypeptide fusions Int J Mol Sci 12(5): 2808-2821 46 Prasad,V., Satyavathi,V.V., Sanjaya, Valli,K.M., Khandelwal,A., Shaila,M.S., and Lakshmi Sita,G (2004) Expression of biologically active Hemagglutinin-neuraminidase protein of Peste des petits ruminants virus in transgenic pigeonpea [Cajanus cajan (L) Millsp.] Plant Science 166:199-205 47 Qiu HJ, Tian ZJ, Tong GZ, Zhou YJ, Ni JQ, Luo YZ, Cai XH (2005) Protective immunity induced by a recombinant pseudorabies virus expressing the GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in piglets Vet Immunol Immunopathol 106: 309–319 48 Rigano,M.M., Alvarez,M.L., Pinkhasov,J., Jin,Y., Sala,F., Arntzen,C.J., and Walmsley,A.M (2004) Production of a fusion protein consisting of the enterotoxigenic Escherichia coli heat-labile toxin B subunit and a tuberculosis antigen in Arabidopsis thaliana Plant Cell Reports 22:502-508 49 Schillberg,S., Fischer,R., and Emans,N (2003) Molecular farming of recombinant antibodies in plants Cellular and Molecular Life Sciences 60:433445 50 Scheller, J., Henggeler, D., Viviani, A., and Conrad, U (2004) Purification of spider silk-elastin from transgenic plants and application for human chondrocyte proliferation Transgenic Res 13: 51-57 51 Shukla, D.D., Frenkel, M.J., McKern, N.M., Ward, C.W., Jilka, J., Tosic, M.,Ford, R.E (1992) Present status of the sugarcane mosaic subgroup of potyviruses Arch Virol., Suppl 5, 363–373 52 Shukla, D.D., Ward, C.W.(1989) Identification and classification of potyviruses on the basis of coat protein sequence data and serology Brief review Arch Virol 106 (3 –4), 171 –200 53 Silhavy D, Burgya´n J (2004) Effects and side-effects of viral RNA silencing suppressors on short RNAs Trends Plant Sci 9: 76–83 54 Skehel, J.J., Wiley,D.C (2000) Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin Annu Rev Biochem 69:531-69 55 Suzuki, Y (2005) Sialobiology of influenza: molecular mechanism of host range variation of influenza viruses Biol Pharm Bull 28:399-408 56 Svedda M M., Lai C J (1981) Functional expression in primate cells if cloned DNA coding for the hemagglutinin surface glycoprotein of influenza virus Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of the America, 78 (9): 5489-5492 57 Takeda S, Kadowaki S, Haga T, Takaesu H, Mitaku S (2002) Identification of G protein-coupled receptor gens from the human genome sequence FEBS Lett 520:97–101 58 Tô Long Thành, Hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp lợn, Tạp chí Khoa học thú y, tập XIV trang 81-89 59 Trịnh Ngọc Ánh, Nghiên cứu biểu tinh protein tái tổ hợp M virus gây bệnh lợn tai xanh thuốc phƣơng pháp agroinfiltration Khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành CNSH trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam,(2016) 60 Vaijayanthimala, V., Lee, D K., Kim, S V., Yen, A., Tsai, N., Ho, D., Chang, H C., and Shenderova, O (2015) Nanodiamond-mediated drug delivery and imaging: challenges and opportunities, Expert Opin Drug Del 12, 735-749 61 Van Ginkel, J.H., Gorissen, A and Polci, D (2000) Elevated atmospheric carbon dioxide concentration: effects of increased carbon input in a Lolium perenne soil on microorganisms and decomposition Soil Biology & Biochemistry 32: 449-456 62 Verwoerd,T.C., van Paridon,P.A., van Ooyen,A.J., van Lent,J.W., Hoekema,A., and Pen,J (1995) Stable accumulation of Aspergillus niger phytase in transgenic tobacco leaves Plant Physiology 109:1199-1205 63 Vũ Đăng Thuận, Nghiên cứu số đặc điểm dịch tễ hộ chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn địa bàn tỉnh Bắc Giang biện pháp phòng chống Luận văn thạc sĩ thú y, Trƣờng đại học Nông lâm Thái nguyên (2015) 64 Wagner R., Maosovich M., Klenk H (2002).Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in fluenza virus infection Reviews in medical virology, 12(3): 159-166 65 Wagner,B., Fuchs,H., Adhami,F., Ma,Y., Scheiner,O., and Breiteneder,H (2004) Plant virus expression systems for transient production of recombinant allergens in Nicotiana benthamiana Methods 32:227-234 66 Wang S, Fang L, Fan H, Jiang Y, Pan Y, Luo R, Zhao Q, Chen H, Xiao S (2007) Construction and immunogenicity of pseudotype baculovirus expressing GP5 and M protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Vaccine 25:8220–8227 67 Wei, L., Zhang, W., Lu, H., and Yang, P (2010) Immobilization of enzyme on detonation nanodiamond for highly efficient proteolysis, Talanta 80, 1298-1304 68 Wu, T J., Tzeng, Y K., Chang, W W., Cheng, C A., Kuo, Y., Chien, C H., Chang, H C., and Yu, J (2013) Tracking the engraftment and regenerative capabilities of transplanted lung stem cells using fluorescent nanodiamonds, Nat Nanotechnol 8, 682-689 69 Xiang, C., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., and Oliver, D (1999) A mini binary vector series for plant transformation Plant Mol Biol 40: 711-717 70 Zelada, A.M., Calamante,G., de la Paz,S.M., Bigi,F., Verna,F., Mentaberry,A., and Cataldi,A (2006) Expression of tuberculosis antigen ESAT6 in Nicotiana tabacum using a potato virus X-based vector Tuberculosis (Edinb) 86:263-267 71 Zhang , X., Du, P., Lu, L., Xiao,Q., Wang ,Q , Cao,X.,Ren, B., , Wei, C , Li, Y.(2008) Contrasting effects of HC-Pro and 2b viral suppressors from Sugarcane mosaic virus and Tomato aspermy cucumovir us on the accumulation of siRNAs Virology 374, 351 – 360 72 Zheng Q, Chen D, Li P, Bi Z, Cao R, Zhou B, Chen P (2007) Coexpressing GP5 and M proteins under different promoters in recombinant modified vaccinia virus ankara (rMVA)-based vaccine vector enhanced the humoral and cellular immune responses of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) Virus Genes 35, 585–595 73 Zhou YJ, Yu H, Tian ZJ, Li GX, Hao XF, Yan LP, Peng JM, An TQ, Xu AT, Wang YX, Wei TC, Zhang SR, Cai XH, Feng L, Li X, Zhang GH, Zhou LJ, Tong GZ , Genetic diversity of the ORF5 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in China from 2006 to 2008, Virus Res 144 (2009) 136– 144 ... thích sản xuất kháng thể hệ thống ni? ?m mạc ruột hiệu vacine ti? ?m Từ sở lựa chọn đề tài ? ?Nghiên cứu biểu protein tái tổ hợp GP5- M virus PRRS gây Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn? ?? Chƣơng TỔNG... QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn 1.1.1 Giới thiệu chung Bệnh x? ?m nhi? ?m vào lợn lứa tuổi, tỷ lệ Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRS viết tắt của: Porcine reproductive... vector pRTRA -gp5- m- ELP tái tổ hợp enzyme giới hạn HindIII M- Marker DNA; 1 -Sản ph? ?m cắt pRTRA -gp5- m- ELP enzyme HindIII Theo kết cắt ki? ?m tra vector tái tổ hợp mang gen gp5- m enzyme giới hạn (Hình