Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (m, GP5, GP5ectoM) của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ agrobacterium tt

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HẰNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M, GP5, GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY THUỐC LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC NHỜ AGROBACTERIUM Chuyên ngành: Hoá sinh học Mã số: 9420116 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2019 Cơng trình hồn thành Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Trung Nam Viện Công nghệ sinh học PGS TS Chu Hồng Hà Viện Cơng nghệ sinh học Phản biện 1: PGS TS Đồng Huy Gới Phản biện 2: GS TS Đậu Ngọc Hào Phản biện 3: GS TS Chu Hoang Mậu Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án phiên thức Viện Công nghệ sinh học Vào hồi ……giờ… , ngày… tháng… năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Viện Công nghệ sinh học - Trang web Bộ GD & ĐT NHỮNG CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Thị Minh Hằng, Hồ Thị Thương, Nguyễn Thu Giang, Phạm Bích Ngọc, Nguyễn Trung Nam, Chu Hồng Hà (2017) Tách dòng đồng biểu gen mã hóa hai loại kháng nguyên vỏ GP5ecto (vùng ngoại bào) M virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghẹ, Tập 33(1S): 150-158 Nguyễn Thị Minh Hằng, Hồ Thị Thương, Nguyễn Thu Giang, Phạm Thị Vân, Phạm Bích Ngọc, Nguyễn Trung Nam, Chu Hoàng Hà (2017) Biểu tinh sạch protein M virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh công nghệ biểu tạm thời thuốc Nicotinana benthamiana Tạp chí Công nghẹ Sinh học 15(3): 547-554 Nguyễn Thị Minh Hằng, Hồ Thị Thương, Phạm Bích Ngọc, Nguyễn Trung Nam, Chu Hoàng Hà (2018) Xác định khả kích thích tạo kháng thể đặc hiệu kháng nguyên tái tổ hợp GP5-ELP virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn động vật thí nghiệm Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y Tập 25(5): 35-42 Nguyễn Thị Minh Hằng, Hồ Thị Thương, Nguyễn Thu Giang, Phạm Bích Ngọc, Nguyễn Trung Nam, Chu Hoàng Hà (2018) Nghiên cứu tối ưu điều kiện biểu tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M virus PRRS thuốc Nicotinana benthamiana Tạp chí Công nghẹ Sinh học 16(2): 293-300 Nguyễn Thị Minh Hằng, Phạm Bích Ngọc, Nguyễn Trung Nam, Chu Hoàng Hà (2018) Đánh giá khả kích thích đáp ứng kháng thể đặc hiệu kháng nguyên M GP5ectom/PRRSV sản xuất từ thực vật chuột bạch Hội nghị Khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2018: 194-199 Nguyễn Thị Minh Hằng, Hồ Thị Thương, Nguyễn Thu Giang, Phạm Bích Ngọc, Nguyễn Trung Nam, Chu Hoàng Hà (2016) Đánh giá biểu tạm thời kháng nguyên GP5 tái tổ hợp virus PRRS mô thuốc Nicotinana tabacum Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc lần thứ IV, khu vực phía nam, 2016: “Ứng dụng Công nghệ sinh học vào thực tiễn”; P1-14:57 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (Porcine reproductive and respiratory syndrome – PRRS) bệnh truyền nhiễm nguy hiểm lợn virus gây Ở Việt Nam, bệnh gọi “Bệnh lợn tai xanh” (theo ngôn ngữ đại chúng) lợn mắc bệnh thường bị xung huyết tai, lúc đầu đỏ sẫm, sau tím xanh PRRS gây thiệt hại kinh tế lớn nước có bệnh PRRS phát Mỹ vào năm 1987 Hàng năm nước Mỹ phải chịu thiệt hại bệnh ước tính khoảng 664 triệu USD cho việc tiêu huỷ lợn chết, lợn ốm, chi phí chống dịch xử lý môi trường Ở Việt Nam, dịch PRRS virus thể độc lực cao xuất lần vào năm 2007 Từ đến nay, dịch xuất hầu hết địa phương nước Theo thống kê Cục Thú y, từ cuối tháng 4/2016 đến tháng 11/2016, xuất 14 ổ dịch PRRS tại huyện tỉnh Quảng Trị, Hậu Giang, Nghệ An Hà Tĩnh, làm 3.433 lợn mắc bệnh, có 1.242 lợn bị tiêu huỷ PRRS ảnh hưởng nặng nề tới ngành chăn nuôi lợn nước Bệnh xuất số địa phương có tính chất 2-3 năm lần Điều cho thấy nguy xuất trở lại dịch bệnh thời gian tới Hiện nay, vaccine phòng PRRS chủ yếu vaccine vơ hoạt nhược độc Các vaccine vơ hoạt thường an tồn khả bảo hộ thấp Các vaccine nhược độc bảo hộ tốt nhiều lo ngại tính an toàn loaị vaccine Vaccine nhược độc giảm dần mức bảo hộ giảm mức tương đồng với chủng (nếu có) thân virus vaccine sau nhiều lần truyền nhiễm đột biến trở thành cường độc Mặc dù vậy, phòng chống PRRS tại Việt Nam đạt hiệu cao Hiện nay, dịch xuất lẻ tẻ, năm gần khơng có dịch, phần nhờ biện pháp chủ động tiêm phòng cho lợn Virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn nước ta xác định thể độc lực cao chưa có thuốc đặc trị Việc phòng chống dịch chủ yếu tiêm phòng vaccine kết hợp biện pháp thú y (Tiêu độc khử trùng, vệ sinh truồng trại, cách ly tiêu huỷ lợn bệnh ) Để phòng chống virus thể độc lực cao lưu hành tại Việt Nam cần phải có thêm vaccine phù hợp Nhu cầu loại vaccine PRRS hệ có vaccine tiểu đơn vị, an toàn hiệu vấn đề cấp thiết Protein GP5 M protein cấu trúc chính virus PRRS (PRRSV) lựa chọn ứng viên tiềm để sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống PRRSV Các kháng thể kháng GP5 M lợn kháng thể có khả trung hồ PRRSV Sự kết hợp đoạn peptit miền kháng nguyên GP5 (GP5ecto) cho chứa epitope trung hoà GP5 với protein M với mong muốn tạo protein tái tổ hợp heterodimer GP5ectoM có khả kích thích tạo đáp ứng miễn dịch mạnh trở thành ứng viên tiềm để phát triển sản xuất vaccine chống PRRSV Kháng nguyên virus PRRS sản xuất hệ thống thực vật nhằm phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS thơng qua phương pháp biểu gen tạm thời Hệ thống biểu gen tạm thời thực vật phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium nhằm sản xuất kháng nguyên có nhiều ưu điểm như: Mức độ biểu kháng nguyên cao, sản xuất quy mô lớn, phương pháp thực đơn giản, thời gian nhanh, không bị ảnh hưởng vị trí gắn gen đích tế bào thực vật tiến hành biểu mơ biệt hóa hồn tồn lá, cung cấp kháng nguyên cho mục đích sản xuất vaccine chống chủng virus xuất cách nhanh chóng dịch bệnh xảy Căn vào luận khoa học tình hình thực tiễn nêu trên, luận án thực với đề tài “Nghiên cứu biểu kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn thuốc bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium” với mục đích tạo sở khoa học thực nghiệm để biểu gen mã hoá kháng nguyên chủng virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn lưu hành Việt Nam phương pháp biểu gen tạm thời thực vật phục vụ cho định hướng phát triển sản xuất vaccine hệ Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung Nghiên cứu sở khoa học thực nghiệm việc sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp M/GP5/GP5ectoM chủng virus PRRS (PRRSV) gây bệnh lợn tai xanh Việt Nam công nghệ biểu tạm thời thuốc phục vụ cho định hướng phát triển vaccine hệ Mục tiêu cụ thể − Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen mang gen m, gp5optimize (gp5opt) và gp5ecto-m chủng virus thể độc lực cao gây Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn điều khiển biểu promoter CaMV 35S − Tối ưu điều kiện biểu tạm thời gen mã hoá loại kháng nguyên M, GP5 GP5ectoM chủng PRRSV thể độc lực cao thuốc tinh sạch kháng nguyên M, GP5 GP5ectoM tái tổ hợp từ mô thuốc − Đánh giá tính sinh miễn dịch protein tái tổ hợp M, GP5 GP5ectoM động vật thí nghiệm Nội dung nghiên cứu (1) Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen m/gp5opt/gp5ecto-m mã hoá kháng nguyên M-ELP/ GP5-ELP /GP5ectoM-ELP tạo chủng Agrobacterium mang vector tương ứng; (2) Tối ưu điều kiện biểu tạm thời gen m/ gp5opt/ gp5ecto-m thuốc N benthamiana Biểu tạm thời tinh sạch kháng nguyên M-ELP/ GP5-ELP/ GP5ectoM-ELP tái tổ hợp; (3) Đánh giá tính sinh miễn dịch dịch thể kháng nguyên M-ELP/ GP5-ELP/ GP5ectoM-ELP tái tổ hợp động vật thí nghiệm Đóng góp luận án Luận án tiến hành thực nghiên cứu cách tổng thể, từ việc thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh, tối ưu điều kiện biểu gen tạm thời thực vật, biểu tinh sạch kháng nguyên đánh giá tính sinh miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp động vật thí nghiệm Luận án cơng trình nghiên cứu thành cơng tại Việt Nam việc thiết kế vector chuyển gen biểu tạm thời gen m/ gp5opt/ gp5ecto-m mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP GP5ectoM-ELP chủng virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh lưu hành tại Việt Nam thuốc N benthamiana phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium Kết luận án chứng minh kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP GP5ectoM-ELP có khả kích thích sinh kháng thể đặc hiệu kháng virus PRRS động vật thí nghiệm Trong đó, kháng nguyên GP5ecto (vùng ngoại bào GP5) dung hợp với kháng nguyên M (GP5ectoM-ELP) kích thích đáp ứng kháng thể đặc hiệu tốt kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP riêng lẻ Kháng nguyên GP5ectoM-ELP GP5-ELP hai ứng viên tiềm để sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống PRRSV thể độc lực cao gây bệnh Việt Nam Ý nghĩa khoa học thực tiễn 5.1 Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp sở khoa học quan trọng việc thiết kế cấu trúc vector chuyển gen mang gen m/gp5opt/gp5ecto-m mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp M, GP5 GP5ectoM PRRSV dung hợp Elastin - like polypeptide (ELP); biểu tạm thời kháng nguyên tái tổ hợp thuốc phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium; tách chiết, tinh sạch đánh giá khả kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể kháng nguyên tái tổ hợp động vật thí nghiệm Kết đề tài luận án chứng khoa học tiềm việc sản xuất, phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS thực vật 5.2 Ý nghĩa thực tiễn Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen m/ gp5opt/ gp5ecto-m mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP GP5ectoM-ELP chủng virus PRRS lưu hành Việt Nam chủng A tumefaciens mang vector sử dụng để nghiên cứu biểu hiện, sản xuất phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS Quy trình biểu gen tạm thời thuốc phương pháp thẩm lọc nhờ A tumefaciens với điều kiện tối ưu đề tài luận án ứng dụng để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP protein tái tổ hợp khác Kháng nguyên tái tổ hợp GP5-ELP GP5ectoM-ELP tạo đề tài luận án hai ứng viên tiềm cho sản xuất vaccine tiểu đơn vị phòng bệnh lợn tai xanh Việt Nam Cấu trúc luận án Luận án gồm 131 trang (Từ Mở đầu đến Kết luận kiến nghị, không bao gồm Danh mục cơng trình cơng bố, Tóm tát luận án Tiếng Anh, tài liệu tham khảo phụ lục), chia thành phần: Mở đầu gồm trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 37 trang; Chương 2: Vật liệu phương pháp, 17 trang; Chương 3: Kết nghiên cứu, 47 trang; Chương 4: Bàn luận kết nghiên cứu, 22 trang; Kết luận đề nghị: trang; Các cơng trình cơng bố liên quan đến luận án: trang; Tóm tắt luận án tiếng anh: trang; Luận án có bảng số liệu, 51 hình Ngồi ra, tài liệu tham khảo: 229 tài liệu tham khảo, 14 tài liệu tiếng Việt 215 tài liệu tiếng Anh; Phụ lục: trang; Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tổng kết 16 tài liệu nước, 217 tài liệu nước với nội dung liên quan, bao gồm: (1) Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn, như: Sơ lược tình hình dịch bệnh; bệnh tích PRRS; virus PRRS; (2) Vaccine phòng PRRS: Vaccine sống - nhược độc; vaccine vô hoạt; dạng vaccine thử nghiệm dựa vào kháng nguyên GP5 M chống PRRSV; (3) Biểu tạm thời kháng nguyên PRRSV thực vật phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium, như: Lợi phương pháp biểu gen tạm thời nhờ A tumefaciens; trình thẩm lọc nhờ A tumefaciens; số giải pháp tăng cường biểu gen tạm thời thực vật Với dẫn liệu thu thập được, kết phân tích cho thấy Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRS) virus PRRS (PRRSV) gây ra, bệnh truyền nhiễm nguy hiểm lợn, phát lần Mỹ vào năm 1987 lây lan nhiều quốc gia giới, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn PRRSV loại virus RNA không ổn định, thay đổi nhanh chóng đặc tính di truyền kháng nguyên, có tốc độ tiến hóa nhanh số virus RNA Điều này, gây nhiều khó khăn cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine phòng PRRS Hiện nay, giới có 20 loại vaccine thương mại phòng PRRS Các vaccine sản xuất từ chủng virus dòng châu Âu dòng Bắc Mỹ hai dạng chủ yếu vaccine sống – nhược độc vaccine vô hoạt Vaccine vô hoạt thường an tồn, có khả phòng ngừa triệu chứng lâm sàng hiệu bảo hộ không cao Vaccine nhược độc tạo miễn dịch bảo hộ tốt với chủng tương đồng mức bảo hộ giảm dần giảm mức tương đồng với chủng mới, có nguy phát triển độc tính trở lại, thân virus vaccine sau nhiều lần truyền nhiễm đột biến trở thành cường độc Ở Việt nam, phát bệnh PRRS lần vào năm 1996 đàn lợn giống 51 nhập từ Mỹ vào tỉnh phía Nam dịch bệnh nặng xuất từ năm 2007 Công ty Hanvet nghiên cứu sản xuất thành công vaccine PRRS nhược độc chủng Hanvet 1.VN để phòng chống PRRS Việt Nam Tuy nhiên, biến đổi di truyền phức tạp PRRSV, loại vaccine lưu hành thực địa dần hiệu lưc Virus gây dịch tai xanh nước ta xác định thể độc lực cao, thuộc chủng PRRSV Bắc Mỹ type II, tương đồng với chủng virus gây bệnh thể độc lực cao Trung Quốc nên việc phòng bệnh khó khăn, dịch nguy hiểm cần phải có vacxin phù hợp Để nâng cao hiệu phòng chống PRRS, việc nghiên cứu sản xuất loại vaccine hệ có bảo hộ cao với biến chủng PRRSV cần thiết Vaccine tiểu đơn vị sản xuất thực vật phòng PRRS hướng nghiên cứu đánh giá có nhiều triển vọng ưu điểm ổn định bền vững, đảm bảo hoạt tính sinh học, dễ dàng sản xuất với khối lượng lớn, chi phí sản xuất thấp Protein GP5 M protein cấu trúc chính virus PRRS lựa chọn ứng viên tiềm để sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống virus PRRS Nhiều hệ thống biểu GP5 M PRRSV thử nghiệm Biểu gen tạm thời thực vật phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium phương pháp để sản xuất kháng nguyên có nhiều ưu điểm chứng minh, như: Hàm lượng kháng nguyên cao, sản xuất với số lượng lớn, chi phí thấp, thực đơn giản, thời gian nhanh, không bị ảnh hưởng vị trí gắn gen đích tế bào thực vật tiến hành biểu mơ biệt hóa hồn tồn mô Với hiểu rõ cấu trúc phân tử hệ gen tính kháng nguyên virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh thành tựu đạt biểu hiện, sản xuất vaccine tiểu đơn vị thực vật phòng chống bệnh virus để thực đề tài luận án Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Chủng vi khuẩn Chủng Escherichia coli DH5α; A tumefaciens C58C1; chủng A tumefaciens C58C1 mang vector pIBT-35S-2bCMV/ pIBT-35S-HC-Pro PVY 2.1.2 Các vector vật liệu thực vật, động vật Vector nhân dòng pRTRA chứa đoạn promoter 35S đoạn 100xELP (pRTRA 35S-H5Histag-Cmyc-100xELP) (Scheller đồng tác giả, 2006; Hoang, 2012) Vector pCB301Kan (Xiang et al., 1999); Plasmid pGEM-PRRS (VN07196) mang gen m và gp5 phân lập từ virus PRRS chủng Việt Nam; vector pBSK mang đoạn gen gp5opt (gp5 optimize) tối ưu mã di truyền Cây thuốc Nicotiana benthamiana; Chuột bạch chủng BALB/C; Lợn 20 ngày tuổi; tế bào MARC -145 chủng virus PRRS 07196 2.1.3 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu Cặp mồi nhân gen gp5opt GP5-optimize-BamHI F GP5-optimize-BamHI R; cặp mồi nhân gen gp5ecto-m GP5ecto- NcoI-F GP5ecto- pspOMI-R, M-pspOMI-F MBamHI-R; cặp mồi nhân gen m M-BamHI-F M-BamHI-R; cặp mồi giải trình tự vector 35S-SQF 35S-Term 2.1.4 Hóa chất Kit tách chiết plasmid, kit gel kit tinh sạch DNA (QIAGEN), thang DNA Kb, thang protein (Fermentas), loại enzyme cắt giới hạn Fermentas Các hoá chất Yeast extract, Agarose, Trypton, v.v loại kháng sinh kanamycin, rifamycine hóa chất thơng dụng khác hãng Merck, Sigma,v.v Kháng thể kháng Cmyc, kháng thể anti-mouse IgG cộng hợp HRP (Promega - USA), kháng nguyên scFv (50 ng/µl), kháng thể rabit anti-pig IgG cộng hợp Peroxidase, hóa chất màu TMB, DAB, kit phim (Thermo Scientific), Protein (H5-pII)3 v.v 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Nhân dòng gen m, gp5opt gp5ecto-m ghép nối vào vector pRTRA Đoạn gen m gp5ecto-m nhân dòng PCR sử dụng khuôn plasmid pGEMPRRS (VN07196) đoạn gen gp5opt nhân dòng từ khn plasmid pBSK mang gen gp5opt với mồi đặc hiệu tương ứng Thành phần phản ứng PCR bao gồm 0,3 μM primer, 0,2 μM dNTPs, 2,5U Pwo SuperYield DNA polymerase, μl đệm 10X Pwo SuperYield PC, 20 ng DNA khuôn tổng số 50 µl hỗn hợp Chu trình nhiệt sau: 940C/ phút; 32 chu kỳ với 940C/ 30 giây, 550C/ 50 giây, 720C/ phút; tiếp 720C/ 10 phút sản phẩm giữ 40C Sản phẩm PCR điện di gel agarose 0,8%, sau tinh sạch xử lý với enzyme cắt giới hạn thiết kế để ghép nối vào plasmid pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xELP biến nạp vào E coli theo phương pháp sốc nhiệt Sambrook đtg (2012) Khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp chọn lọc môi trường LB đặc bổ sung kháng sinh 50 mg/l kanamycin Vector tái tổ hợp tách chiết từ khuẩn lạc dương tính (Colony-PCR) giải trình tự phân tích kiểm tra tính chính xác phần mềm BioEdit 7.0 Lasergen (DNAstarinc, Madison, WI, USA) 2.2.2 Thiết kế cấu trúc vector pCB301 mang gen m/ gp5opt/ gp5ecto-m Vector nhân dòng pRTRA tái tổ hợp mang gen m, gp5opt và gp5ecto-m vector pCB301 phân cắt enzyme HindIII Các sản phẩm cắt từ vector pRTRA bao gồm 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP; 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP; 35S-gp5ecto-mHistag-Cmyc-100xELP ghép nối vào vector pCB301 sử dụng T4 DNA ligase biến nạp vào tế bào E coli DH5α khả biến phương pháp sốc nhiệt (Sambrook et al., 2012) Việc chọn dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp thực môi trường LB đặc có chứa 50 mg/l kanamycin phản ứng Colony-PCR Các vector tái tổ hợp pCB301 mang gen m/ gp5opt/gp5ecto-m, tách chiết từ dòng khuẩn lạc dương tính kiểm tra phản ứng cắt với enzyme giới hạn HindIII NcoI Các vector chuyển gen sau biến nạp vào chủng A tumefaciens C58C1 phương pháp xung điện Tách chiết tinh sạch plasmid: Plasmid tách chiết theo phương pháp Sambrook cộng (2012) Sử dụng Kit hãng Fermentas cung cấp để tinh sạch plasmid Phương pháp xử lý DNA enzyme cắt giới hạn: Thành phần phản ứng cắt thực theo hướng dẫn hãng sản xuất Kit sử dụng enzyme 2.2.3 Biểu tạm thời gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp thuốc 2.2.3.1 Chuẩn bị dịch khuẩn Chủng A tumefaciens mang vector pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc100xELP chủng A tumefaciens C58C1 mang vector pIBT-35S-2bCMV vector pIBT-35S-HC-Pro PVY ni mơi trường YEB có bổ sung kháng sinh, nuôi lắc 200 v/ph, 12-18h 280C mật độ vi khuẩn OD 600 đạt 0,5 - 1,0 Vi khuẩn thu nhận sau ly tâm dịch nuôi tốc độ 5.000 v/ph 15 phút Cặn khuẩn chủng hòa tan đệm MES tới OD600 = 0,5 để dùng cho biến nạp Dịch khuẩn dùng riêng rẽ hay trộn với theo tỷ lệ 1:1, tùy theo mục đích thí nghiệm 2.2.3.2 Phương pháp biến nạp gen đích vào thuốc Quá trình biến nạp tiến hành với thuốc trồng từ - tuần Cây úp ngược nhấn chìm tồn phần vào bình chứa dịch khuẩn chuẩn bị trên, chuyển hệ thống vào bình hút chân khơng Áp suất bình hút chân không chỉnh tới tới 27 inches Hg, hút 1,5 phút, sau giảm áp suất bình áp suất không khí mở nắp Các thuốc sau biến nạp tiếp tục nuôi chăm sóc buồng sinh trưởng 2.2.4 Đánh giá ảnh hưởng điều kiện biểu gen tạm thời đến mức độ biểu protein tái tổ hợp thuốc 2.2.4.1 Đánh giá ảnh hưởng vector hỗ trợ biểu gen Để đánh giá ảnh hưởng vector hỗ trợ đến mức độ biểu gen m, gp5opt và gp5ecto-m thuốc lá, dịch A tumefaciens mang vector pCB301 chứa gen m/ gp5opt/ gp5ecto-m lây nhiễm vào dịch vi khuẩn kết hợp với dịch A tumefaciens mang vector hỗ trợ pIBT-35S-2bCMV/ pIBT-35S-HC-Pro PVY, với lệ dịch (1:1) (xâm nhiễm kép) Mẫu thu sau 3, 4, 5, ngày sau biến nạp, tách chiết protein tổng số để đánh giá mức độ biểu gen chuyển Mức độ biểu gen chuyển đánh giá phương pháp lai Western blot sử dụng kháng thể kháng Cmyc 2.2.4.2 Đánh giá ảnh hưởng nồng độ acetosyringone Thí nghiệm bố trí với dịch A tumefaciens mang vector chuyển gen mục tiêu A tumefaciens chứa vector pIBT-35S-HC-Pro PVY, không bổ sung AS bổ sung AS với nồng độ 450 µM 600 µM 2.2.4.3 Đánh giá ảnh hưởng mật độ vi khuẩn dùng cho biến nạp Thí nghiệm đánh giá mật độ khuẩn tiến hành với với dịch khuẩn có giá trị OD 600 từ 0,2; 0,5; 1,0 (gồm chủng A tumefaciens mang vector chuyển gen mục tiêu chủng A tumefaciens mang vector hỗ trợ pIBT-35S-HC-Pro PVY, lượng dịch lít với tỷ lệ 1:1) bổ sung AS nồng độ 450 µM) 2.2.4.4 Đánh giá ảnh hưởng tuổi xâm nhiễm Thí nghiệm: Lá non gồm thứ 1, 2, từ xuống; bánh tẻ gồm tại vị trí chính thân cây; già gồm 1, 2, từ gốc lên 2.2.4.5 Đánh giá ảnh hưởng tuổi Cây thuốc 3, 4, 5, 6, tuần tuổi; non bánh tẻ cho xâm nhiễm với dịch khuẩn (gồm chủng A tumefaciens mang vector chuyển gen mục tiêu chủng A tumefaciens mang vector pIBT-35S-HC-Pro PVY, OD600 = 0,5) với nồng độ AS 450 µM 2.2.5 Tách chiết xác định nồng độ protein tổng số Protein tổng số từ mẫu tách chiết dịch chiết PBS bảo quản -20 oC Hàm lượng protein tổng số đo bước sóng 595 nm theo phương pháp Bradford (1976) với đường chuẩn xây dựng dựa vào protein BSA chuẩn biết trước nồng độ 2.2.6 Điện di SDS-PAGE lai Western blot Protein hòa tan tổng số phân tách gel polyacrylamide (10%) theo phương pháp Laemmli (1970) Sau điện di protein tổng số gel SDS-PAGE, sau chuyển lên màng nitrocellulose máy chuyển màng 25V, 1.3A 20 phút Màng chứa kháng nguyên phủ sữa tách bơ 5% (pha dung dịch PBS 0,05% Tween) 5h; màng ủ với kháng thể kháng Cmyc qua đêm; sau đó, màng ủ với kháng thể anti-mouse IgG có gắn HRP (đối với mẫu huyết chuột) anti-pig IgG gắn peroxidase (đối với mẫu huyết lợn) Phát có mặt kháng nguyên tái tổ hợp cách ngâm màng lai dung dịch màu có chứa chất DAB 15 phút (Phan, 2012) 2.2.7 Tinh sạch protein M, GP5 GP5ectoM 2.2.7 Tối ưu nồng độ PEG trình thu nhận protein đích Thí nghiệm: PEG 8000 bổ sung dải nồng độ (2% - 10%) vào ml dịch chiết thực vật chuyển gen Dịch chiết sau ly tâm 13.000 v/p, 30 phút, oC Protein dịch biến tính kiểm tra mức độ thu nhận protein đích lai Western blot 2.2.7.2 Tinh sạch protein tái tổ hợp phương pháp mITC Protein tái tổ hợp gắn ELP tinh sạch phương pháp mITC theo phương pháp Phan, 2012 2.2.7.2 Phương pháp tính hiệu suất thu hồi protein tinh sạch Tính hiệu suất thu hồi protein tinh sạch dựa sử dụng protein chuẩn (ScFv-cmyc) biết trước hàm lượng đo phương pháp Bradford 2.2.8 Phương pháp đánh giá tính sinh miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp động vật thí nghiệm 2.2.8.1 Gây miễn dịch chuột Kháng nguyên tái tổ hợp sau tinh sạch sử dụng để gây miễn dịch chuột bạch tuần tuổi với hàm lượng µg/con chuột Kháng nguyên trộn đều, đồng với chất bổ trợ với tỷ lệ 1:1 Chuột chia làm nhóm Nhóm 1: Tiêm vaccine PRRS nhược độc (đối chứng dương); nhóm 2: Tiêm PBS (đối chứng âm), nhóm 3: Tiêm kháng nguyên M-ELP; nhóm 4: Tiêm kháng nguyên GP5-ELP; nhóm 5: Tiêm kháng nguyên GP5ectoM-ELP Nhóm tiêm vaccine PRRS nhược độc chủng Hanvet 1.VN lần Các nhóm 2, 3, 4, tiêm nhắc lại lần Mẫu máu lấy để chiết huyết tại ba thời điểm: Ngày (Trước tiêm), 21 35 Phân tích huyết chuột sau lần tiêm sau lần tiêm ELISA Western blot 2.2.8.2 Gây miễn dịch lợn Lợn tuần tuổi khỏe mạnh, âm tính với kháng thể kháng PRRSV chia thành bốn nhóm, nhóm lợn Nhóm 1: Tiêm vaccine PRRS nhược độc chủng Hanvet 1.VN; nhóm 2: Tiêm dịch chiết thuốc khơng chuyển gen (WT); nhóm 3: Tiêm dịch chiết thơ chứa protein GP5-ELP (150 µg/ml); nhóm 4: Tiêm dịch chiết thơ chứa protein GP5ectoM-ELP (150 µg/ml) Nhóm tiêm vaccine PRRS nhược độc lần Các nhóm 2, tiêm nhắc lại lần: ngày 0, 14 28 3.1.2.2 Thiết kế vector pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP Kết thiết kế thành cơng vector pCB301có cassette gen 35S-gp5opt-Histag-Cmyc100xELP đảo chiều so với cassette gen NOS pro-nptIII-NOS ter (Hình 3.4) Hình 3.4 Kết thiết kế vector chuyển gen pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP (A): Vector chuyển gen pCB301 tái tổ hợp cắt HindIII; (B): Vector pCB301 tái tổ hợp cắt NcoI; (C): Sơ đồ vector pCB301 mang cassette 35S-gp5opt-Histag-Cmyc100xELP đảo chiều Đã tạo chủng A tumefaciens C58C1 mang vector pCB301 35S-gp5opt-HistagCmyc-100xELP Kết kiểm tra kỹ thuật Colony – PCR 3.1.3 Vector chuyển gen mã hoá hỗn hợp kháng nguyên GP5ectoM-ELP 3.1.3.1 Tạo vector pRTRA 35S- gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP Đoạn gen gp5ecto (192 bp) mã hóa cho đoạn protein GP5 vùng ngoại bào (GP5 ectodomain) gen m (528 bp) mã hóa protein M khuếch đại đơn lẻ phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu tương ứng Sản phẩm PCR nhân gen gp5ecto cắt NcoI pspOMI; sản phẩm PCR nhân gen m cắt pspOMI BamHI đồng thời cắt vector pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xELP NcoI BamHI; sau đó, ghép nối sản phẩm cắt với tạo vector tái tổ hợp pRTRA 35Sgp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP (Hình 3.5) Hình 3.5 Thiết kế vector nhân dòng pRTRA 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP 3.1.3.2 Thiết kế vector chuyển gen pCB301 35S-gp5ecto-m -Histag-Cmyc-100xELP Kết cắt vector pRTRA-35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP vector pCB301 HindIII, sau ghép nối cassette 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP với khung vector pCB301 mở vòng tạo vector pCB301 mang cassette 35S-gp5ecto-mHistag-Cmyc-100xELP đảo chiều so với cassett e gen kháng kháng sinh (NOS pro-nptIIINOS ter) (Hình 3.6) Đã tạo chủng A tumefaciens C58C1 mang vector pCB301 35Sgp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP Kết kiểm tra kỹ thuật Colony – PCR Hình 3.6 Kết phân tích kiểm tra vector pCB301 mang gen gp5ecto-m mã hóa kháng nguyên GP5ecto-M dung hợp ELP 3.2 Tối ưu điều kiện biểu tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M, GP5, GP5ectoM dung hợp ELP thuốc 3.2.1 Ảnh hưởng vector hỗ trợ đến biểu tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP GP5ectoM-ELP Kết cho thấy, vector hỗ trợ pIBT-35S-HC-Pro PVY mang gen mã hóa protein HcPro PVY hỗ trợ tăng cường biểu kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP GP5ecto-M tốt so vector hỗ trợ pIBT-35S-2bCMV mang gen mã hóa protein 2b CMV (Hình 3.7) Vì vậy, Hc-Pro PVY lựa chọn cho thí nghiệm Hình 3.7 Ảnh hưởng vector hỗ trợ pIBT-35S-2bCMV và pIBT-35S-HC-Pro PVY đến mức độ biểu hiẹn kháng nguyên tái tổ hợp thông qua kế lai Western sử dụng kháng thể kháng Cmyc 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ AS đến biểu tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP GP5ectoM-ELP Thí nghiệm với nồng độ AS 450 µM 600 µM; kết cho thấy sử dụng nồng độ AS 450 µM phù hợp cho biểu tạm thời gen mã hoá protein tái tổ hợp thuốc (Hình 3.8) Hình 3.8 Ảnh hưởng nồng độ AS đến sự biểu hiẹn gen mã hóa protein tái tổ hợp xác định lai Western blot sử dụng kháng thể kháng Cmyc 3.2.3 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến biểu tạm thời gen mã hoá protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP GP5ectoM-ELP Hình 3.9 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn (OD600) đến sự biểu hiẹn tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP xác định lai Western Thí nghiệm biến nạp tiến hành với dịch khuẩn có giá trị OD 600 0,2; 0,5 1,0 Kết thu cho thấy mật độ vi khuẩn với giá trị OD 600 = 0,5 phù hợp cho biểu hiẹn tạm thời gen mã hoá protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELPở thuốc (Hình 3.9) 3.2.4 Ảnh hưởng tuổi sinh lý đến biểu tạm thời gen mã hoá protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP GP5ectoM-ELP Kết thu cho thấy tuổi sinh lý ảnh hưởng rõ rệt đến hiểu biểu gen tạm thời Lá non bánh tẻ thích hợp cho biểu gen mã hóa kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP GP5ectoM-ELP tái tổ hợp Hình 3.10 Ảnh hưởng tuổi sinh lý đến biểu tạm thời gen mã hoá cho protein tái tổ hợp xác định lai Western blot 3.2.5 Ảnh hưởng tuổi đến biểu tạm thời gen mã hoá protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP GP5ectoM-ELP Kết thu cho thấy, thuốc - tuần tuổi thích hợp để sử dụng cho biểu tạm thời gen mã hóa kháng ngun nghiên cứu Hình 3.11 Ảnh hưởng tuổi đến sự biểu hiẹn tạm thời gen mã hóa protein tái tổ hợp xác định lai Western blot 3.2.6 So sánh mức độ biểu gen mã hoá protein tái tổ hợp (M-ELP, GP5ELP, GP5ectoM-ELP) điều kiện tối ưu Hình 3.12 Kết đánh giá mức độ biểu hiẹn tạm thời gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP lai miễn dịch dựa vào protein chuẩn định lượng H5-pII Kết phân tích cho thấy mức độ biểu protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP GP5ectoM-ELP, tương ứng 0,75%; 0,48% 0,95 % protein hòa tan tổng số, tương ứng 52,4 mg/kg; 35 mg/kg 66,8 mg/kg tươi (Hình 3.12) 3.3 Tinh protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP GP5ectoM-ELP 3.3.1 Tối ưu nồng độ PEG 8000 cho trình tinh Nồng độ 6% PEG 8000 bổ sung vào dịch chiết thực vật trình tinh sạch kháng nguyên M-ELP tốt (Hình 3.13) Hình 3.13 Kết tối ưu nồng độ PEG 8000 cho tinh kháng nguyên MELP Kết cho thấy, nồng độ 8% PEG 8000 bổ sung vào dịch chiết thực vật trình tinh sạch kháng nguyên GP5-ELP tốt (Hình 3.14) Hình 3.14 Kết tối ưu nồng độ PEG 8000 cho tinh sạch kháng nguyên GP5-ELP Nồng độ 8% PEG 8000 bổ sung vào dịch chiết thực vật trình tinh sạch kháng nguyên GP5ectoM-ELP tốt (Hình 3.15) Hình 3.15 Kết tối ưu nồng độ PEG8000 cho tinh sạch kháng nguyên GP5ectoM-ELP 3.3.2 Tinh protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP GP5ectoM-ELP phương pháp mITC 3.3.2.1 Tinh sạch protein M-ELP Hình 3.16 Đánh giá sự tinh sạch protein M-ELP SDS-PAGE và lai miễn dịch A, B: 1: Dịch chiết thô trước xử lý; 2: Dịch chảy qua màng; 3: Protein M-ELP tách rửa khỏi màng; (C): Protein M-ELP thu nhận sau tinh sạch Kết thu cho thấy, tinh sạch thành công protein M-ELP tái tổ hợp (66 kDa) phương pháp mITC có độ tinh sạch cao (Hình 3.16) Định lượng protein thu nhận phương pháp đo Bradford, lai miễn dịch phần mềm Image J, cho thấy tinh sạch thu nhận protein M-ELP (hình 3.17) với hiệu suất thu hồi 86,5%, mức độ tinh sạch 82,1% Hình 3.17 Định lượng protein tái tổ hợp M-ELP lai miễn dịch ScFV-Cmyc (đối chứng dương) đưa vào giếng với nồng độ 50, 100, 150, 200 ng/giếng 3.4.2.2 Tinh sạch protein tái tổ hợp GP5-ELP Kết thu cho thấy, tinh sạch thành công protein GP5-ELP tái tổ hợp phương pháp mITC có độ tinh sạch cao (Hình 3.18) Hiệu suất thu hồi protein GP5-ELP 98%, mức độ tinh sạch 81,1% Hình 3.18 Đánh giá sự tinh sạch protein GP5-ELP lai Western blot và điẹn di SDS-PAGE Hình 3.19 Định lượng protein tái tổ hợp GP5-ELP lai Western blot và hàm lượng ScFV-Cmyc 3.4.2.3 Tinh sạch protein tái tổ hợp GP5ectoM-ELP Kết thu cho thấy, tinh sạch thành công protein GP5ectoM-ELP tái tổ hợp phương pháp mITC có độ tinh sạch cao (Hình 3.20) Hiệu suất thu hồi protein GP5ELP 95%, mức độ tinh sạch 98% Hình 3.20 Đánh giá sự tinh sạch protein GP5ectoM-ELP lai Western blot và điẹn di SDS-PAGE Hình 3.21 Định lượng protein tái tổ hợp GP5ectoM-ELP lai Western blot và ScFV 3.5 Tính sinh miễn dịch dịch thể kháng nguyên tái tổ hợp động vật thí nghiệm 3.5.1 Xác định kháng thể IgG đặc hiệu chuột 3.5.1.1 Khả kích thích tạo kháng thể IgG đặc hiẹu kháng M-ELP Hình 3.22 Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng PRRSV huyết chuột tiêm M-ELP ELISA; Giá trị ELISA trung bình huyết chuột có độ lệch chuẩn thể chấm đen Một chấm đen giá trị ELISA chuột Thanh ngang giá trị trung bình nhóm chuột (3 chuột/nhóm) (*: P≤0.05) Kết cho thấy, kháng nguyên M-ELP tái tổ hợp tạo có khả kích thích phản ứng miễn dịch, sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV chuột sau lần tiêm phát ELISA (Hình 3.22) sau lần tiêm phát lai Western blot (Hình 3.23) Hình 3.23 Kết Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng M-ELP huyết chuột A: Lai miễn dịch chéo, kháng nguyên M-ELP, kháng thể sơ cấp huyết thu từ nhóm tiêm vaccine PRRS nhược độc, kháng thể thứ cấp anti-mouse IgG gắn HRP, B C: Sau 2, lần tiêm M-ELP PBS 3.5.1.2 Khả tạo kháng thể đặc hiẹu IgG kháng nguyên GP5-ELP Kết cho thấy, kháng nguyên GP5-ELP tái tổ hợp tạo có khả kích thích phản ứng miễn dịch, sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV chuột sau lần tiêm phát ELISA (Hình 3.24) lai Western blot (Hình 3.25) Hình 3.24 Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng PRRSV huyết chuột tiêm GP5-ELP kỹ thuật ELISA Hình 3.25 Kết Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng GP5-ELP huyết chuột 3.5.1.3 Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng nguyên GP5ectoM-ELP Kết cho thấy, kháng nguyên GP5ectoM-ELP tái tổ hợp tạo có khả kích thích phản ứng miễn dịch, sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu chuột sau lần tiêm phát ELISA (Hình 3.25) lai Western blot (Hình 3.27) Hình 3.26 Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng PRRSV huyết chuột tiêm GP5ectoM-ELP kỹ thuật ELISA Từ kết phát kháng thể kháng PRRSV ELISA Western blot huyết chuột, cho thấy loại kháng nguyên có khả kích thích hình thành kháng thể IgG đặc hiệu chuột Hình 3.27 Kết Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng GP5ectoM-ELP huyết chuột 3.5.2 Gây miễn dịch lợn Dựa kết đạt chuột, hai loại kháng nguyên GP5-ELP GP5ectoM-ELP lựa chọn để tiếp tục đánh giá tính sinh miễn dịch lợn Kháng nguyên GP5-ELP GP5ectoM-ELP định lượng lai Western blot dựa vào protein chuẩn định lượng (H5-pII)3 kháng thể kháng Cmyc (Hình 3.28) Từ kết định lượng này, hai loại kháng nguyên chuẩn nồng độ 150 µg/ml loại gây miễn dịch cho lợn thí nghiệm Hình 3.28 Kết định lượng protein GP5-ELP, GP5ectoM-ELP lai Western blot dựa vào protein chuẩn định lượng (H5-pII)3 kháng thể kháng Cmyc 3.5.2.1 Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng GP5-ELP Hình 3.29 Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng PRRSV huyết lợn tiêm GP5-ELP phản ứng ELISA Kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV huyết lợn phân tích ngày thứ 28 (sau lần tiêm kháng nguyên) ngày thứ 35 (sau lần tiêm kháng nguyên) xác định phản ứng ELISA (Hình 3.32) lai Western blot (Hình 3.29) Giá trị ELISA phân tích huyết nhóm chuột tiêm GP5-ELP thấp so với vaccine PRRS nhược độc lợn Ở nhóm lợn đối chứng âm WT không phát kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV Hình 3.30 Kết lai Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng GP5-ELP huyết lợn 3.5.2.2 Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng GP5ectoM-ELP Hình 3.31 Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng PRRSV huyết lợn tiêm GP5ectoM-ELP ELISA Phản ứng ELISA cho kết dương tính với kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV mẫu huyết nhóm lợn tiêm dịch chiết thực vật chứa protein GP5ectoMELP vaccine PRRS nhược độc (Hình 3.31) Hình 3.32 Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng GP5ectoM-ELP huyết lợn lai Western blot 3.5.2.3 Xác định kháng thể đặc hiẹu huyết lợn phương pháp miễn dịch lớp (IPMA) Hình 3.33 Xác định kháng thể IgG đặc hiẹu kháng GP5-ELP, GP5ectoM-ELP và vaccine PRRS nhược độc xét nghiẹm miễn dịch đơn lớp (IPMA) Các tế bào bị nhiễm PRRSV ủ với huyết pha loãng Các kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV gắn với tế bào bị nhiễm virus phát qua IPMA, sử dụng kháng thể Rabit antipig IgG cộng hợp peroxidase kháng thể thứ cấp; Đối với GP5-ELP, GP5ectoM-ELP WT: Tiêm vào ngày 0, 14 28; Đối với vaccine PRRS nhược độc tiêm lần vào ngày 0; Huyết tất nhóm thu vào ngày 0, 14, 28, 35 49 sau tiêm chủng Phân tích huyết lô lợn thí nghiệm tiêm vaccine PRRS nhược độc loại protein tái tổ hợp GP5-ELP, GP5ectoM-ELP IPMA cho kết dương tính với kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV Huyết nhóm lợn tiêm dịch chiết thuốc WT, cho kết âm tính (Hình 3.33) Từ kết phát kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV phản ứng ELISA kháng thể kháng GP5-ELP, GP5ectoM-ELP lai Western blot, cho thấy kháng ngun GP5-ELP, GP5ectoM-ELP có khả kích thích hình thành kháng thể đặc hiệu IgG kháng GP5 GP5ectoM PRRSV lợn Hình 3.34 Phát hiẹn IgG đặc hiẹu kháng PRRSV xét nghiẹm miễn dịch đơn lớp (IPMA) Các tế bào bị nhiễm PRRSV ủ với huyết pha loãng Các kháng thể IgG đặc hiệu PRRSV gắn với tế bào bị nhiễm virus phát qua IPMA, sử dụng kháng thể Rabit anti-pig IgG cộng hợp peroxidase kháng thể thứ cấp (A): Kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV huyết nhóm lợn tiêm vaccine PRRS nhược độc; (B): Kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV huyết nhóm lợn tiêm GP5-ELP; (C): Kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV huyết nhóm lợn tiêm GP5ectoM-ELP, (D): Huyết nhóm lợn tiêm WT - âm tính với kháng thể kháng PRRSV Kết xét nghiệm IPMA cho thấy lợn gây miễn dịch loại kháng nguyên tái tổ hợp nghiên cứu cho hiệu giá kháng thể cao Hiệu giá kháng thể huyết nhóm lợn tiêm GP5ectoM-ELP cao so với nhóm tiêm GP5-ELP nhóm tiêm vaccine hầu hết thời điểm phân tích huyết thanh, đạt giá trị cao (2560) sau 35 ngày trì ổn định ngày 49 Ở thời điểm 49 ngày sau gây miễn dịch, hiệu giá kháng thể tất lợn thí nghiệm đạt giá trị ngang vaccine PRRS nhược độc thương mại Kết đạt cho thấy protein tái tổ hợp GP5-ELP GP5ectoM-ELP PRRSV biểu mô thuốc phương pháp biểu gen tạm thời nhờ A tumefaciens, có hoạt tính sinh học, giữ nguyên tính kháng nguyên liên quan đến GP5 M chủng PRRSV ban đầu Protein tái tổ hợp GP5ELP, đặc biệt GP5ectoM-ELP hai ứng viên tốt cho nghiên cứu phát triển sản xuất vaccine phòng bệnh lợn tai xanh Chương BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Trong nghiên cứu này, thiết kế biểu tạm thời gen gp5opt, m mã hoá cho kháng nguyên GP5 M PRRSV, gen gp5ecto-m mã hoá cho vùng ngoại bào kháng nguyên GP5 (GP5 ectodomain) liên kết với kháng nguyên M PRRSV, dung hợp với ELP nhằm biểu kháng nguyên tái tổ hợp mức cao tế bào thực vật (pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP, pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP, pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP) Kết nghiên cứu biểu tạm thời thành công kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP GP5ectoM-ELP thuốc N benthamiana phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium với hàm lượng cao (protein M-ELP 52,4 mg/kg tươi, GP5-ELP 35 mg/kg tươi GP5ectoMELP 66,8 mg/kg tươi) Kết tương tự với nghiên cứu biểu tạm thời protein huỳnh quang xanh (GFP) dung hợp với đầu C protein GP5 (GP5C-GFP) nhờ virus vector dựa vào Pepino mosaic virus (PepMV) đạt 37,29 mg/kg tươi Vector tái tổ hợp dựa vào virus khảm dưa chuột Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) biểu epitope trung hoà GP5 đạt 35,84 mg/kg dưa chuột tươi phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium Tran (2017); biểu tạm thời protein GP5 thuốc N benthamiana đạt mg/kg tươi (Cordis, 2015) Ngược lại, protein GP5 M biểu chuyển lại đạt thấp, biểu protein GP5 thuốc N tabacum chuyển gen đạt 110 ng/g tươi (Chia et al., 2010); biểu protein LTB GP5 thuốc chuyển gen đạt 155 ng/g tươi (Chia et al., 2011); biểu protein GP5 khoai tây chuyển gen đạt 2,5 – 4,7 µg/g tươi 0,8 – 1,2 µg/g củ khoai tây (Chen and Liu, 2011), mức độ biểu protein GP5 chuối chuyển gen đạt từ 157 - 257 ng/g tươi (Chan et al., 2013) Như vậy, mức độ biểu protein M-ELP, GP5-ELP GP5ectoM-ELP nghiên cứu phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium thuốc N benthamiana cao đáng kể so với biểu tạm thời nhờ vector virus thực vật chuyển gen Nguyên nhân dẫn đến mức độ biểu protein M-ELP, GP5-ELP GP5ectoM-ELP cao, protein M, GP5 GP5ectoM dung hợp với ELP làm giảm mức độ nhạy cảm protein dung hợp ELP protease thực vật (Zhang et al., 1996) giảm khả bị thủy phân (Raucher Chilkoti, 2001) Floss cộng (2007) sử dụng phương pháp tương tự đề xuất việc sử dụng chiến lược dung hợp ELP tăng cường biểu kháng thể trung hòa HIV biểu hạt Protein HA virus cúm gia cầm H5N1 dung hợp với ELP tích luỹ thuốc chuyển gen 0,5% - 1% protein hoà tan tổng số (TSP) (Phan et al., 2013) Trong protein HA không gắn ELP tích luỹ thuốc chuyển gen đạt 0,04% TSP Lợi ích việc dung hợp ELP ghi nhận kháng nguyên HIV-1 (Floss et al., 2008, 2009), Ngồi ra, Các gen mã hố protein mục tiêu thiết kế điều khiển promoter 35S CaMV promorter định biểu mạnh, liên tục biểu gen đích mô thực vật khác nhau, giai đoạn sinh trưởng khác không gian thời gian (Beihaghi et al., 2018) Do đó, gen mã hố protein M-ELP, GP5-ELP GP5ectoMELP điều khiển promoter 35S CaMV biểu liên tục mơ biệt hố thuốc N Benthamiana Promoter điều khiển xem yếu tố định đến mức độ biểu gen hàm lượng protein đích Đây yếu tố giúp tăng cường mức độ biểu loại kháng nguyên quan tâm Mặt khác, nghiên cứu chúng tơi sử dụng vector hỗ trợ mang gen mã hóa protein Hc-Pro virus khoai tây PVY protein gây ức chế câm lặng RNA (Du et al., 2008; Ye et al., 2009) Từ kết biểu hiện, sinh tổng hợp protein thuốc cho thấy, biểu tạm thời biểu protein mơ biệt hố, khơng tạo chuyển gen nên không gặp phải vấn đề pháp lý chuyển gen (An toàn sinh học, vấn đề môi trường sinh thái chuyển gen: Ảnh hưởng đến hệ sinh thái đất, phát tán nguồn gen ) Quy trình thực đơn giản, giá thành cho sản xuất thấp, sản xuất lượng protein mong muốn thời gian ngắn Mức độ biểu cao quan trọng Có thể cần lượng sinh khối nhỏ đáp ứng nhiều liều vaccine Trong chuyển gen biểu protein thấp, tinh sạch khó khăn phần thân, rễ Đối với phương pháp biểu tạm thời, để trì nguyên liệu cho sản xuất vaccine hệ phương pháp cần lưu giữ trình tự vector thiết kế thành công (hoặc chủng Agrobacterium mang vector tương ứng) Đây ưu điểm sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp Kết gây miễn dịch chuột bạch với ba loại kháng nguyên nghiên cứu có khả kích thích đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu chuột Từ kết phân tích huyết chuột ELISA Western blot cho thấy ba loại kháng nguyên nghiên cứu kích thích hệ miễn dịch chuột tạo kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV tự nhiên Trong đó, kháng thể kháng M-ELP xuất muộn nhất, sau lần tiêm Kháng thể không phát thông qua lai Western, phát ELISA Trong kháng thể đặc hiệu IgG kháng GP5-ELP GP5ectoM-ELP phát ELISA Western blot tất thời điểm phân tích huyết Điều chứng tỏ huyết chuột sau hai lần tiêm kháng nguyên M-ELP xuất kháng thể đặc hiệu IgG kháng M-ELP mức độ nhỏ, chưa thể phát màng lai Kháng nguyên GP5ectoM-ELP cho khả kích thích tạo kháng thể đặc hiệu tốt chuột loại protein nghiên cứu Tương tự, nghiên cứu Piron cộng (2014) cho thấy chuột tiêm protein GP5 tinh sạch biểu hạt Arabidopsis kích thích sản sinh kháng thể đặc hiệu kháng GP5 huyết thanh; nghiên cứu Jiang cộng (2006), chuột tiêm kháng nguyên GP5 M biểu từ virus vector adenovirus có hàm lượng kháng thể đặc hiệu cao đáng kể so với chuột tiêm vector biểu GP5 M riêng lẻ Trong nghiên cứu chúng tôi, việc tạo kháng nguyên tái tổ hợp GP5ectoM-ELP kết hợp epitope quan trọng kháng nguyên GP5 kháng nguyên M tạo protein dạng heterodimers giúp kích thích hệ miễn dịch sản sinh kháng thể đặc hiệu tốt protein M-ELP GP5-ELP riêng lẻ chuột Chính vậy, chúng tơi lựa chọn GP5-ELP GP5ectoM-ELP để tiếp tục gây miễn dịch lợn Hiệu giá kháng thể kháng PRRSV huyết lợn xác định phản ứng IPMA Theo Jiang cộng (2006), sau kết đánh giá bước đầu tính sinh miễn dịch vaccine DNA biểu GP5, M GP5-M chuột, tính sinh miễn dịch pCIORF5/ORF6 (GP5-M) tiếp tục đánh giá lợn (vật chủ tự nhiên) Tất lợn tiêm chủng sản sinh kháng thể trung hòa sau 10 tuần kể từ tiêm mũi đầu tiên, khơng có kháng thể trung hòa phát lợn tiêm với pCI-ORF5 (GP5 riêng lẻ) Những kết hình thành phân tử protein dị hợp GP5-M liên quan đến biến đổi sau phiên dịch vận chuyển GP5 đóng vai trò quan trọng phản ứng miễn dịch chống lại nhiễm PRRSV Quan trọng hơn, đồng biểu GP5 protein M tạo thành heterodimers cải thiện đáng kể tính sinh miễn dịch vaccine DNA Sự kết hợp sử dụng chiến lược để phát triển vaccine chống lại PRRSV (Jiang et al., 2006) Trong nghiên cứu chúng tôi, qua kết gây miễn dịch lợn, xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV huyết lợn IPMA, cho thấy hai loại kháng nguyên tái tổ hợp GP5-ELP GP5ectoM-ELP gây đáp ứng miễn dịch dịch thể, kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu với hiệu giá kháng thể cao lợn Trong đó, kháng nguyên GP5ectoM-ELP có khả kích thích hệ miễn dịch dịch thể với hàm lượng kháng thể tạo thành cao so với kháng nguyên GP5-ELP điều kiện nghiên cứu Như vậy, dung hợp gen gp5ecto m tạo thành gen gp5ecto-m mã hoá kháng nguyên dạng heterodimers GP5ectoM tế bào thực vật, dẫn đến làm tăng khả kích thích miễn dịch với hàm lượng kháng thể cao hẳn so với GP5-ELP vaccine PRRS nhược độc sau lần tiêm kháng nguyên (Ngày thứ 14 sau mũi tiêm 1) Điều dung hợp protein GP5 miền (GP5 ectodomain) với protein M làm tăng tính “cồng kềnh” phức tạp phân tử kháng nguyên dẫn đến làm tăng khả kích thích hình thành kháng thể đáp ứng miễn dịch chống lại PRRSV, gây đáp ứng miễn dịch tốt so với protein GP5 riêng lẻ Kháng nguyên tái tổ hợp GP5ectoM-ELP chứa định kháng nguyên quan trọng (epitope) quan trọng việc kích thích hình thành kháng thể đặc hiệu GP5 toàn phân tử protein M Ngoài ra, GP5ectoM-ELP chứa đuôi ELP, nhiên ELP chứng minh không ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch protein mục tiêu dung hợp ELP (Phan et al., 2012) Như vậy, việc kết hợp với protein M lý giúp cho phân tử GP5ectoM-ELP có khả kích thích đáp ứng kháng thể đặc hiệu tốt Mặc dù nghiên cứu này, kháng thể trung hoà chưa xác định từ kết thu thông qua việc xác định hiệu giá kháng thể IPMA, cho thấy khả kích thích tạo kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV lợn tốt Trong đó, GP5ectoM có khả kích thích tạo kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV tốt so với GP5 (Nhanh hơn, hàm lượng kháng thể cao hơn) Các hướng nghiên cứu thực vật nhằm tạo cây/củ ăn phòng PRRS chưa cho hiệu mong muốn Mặt khác, việc kích thích hệ miễn dịch tạo kháng thể protein tái tổ hợp qua đường miệng bị giảm hiệu phân cắt protease niêm mạc miệng, hệ tiêu hoá dẫn đến làm giảm hàm lượng kháng nguyên thay đổi cấu trúc kháng nguyên Hơn nữa, khó khăn việc kiểm sốt liều lượng cho lợn ăn, lợn cần ăn lần, liều lượng lần cho ăn là vấn đề cần phải nghiên cứu kỹ lưỡng sử dụng vaccine đường miệng (Gây miễn dịch cục bộ) Hiện nay, vaccine phòng PRRS thị trường chủ yếu vaccine đường tiêm (Vaccine nhược độc vaccine bất hoạt) Như vây, hai loại kháng nguyên GP5 GP5ectoM cần tiếp tục nghiên cứu đánh giá khả bảo hộ lợn, đánh giá khả trung hoà PRRSV phát triển vaccine đường tiêm Trong nghiên cứu này, mục đích xác định đáp ứng kháng thể có chủ đích nhằm xem xét khả kích thích đáp ứng kháng thể dịch thể lợn kháng nguyên mục tiêu có nguồn thực vật Do đó, chúng tơi chưa xem xét, đánh giá độ dài miễn dịch lợn nên không đưa nhận định biến đổi hàm lượng kháng thể IPMA huyết lợn sau 49 ngày Để có thông tin khác đáp ứng miễn dịch đầy đủ, tính bảo hộ kháng nguyên nhằm sản xuất vaccine cần phải thực nghiên cứu chuyên sâu khác, chẳng hạn khảo sát nồng độ kháng nguyên, số lần tiêm kháng nguyên GP5-ELP GP5ectoM-ELP nhắc lại, phản ứng trung hoà virus PRRS, tăng sinh tế bào lympho, chiều dài miễn dịch, chất bổ trợ, đường tiêm v.v để nghiên cứu phát triển dựa vào GP5-ELP GP5ectoM-ELP tiếp tục nghiên cứu đánh giá khả trung hoà PRRSV, khả bảo hộ kháng nguyên nghiên cứu dựa mối tương quan hàm lượng kháng thể IPMA đặc hiệu từ nghiên cứu Theo TCVN 868512-2014, ngưỡng bảo hộ kháng thể máu lợn 1/640: Đạt giá trị bảo hộ Như vậy, với hiệu giá kháng thể xác định IPMA đạt ngưỡng bảo hộ cho lợn nhóm lợn thí nghiệm đạt giá trị lớn 1/640 từ ngày 28 (Nhóm lợn tiêm GP5ectoM-ELP hiệu giá đạt 1066,67 tăng lên đến 2560 ngày 35-49; nhóm lợn tiêm GP5-ELP có hiệu giá kháng thể đạt 853,33 tăng lên nhóm tiêm vaccine đạt 533,33 ngày 28) Xét nghiệm hiệu giá kháng thể phản ứng IPMA sử dụng chủng virus thực địa độc lực cao VN07196 phát phản ứng dương tính định lượng hàm lượng kháng thể huyết lợn thời gian theo dõi Mặt khác, kết lai miễn dịch chéo (Hình 3.36: vaccine* Hình 3.38: vaccine*) sử dụng kháng nguyên GP5-ELP/GP5ectoM-ELP thu ngày 35, kháng thể sơ cấp kháng huyết nhóm lợn tiêm vaccine PRRS nhược độc, kháng thể thứ cấp anti-pig IgG gắn peroxidase cho thấy phát băng protein kích thước tương ứng với loại kháng nguyên xét nghiệm hiệu giá kháng thể IPMA với chủng virus thực địa lưu hành (Chủng PRRSV 07196) cho thấy: Hai loại kháng nguyên tái tổ hợp virus PRRS gây bệnh tại Việt Nam biểu thực vật giữ tính kháng nguyên kháng nguyên liên quan đến GP5/M chủng virus PRRS VN07196 ban đầu, có khả kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể tốt chuột bạch lợn Qua kết gây miễn dịch lợn, xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV GP5-ELP, GP5ectoM-ELP huyết lợn xác định ELISA Western blot hiệu giá kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV IPMA, cho thấy hai loại kháng nguyên tái tổ hợp GP5-ELP GP5ectoM-ELP gây đáp ứng miễn dịch dịch thể, kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu với hiệu giá kháng thể cao Trong đó, kháng nguyên GP5ectoM-ELP kích thích hệ miễn dịch dịch thể với hiệu giá kháng thể tạo thành cao so với kháng nguyên GP5-ELP điều kiện nghiên cứu GP5-ELP GP5ectoM-ELP biểu tạm thời mô thuốc có tính sinh miễn dịch dịch thể cao lợn với hàm lượng kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV xác định IPMA cao (2560) 49 ngày theo dõi từ ngày 35 (đối với GP5ectoM-ELP) ngày 49 (GP5-ELP) Theo TCVN 8685-12-2014, ngưỡng bảo hộ kháng thể máu lợn 1/640: Đạt giá trị bảo hộ Vì vậy, với hiệu giá kháng thể máu lợn đạt 2560 cao hồn tồn có giá trị bảo hộ lợn thí nghiệm Các kết đạt kết bước đầu cần thiết, khoa học quan trọng để khẳng định tính kháng nguyên, khả sản sinh kháng thể đặc hiệu kháng lại PRRSV loại kháng nguyên tái tổ hợp mục tiêu, nhằm phục vụ sản xuất vaccine tiểu phần phòng PRRS KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1) Thiết kế thành công ba cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen m/gp5opt/gp5ecto-m dung hợp ELP mã hoá cho loại kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP chủng virus PRRS (VN07196) tạo chủng A tumefaciens mang vector 2) Biểu thành công protein M-ELP (52,4 mg/kg tươi), GP5-ELP (35,0 mg/kg tươi) GP5ectoM-ELP (66,8 mg/kg tươi) thuốc phương pháp thẩm lọc nhờ A Tumefaciens với điều kiên biểu tạm thời tối ưu tối ưu (Sử dụng vector hỗ trợ pIBT-Hc-Pro PVY, nồng độ AS (450 µM), mật độ vi khuẩn (OD600 = 0,5), non bánh tẻ tuần tuổi thu hoạch sau ngày biến nạp) 3) Cả ba kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP GP5ectoM-ELP kích thích tạo kháng thể IgG đặc hiệu chuột với liều lượng tiêm µg/con Kháng thể kháng M-ELP xuất muộn (ở ngày 35 sau lần tiêm); Kháng thể kháng GP5-ELP GP5ectoMELP xuất sớm (ở ngày 21 sau lần tiêm) 4) Kháng nguyên GP5-ELP GP5ectoM-ELP có tính sinh miễn dịch dịch thể cao lợn, sản sinh kháng thể kháng lại PRRSV tự nhiên Hiệu giá kháng thể đạt giá trị bảo hộ cho lợn: GP5ectoM-ELP (hiệu giá kháng thể đạt giá trị cao 2560 từ ngày 35) kích thích tạo kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV tốt GP5-ELP (hiệu giá kháng thể đạt 2560 ngày 49) Kháng nguyên GP5ectoM-ELP GP5-ELP ứng viên tiềm để sản xuất vaccine tiểu đơn vị phòng chống PRRS KIẾN NGHỊ Tiếp tục thử nghiệm số nghiên cứu chuyên sâu khác với loại kháng nguyên GP5ELP GP5ectoM-ELP lợn như: Đánh giá khả bảo hộ loại kháng nguyên vaccine: Đánh giá khả trung hoà PRRSV kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV, thí nghiệm công cường độc, tiếp tục đánh giá khả bảo hộ GP5-ELP GP5ectoMELP: Liều lượng tiêm, số lần tiêm, kết hợp chất bổ trợ khác, theo dõi độ dài miễn dịch, v.v nhằm phát triển vaccine tiểu đơn vị đường tiêm phòng Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn ... Căn vào luận khoa học tình hình thực tiễn nêu trên, luận án thực với đề tài Nghiên cứu biểu kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn thuốc bằng phương. .. phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium với mục đích tạo sở khoa học thực nghiệm để biểu gen mã hoá kháng nguyên chủng virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn lưu hành Việt Nam phương. .. dựa vào kháng nguyên GP5 M chống PRRSV; (3) Biểu tạm thời kháng nguyên PRRSV thực vật phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium, như: Lợi phương pháp biểu gen tạm thời nhờ A tumefaciens; trình thẩm