Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc

31 64 0
Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

Mục đích của luận án nhằm tạo cơ sở khoa học và thực nghiệm để biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên của chủng virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn đang lưu hành ở Việt Nam bằng phương pháp biểu hiện gen tạm thời trong thực vật phục vụ cho định hướng phát triển sản xuất vaccine thế hệ mới.

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HẰNG  NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUN (M, GP5,  GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN  SINH SẢN VÀ HƠ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY THUỐC LÁ  BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC NHỜ  AGROBACTERIUM Chun ngành: Hố sinh học Mã số: 9420116 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2019 Cơng trình được hồn thành tại Viện Cơng nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học:  1. TS. Nguyễn Trung Nam                  Viện Cơng nghệ sinh học             2. PGS. TS. Chu Hồng Hà                  Viện Cơng nghệ sinh học Phản biện 1: PGS. TS. Đồng Huy Gới Phản biện 2: GS. TS. Đậu Ngọc Hào Phản biện 3: GS. TS. Chu Hoang Mậu Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án phiên chính  thức tại Viện Cơng nghệ sinh học Vào hồi ……giờ… , ngày… tháng… năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: ­ Thư viện Quốc gia Việt Nam ­ Thư viện Viện Cơng nghệ sinh học ­ Trang web của Bộ GD & ĐT NHỮNG CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Ngun Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ , Hô Thi Th ̀ ̣ ương, Nguyên Thu Giang, Pham Bich ̃ ̣ ́   Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ( ̣ ̃ ̀ ̀ 2017)  Tách dòng và đồng biểu  hiện gen mã hóa hai loại kháng ngun vỏ  GP5ecto (vùng ngoại bào) và M  của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn. Tap chi Khoa hoc ̣ ́ ̣   ĐHQGHN: Khoa hoc T ̣ ự nhien va Cong ngh ̂ ̀ ̂ ẹ, T ̂ ạp 33(1S): 150­158 ̂ Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ , Hô Thi Th ̀ ̣ ương, Nguyên Thu Giang, Pham Thi ̃ ̣ ̣  Vân, Pham Bich Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ( ̣ ́ ̣ ̃ ̀ ̀ 2017).   Biểu  hiện và tinh sạch protein M của virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh bằng cơng  nghệ  biểu hiện tạm thời trong lá thuốc lá Nicotinana benthamiana. Tap chí ̣   Cơng nghệ Sinh hoc̣  15(3): 547­554 Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ , Hô Thi Th ̀ ̣ ương, Pham Bich Ngoc, Nguyên Trung ̣ ́ ̣ ̃   Nam, Chu Hoang Ha ( ̀ ̀ 2018). Xác định khả năng kích thích tạo kháng thể đặc  hiệu của kháng nguyên tái tổ  hợp GP5­ELP của virus PRRS gây hội chứng  rối loạn sinh sản và hơ hấp   lợn trên động vật thí nghiệm. Tạp chí Khoa   học kỹ thuật thú y. Tập 25(5): 35­42 Ngun Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ , Hô Thi Th ̀ ̣ ương, Nguyễn Thu Giang, Pham Bich ̣ ́   Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ( ̣ ̃ ̀ ̀ 2018)  Nghiên cứu tối  ưu các  điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hố kháng ngun M của virus PRRS   trong lá cây thuốc lá  Nicotinana benthamiana  Tap chí Cơng ngh ̣ ệ  Sinh hoc̣   16(2): 293­300 Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ , Pham Bich Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ̣ ́ ̣ ̃ ̀ ̀  (2018)  Đánh   giá   khả     kích   thích   đáp   ứng   kháng   thể   đặc   hiệu     kháng   ngun M và GP5ectom/PRRSV được sản xuất từ  thực vật trên chuột bạch. Hội   nghị Khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2018: 194­199 Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ , Hô Thi Th ̀ ̣ ương, Nguyên Thu Giang, Pham Bich ̃ ̣ ́   Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ( ̣ ̃ ̀ ̀ 2016). Đánh giá sự biểu hiện tạm  thời   kháng nguyên  GP5  tái  tổ  hợp của  virus  PRRS  trong mô   lá thuốc  lá  Nicotinana tabacum. Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc lần thứ IV, khu   vực phía nam, 2016: “Ứng dụng Cơng nghệ  sinh học vào thực tiễn”; P1­ 14:57 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hội   chứng   rối   loạn   sinh   sản     hô   hấp     lợn   (Porcine   reproductive   and   respiratory syndrome – PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hi ểm trên lợn do virus  gây ra. Ở Việt Nam, bệnh còn đượ c gọi là “Bệnh lợn tai xanh” (theo ngơn ngữ đại  chúng) do lợn mắc bệnh th ường b ị xung huy ết  ở tai, lúc đầu đỏ sẫm, sau tím xanh.  PRRS gây thiệt hại kinh t ế r ất l ớn  ở nh ững n ước có bệnh. PRRS đượ c phát hiện ở  Mỹ vào năm 1987. Hàng năm nướ c Mỹ phải chịu những thi ệt hại do b ệnh này ướ c  tính khoảng 664 tri ệu USD cho vi ệc tiêu huy l ̉ ợn chêt, l ́ ợ n ôm, chi phi chông dich ́ ́ ́ ̣   va x ̀ ử ly môi tr ́ ươ ̀ng Ở  Việt Nam, dich PRRS do virus th ̣ ể độc lực cao xuất hiện lần đầu tiên vào   năm 2007. Từ đo đên nay, dich đa ́ ́ ̣ ̃ xuât hi ́ ện  ở  hâu hêt cac đia ph ̀ ́ ́ ̣ ươ ng trong cả  nươ ́c. Theo thống kê của Cục Thú y, từ  cuối tháng 4/2016 đến tháng 11/2016, đã  xuất hiện 14  ổ  dịch PRRS t ại 8 huy ện c ủa 4 t ỉnh là Quảng Trị, Hậu Giang, Ngh ệ  An và Hà Tĩnh, làm 3.433 con lợn mắc b ệnh, trong đó có 1.242 con lợn bị tiêu huỷ.  PRRS đã anh hu ̉ ̛ở ng nặng nê t ̀ ới nganh chan nuoi l ̀ ̆ ̂ ợn trong n ước. B ệnh v ẫn xu ất   hiện   một số  địa phươ ng và có tính chất 2­3 năm một lần. Điều này cũng cho   thấy nguy cơ xuất hiện tr ở l ại c ủa d ịch b ệnh này trong thời gian tới Hiện nay, các vaccine phòng PRRS chủ  yếu là vaccine vơ hoạt và nhượ c   độc. Cac vaccine vô ho ́ ạt thươ ̀ng an toan nh ̀ ưng kh ả năng bao h ̉ ộ thâp. Cac vaccine ́ ́   nhượ c độc bao h ̉ ộ  tốt hơn nhưng còn nhiều lo ngại về  tính an tồn của các loaị  vaccine này. Vaccine nhược độc có thể  giam dân m ̉ ̀ ức bao h ̉ ộ  do giam m ̉ ưc t ́ ương   đơng v ̀ ới chung m ̉ ới (nếu có) va ban thân virus vaccine sau nhiêu lân trun nhi ̀ ̉ ̀ ̀ ̀ ễm   cũng co thê ́ ̉  đột biên tr ́ ở  thanh c ̀ ường độc. Mặc dù vậy, phòng chống PRRS tại   Việt Nam đã đạt hiệu quả  cao. Hiện nay, d ịch ch ỉ  xu ất hi ện l ẻ  t ẻ, trong nh ững   năm gần đây hầu như  khơng có dịch, một phần là nhờ  biện pháp chủ  động tiêm  phòng cho lợn Virus gây Hội chứng rối loạn sinh s ản và hơ hấp   lợn   nướ c ta hiện nay   được xác định là thể  độc lực cao và chưa có thuốc đặc trị. Việc phòng chống dịch  chủ  yếu vẫn là tiêm phòng vaccine kết hợp các biện pháp thú y (Tiêu độc khử  trùng, vệ  sinh tru ồng tr ại, cách ly và tiêu huỷ  lợn bệnh  ). Để  phòng chống virus  thể  độc lực cao đang lưu hành tại Việt Nam cần phải có thêm vaccine phù hợp   Nhu cầu về  các loại vaccine PRRS th ế h ệ m ới trong đó có vaccine tiểu đơn vị, an  tồn và hiệu quả hơn là vấn đề cấp thiết.  Protein GP5 và M là những protein c ấu trúc chính của virus PRRS (PRRSV)  được lựa chọn là những ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống   PRRSV. Các kháng thể  kháng GP5 và M   lợn là các kháng thể  có khả  năng trung   hồ PRRSV. Sự  kết hợp đoạn peptit miền ngồi của  kháng ngun GP5 (GP5ecto)  được cho là chứa các epitope trung hồ của GP5 với protein M với mong muốn sẽ tạo   được protein tái tổ  hợp heterodimer GP5ectoM có khả  năng kích thích tạo đáp  ứng  miễn dịch mạnh và trở  thành một trong những  ứng viên tiềm năng để  phát triển sản  xuất vaccine chống PRRSV Kháng nguyên của virus PRRS có thể  đượ c sản xuất trong hệ  thống th ực   vật nhằm phát triển vaccine tiểu đơn vị  phòng PRRS thơng qua phươ ng pháp biểu   hiện gen tạm thời. H ệ th ống bi ểu hi ện gen t ạm th ời  ở th ực v ật b ằng ph ương pháp   thẩm lọc nhờ   Agrobacterium nhằm sản xuất kháng ngun có nhiều  ưu điểm như:   Mức độ  biểu hiện kháng ngun cao, có thể  sản xuất  ở quy mơ lớn, phươ ng pháp  thực hiện đơn giản, thời gian nhanh, khơng bị   ảnh hưở ng bởi vị  trí gắn gen đích  trong tế bào thực vật và có thể  tiến hành biểu hiện trong các mơ đã biệt hóa hồn  tồn như  lá, cung cấp kháng ngun cho mục đích sản xuất vaccine chống ch ủng   virus mới xuất hiện một cách nhanh chóng khi dịch bệnh xảy ra Căn cứ vào các luận cứ khoa học và tình hình thực tiễn nêu trên, luận án được   thực hiện với đề  tài “Nghiên cứu biểu hiện kháng ngun (M, GP5, GP5ectoM)   của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp   lợn trong cây thuốc lá  bằng phương pháp thẩm lọc nhờ  Agrobacterium” với mục đích tạo cơ  sở  khoa  học và thực nghiệm để  biểu hiện các  gen mã hố kháng ngun của chủng virus  PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp   lợn đang lưu hành   Việt Nam  bằng phương pháp biểu hiện gen tạm thời trong thực vật phục vụ  cho định hướng  phát triển sản xuất vaccine thế hệ mới 2. Mục tiêu nghiên cứu  Mục tiêu chung Nghiên cứu cơ  sở  khoa học và thực nghiệm của việc sản xuất kháng nguyên  tái tổ  hợp M/GP5/GP5ectoM của chủng virus PRRS (PRRSV) đang gây bệnh lợn tai   xanh  ở Việt Nam bằng công nghệ  biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá phục vụ  cho  định hướng phát triển vaccine thế hệ mới Mục tiêu cụ thể Thiết kế được 3 cấu trúc vector chuyển gen mang gen m, gp5optimize (gp5opt)  và gp5ecto­m của chủng virus thể độc lực cao gây Hội chứng rối loạn sinh sản   và hơ hấp ở lợn dưới sự điều khiển biểu hiện bởi promoter CaMV 35S.  Tối  ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hố 3 loại kháng ngun M ,  GP5 và GP5ectoM của chủng PRRSV thể độc lực cao trong lá cây thuốc lá và   tinh sạch được kháng ngun M, GP5 và GP5ectoM tái tổ hợp từ mơ lá thuốc lá Đánh giá được tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp M, GP5 và GP5ectoM  trên động vật thí nghiệm.    3. Nội dung nghiên cứu (1) Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang các  gen m/gp5opt/gp5ecto­m   mã   hoá  kháng   nguyên   M­ELP/   GP5­ELP   /GP5ectoM­ELP     tạo   chủng  Agrobacterium  mang vector tương  ứng; (2) Tối  ưu các điều kiện biểu hiện tạm   thời  gen  m/  gp5opt/ gp5ecto­m   lá cây thuốc lá  N. benthamiana  Biểu hiện tạm  thời và tinh sạch các kháng nguyên M­ELP/ GP5­ELP/ GP5ectoM­ELP tái tổ  hợp;  (3)  Đánh giá tính sinh miễn dịch dịch thể  của kháng nguyên  M­ELP/ GP5­ELP/  GP5ectoM­ELP tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm 4. Đóng góp mới của luận án Luận án đã tiến hành thực hiện nghiên cứu một cách tổng thể, từ việc thiết kế  vector chuyển gen mang các gen mã hóa kháng ngun của virus PRRS gây bệnh lợn  tai xanh, tối ưu các điều kiện biểu hiện gen tạm thời trong thực vật, biểu hiện và tinh  sạch kháng ngun và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng ngun tái tổ  hợp trên  động vật thí nghiệm.  Luận án là  cơng trình  nghiên cứu thành cơng đầu tiên tại Việt Nam về  việc   thiết kế  vector chuyển gen và biểu hiện tạm thời các gen  m/ gp5opt/ gp5ecto­m mã  hố kháng ngun tái tổ  hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP của chủng virus  PRRS gây bệnh lợn tai xanh đang lưu hành tại Việt Nam trong lá cây thuốc lá  N   benthamiana bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium.  Kết quả của luận án cũng đã chứng minh được các kháng ngun tái tổ hợp M­ ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP có khả  năng kích thích sinh kháng thể  đặc hiệu   kháng virus PRRS trên động vật thí nghiệm. Trong đó,  kháng ngun GP5ecto (vùng  ngoại bào của GP5) dung hợp với kháng ngun M (GP5ectoM­ELP) kích thích đáp  ứng kháng thể  đặc hiệu tốt hơn kháng nguyên M­ELP, GP5­ELP riêng lẻ. Kháng   nguyên GP5ectoM­ELP và GP5­ELP là hai  ứng viên tiềm năng để  sản xuất vaccine  tiểu đơn vị chống PRRSV thể độc lực cao đang gây bệnh ở Việt Nam 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 5.1. Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp cơ  sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu trúc  vector chuyển gen mang gen m/gp5opt/gp5ecto­m mã hóa cho các kháng ngun tái tổ  hợp M, GP5 và GP5ectoM của PRRSV dung hợp Elastin ­ like polypeptide (ELP); biểu  hiện tạm thời kháng ngun tái tổ hợp trên cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc  nhờ  Agrobacterium;  tách chiết, tinh sạch và đánh giá khả  năng kích thích đáp  ứng  miễn dịch dịch thể của các kháng ngun tái tổ hợp này trên động vật thí nghiệm. Kết   đề  tài luận án là bằng chứng khoa học về  tiềm năng của việc sản xuất, phát   triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS trong thực vật.  5.2. Ý nghĩa thực tiễn Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen m/ gp5opt/ gp5ecto­m mã  hóa các kháng ngun tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP của chủng virus   PRRS đang lưu hành ở Việt Nam và các chủng  A. tumefaciens mang các vector này có  thể được sử dụng để nghiên cứu biểu hiện, sản xuất và phát triển vaccine tiểu đơn vị  phòng PRRS Quy trình biểu hiện gen tạm thời trên lá cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm   lọc nhờ  A. tumefaciens với các điều kiện tối  ưu của đề tài luận án có thể ứng dụng  để sản xuất các kháng ngun tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP, GP5ectoM­ELP hoặc các  protein tái tổ hợp khác Kháng ngun tái tổ hợp GP5­ELP và GP5ectoM­ELP được tạo ra trong đề tài   luận án là hai ứng viên tiềm năng cho sản xuất vaccine tiểu đơn vị phòng bệnh lợn tai   xanh ở Việt Nam 6. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 131 trang (Từ Mở đầu đến Kết luận và kiến nghị, khơng bao gồm   Danh mục các cơng trình cơng bố, Tóm tát luận án bằng Tiếng Anh, tài liệu tham   khảo và các phụ  lục), được chia thành các phần: Mở  đầu gồm 5 trang; Chương 1:   Tổng quan tài liệu, 37 trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp, 17 trang; Chương   3: Kết quả nghiên cứu, 47 trang; Chương 4: Bàn luận kết quả  nghiên cứu, 22 trang;   Kết luận và đề nghị: 2 trang; Các cơng trình đã cơng bố liên quan đến luận án: 1 trang;  Tóm tắt luận án bằng tiếng anh: 7 trang; Luận án có 7 bảng số liệu, 51 hình. Ngồi ra,   tài liệu tham khảo: 229 tài liệu tham khảo, trong đó 14 tài liệu tiếng Việt và 215 tài liệu   tiếng Anh; Phụ lục: 5 trang;  Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo và tổng kết 16 tài liệu trong nước, 217 tài liệu nước ngồi  với các nội dung liên quan, bao gồm: (1) Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn,   như: Sơ  lược tình hình dịch bệnh; bệnh tích của PRRS; virus PRRS; (2) Vaccine   phòng PRRS: Vaccine sống ­ nhược độc; vaccine vơ hoạt; các dạng vaccine thử nghiệm  dựa vào kháng ngun GP5 và M chống PRRSV;  (3) Biểu hiện tạm thời kháng ngun  của PRRSV ở thực vật bằng phương pháp thẩm lọc nhờ  Agrobacterium, như: Lợi thế  của phương pháp biểu hiện gen tạm thời nhờ  A. tumefaciens; q trình thẩm lọc nhờ  A. tumefaciens; một số giải pháp tăng cường biểu hiện gen tạm thời ở thực vật.  Với các dẫn liệu thu thập được, kết quả phân tích cho thấy Hội chứng rối loạn sinh   sản và hơ hấp   lợn (PRRS) do virus PRRS (PRRSV) gây ra, là một bệnh truyền  nhiễm nguy hiểm  ở lợn, được phát hiện lần đầu tiên   Mỹ  vào năm 1987 và đã lây  lan   nhiều quốc gia trên thế  giới, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn ni  lợn. PRRSV là loai virus RNA khơng ơn đinh, thay đơi nhanh chóng ca vê đ ̣ ̉ ̣ ̉ ̉ ̀ ặc tính di   truǹ  và kháng ngun, có tốc độ tiến hóa nhanh nhất trong số các virus RNA. Điều   này, gây ra nhiều khó khăn cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine phòng PRRS. Hiện  nay, trên thế  giới đã có hơn 20 loại vaccine thương mại phòng PRRS. Các vaccine   được sản xuất từ các chủng virus dòng châu Âu và dòng Bắc Mỹ dưới hai dạng chủ  yếu là vaccine sống – nhược độc và vaccine vơ hoạt. Vaccine vơ hoạt thường an tồn,  có khả năng phòng ngừa các triệu chứng lâm sàng nhưng hiệu quả bảo hộ khơng cao   Vaccine nhược độc tạo ra miễn dịch bảo hộ  tốt với các chủng tương đồng nhưng   mức bảo hộ có thể giảm dần do giảm mức tương đồng với các chủng mới, có nguy    phát triển độc tính trở  lại, bản thân virus vaccine sau nhiều lần truyền nhiễm có  thể đột biến trở thành cường độc Ở Việt nam, phát hiện bệnh PRRS lần đầu tiên vào năm 1996 trên đàn lợn giống  51 con nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam và dịch bệnh nặng xuất hiện từ năm 2007  cho đến nay. Cơng ty  Hanvet đã nghiên cứu và sản xuất thành cơng vaccine PRRS  nhược độc chủng Hanvet 1.VN để phòng chống PRRS ở Việt Nam. Tuy nhiên, do sự  biến đổi di truyền phức tạp c ủa PRRSV, các loại vaccine đang lưu hành trên thực  địa hiện nay đang mất dần hiệu lưc. Virus gây dịch tai xanh   nước ta hi ện nay   được xác định là thể  độc lực cao,  thuọc ch ̂ ủng PRRSV Băc My type II,  ́ ̃ tương đồng  với chủng virus gây bệnh thể  độc lực cao   Trung Quốc nên việc phòng bệnh khó  khăn, dịch cũng nguy hiểm hơn và cần phải có vacxin phù hợp.  Để   nâng   cao   hiệu     phòng   chống   PRRS,   việc   nghiên   cứu   sản   xuất     loại   vaccine thế hệ mới có sự bảo hộ cao với các biến chủng mới của PRRSV hiện nay   là rất cần thiết   Vaccine tiểu đơn vị  được sản xuất trong thực vật phòng PRRS là  hướng nghiên cứu đã được đánh giá là có nhiều triển vọng và  ưu điểm như   ổn định  và bền vững, đảm bảo hoạt tính sinh học, dễ dàng sản xuất với khối lượng lớn, chi   phí sản xuất thấp  Protein   GP5     M       protein  c ấu  trúc   chính    virus   PRRS được lựa chọn là những ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị  chống virus PRRS. Nhi ều h ệ th ống bi ểu hi ện GP5 và M của PRRSV đã đượ c thử  nghiệm   Biểu     gen   tạm   th ời     th ực   v ật   b ằng   ph ương   pháp   thẩm   lọc   nhờ  Agrobacterium  là phươ ng pháp để  sản xuất kháng nguyên có nhiều  ưu điểm đã    chứng   minh,   như:   Hàm  lượ ng   kháng  nguyên  cao,   có  thể   sản   xuất   với   số  lượ ng lớn, chi phí thấp, thực hiện đơn giản, thời gian nhanh, khơng bị   ảnh hưởng   bởi vị  trí gắn gen đích trong tế  bào thực vật và có thể  tiến hành biểu hiện trong   các mơ đã biệt hóa hồn tồn như  mơ lá.  Với sự hiểu rõ về cấu trúc phân tử hệ gen   và tính kháng ngun của virus  PRRS gây bệnh lợn tai xanh   và các thành tựu đạt  được về  biểu hiện, sản xuất vaccine tiểu đơn vị  trong thực vật phòng chống bệnh   virus là căn cứ để chúng tơi thực hiện đề tài luận án này Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Chủng vi khuẩn Chủng Escherichia coli DH5α; A. tumefaciens C58C1; chủng A.  tumefaciens C58C1  mang vector pIBT­35S­2bCMV/  pIBT­35S­HC­Pro PVY.  2.1.2. Các vector và vật liệu thực vật, động vật  Vector nhân dòng pRTRA chứa đoạn promoter 35S và đoạn 100xELP ( pRTRA  35S­H5­Histag­Cmyc­100xELP) (Scheller và đồng tác giả, 2006; Hoang, 2012). Vector   pCB301­Kan (Xiang  et al.,  1999); Plasmid pGEM­PRRS (VN07196) mang gen  m và   gp5  phân lập từ  virus PRRS chủng Việt Nam; vector pBSK mang  đoạn gen  gp5opt  (gp5  optimize)  đã được tối  ưu mã di truyền. Cây thuốc lá  Nicotiana benthamiana;  Chuột bạch chủng BALB/C;   Lợn con 20 ngày tuổi;   tế  bào MARC ­145 và chủng   virus PRRS 07196.  2.1.3. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu Cặp mồi nhân gen  gp5opt   GP5­optimize­BamHI F   GP5­optimize­BamHI R;  cặp mồi nhân gen gp5ecto­m là GP5ecto­ NcoI­F và GP5ecto­ pspOMI­R, M­pspOMI­F  và M­BamHI­R; cặp mồi nhân gen  m  là M­BamHI­F và M­BamHI­R; cặp mồi giải  trình tự vector là 35S­SQF và 35S­Term 2.1.4. Hóa chất Kit tách chiết plasmid, kit thơi gel và kit tinh sạch DNA (QIAGEN), thang DNA 1   Kb, thang protein (Fermentas), cac loai enzyme c ́ ̣ ắt giới hạn cua Fermentas ̉   Các hoá  chất   Yeast   extract,   Agarose,   Trypton,   v.v     loại   kháng   sinh   kanamycin,   rifamycine và các hóa chất thơng dụng khác của các hãng Merck, Sigma,v.v  Kháng  thể  kháng Cmyc, kháng thể  anti­mouse IgG cộng hợp HRP (Promega ­ USA), kháng  ngun scFv (50 ng/µl), kháng thể  rabit anti­pig  IgG  cộng hợp  Peroxidase,  hóa chất  hiện màu TMB, DAB, kit hiện phim (Thermo Scientific), Protein (H5­pII)3 v.v 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Nhân dòng gen m, gp5opt và gp5ecto­m và ghép nối vào vector pRTRA Đoạn gen m và gp5ecto­m được nhân dòng bằng PCR sử  dụng khn là plasmid  pGEM­PRRS (VN07196) và đoạn gen  gp5opt được nhân dòng từ  khn là plasmid  pBSK mang gen gp5opt với các mồi đặc hiệu tương ứng. Thành phần phản ứng PCR   bao gồm 0,3 μM primer, 0,2 μM dNTPs, 2,5U Pwo SuperYield DNA polymerase, 5 μl   đệm 10X Pwo SuperYield PC, 20 ng DNA khn trong tổng số  50 µl hỗn hợp. Chu  trình nhiêt nh ̣  sau: 940C/ 3 phút; 32 chu kỳ với 940C/ 30 giây, 550C/ 50 giây, 720C/ 1  phút; tiếp đó là 720C/ 10 phút và sản phẩm được giữ    40C. Sản phẩm PCR được  điện di trên gel agarose 0,8%, sau đó được tinh sạch và xử lý với enzyme cắt giới hạn   đã được thiết kế để ghép nối vào plasmid pRTRA 35S­Histag­Cmyc­100xELP và biến  nạp vào E. coli  theo phương pháp sốc nhiệt của Sambrook và đtg (2012).  Khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp được chọn lọc trên mơi trường LB đặc bổ sung  kháng sinh 50 mg/l  kanamycin. Vector tái tổ  hợp được tách chiết từ  các khuẩn lạc   dương tính (Colony­PCR) được giải trình tự và phân tích kiểm tra tính chính xác bằng  phần mềm BioEdit 7.0 và Lasergen 7 (DNAstarinc, Madison, WI, USA) 2.2.2. Thiết kế cấu trúc vector pCB301 mang gen m/ gp5opt/ gp5ecto­m  Vector nhân dòng pRTRA tái tổ  hợp mang gen m, gp5opt và gp5ecto­m và vector  pCB301       phân   cắt     enzyme  HindIII   Các   sản   phẩm   cắt   từ   vector  pRTRA  bao gồm  35S­m­Histag­Cmyc­100xELP;  35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP;  35S­gp5ecto­m­Histag­Cmyc­100xELP và được ghép nối vào vector pCB301 sử dụng   T4 DNA ligase và được biến nạp vào tế  bào  E. coli  DH5α  khả  biến bằng phương  pháp sốc nhiệt (Sambrook et al., 2012). Việc chọn các dòng khuẩn lạc mang vector tái  tổ  hợp được thực hiện trên mơi trường LB đặc có chứa 50 mg/l kanamycin và bằng  phản ứng Colony­PCR. Các vector tái tổ hợp  pCB301 mang gen  m/ gp5opt/gp5ecto­m,  được tách chiết từ các dòng khuẩn lạc dương tính và kiểm tra bằng phản ứng cắt với  enzyme giới hạn HindIII và NcoI. Các vector chuyển gen sau đó được biến nạp vào  chủng A. tumefaciens C58C1 bằng phương pháp xung điện.  Tách chiết và tinh sạch plasmid: Plasmid được tách chiết theo phương pháp của  Sambrook và cộng sự  (2012)  Sử  dụng bộ  Kit do hãng Fermentas cung cấp để  tinh  sạch plasmid. Phương pháp xử lý DNA bằng enzyme cắt giới hạn:  Thành phần phản  ứng cắt được thực hiện theo sự hướng dẫn của  hãng sản xuất bộ Kit sử dụng enzyme 2.2.3. Biểu hiện tạm thời gen mã hố kháng ngun tái tổ hợp trong lá thuốc lá  Hình 3.7. Ảnh hưởng của vector hỗ trợ pIBT­35S­2bCMV và pIBT­35S­HC­Pro PVY  đến mức độ biểu hiện kháng ngun tái tổ hợp thơng qua kế quả lai Western sử dụng   kháng thể kháng Cmyc 3.2.2. Anh h ̉ ưởng của nồng độ AS đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hố các   kháng ngun M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP Thí nghiệm với 2 nồng độ  AS là 450 µM và 600 µM; kết quả  cho thấy sử dụng   nồng độ AS 450 µM là phù hợp nhất cho biểu hiện tạm thời của các gen mã hố các  protein tái tổ hợp ở lá thuốc lá (Hình 3.8) Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến sự biểu hiện của các gen mã hóa các   protein tái tổ hợp được xác định bằng lai Western blot sử dụng kháng thể kháng   Cmyc 3.2.3. Anh h ̉ ưởng của mật độ  vi khuẩn đến sự  biểu hiện tạm thời các gen mã   hố các protein tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP Hình 3.9. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn (OD600) đến sự biểu hiện tạm thời của các   gen mã hố các kháng ngun M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP được xác định bằng   lai Western Thí nghiệm biến nạp được tiến hành với dịch khuẩn có các giá trị OD600 là 0,2; 0,5  và 1,0. Kết quả thu được cho thấy mật độ vi khuẩn với giá trị OD600 = 0,5 là phù hợp  nhất cho biểu hiện tạm thời các gen mã hố các protein tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP   và GP5ectoM­ELPở lá thuốc lá (Hình 3.9) 3.2.4. Anh h ̉ ưởng của tuổi sinh lý của lá đến sự  biểu hiện tạm thời các gen mã   hố các protein tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP Kết quả thu được cho thấy tuổi sinh lý của lá ảnh hưởng rõ rệt đến hiểu quả biểu hiện   gen tạm thời. Lá non và lá bánh tẻ là thích hợp nhất cho biểu hiện của các gen mã hóa các  kháng ngun M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP tái tổ hợp.  Hình 3.10. Ảnh hưởng của tuổi sinh lý của lá đến biểu hiện tạm thời các gen mã   hố cho các protein tái tổ hợp được xác định bằng lai Western blot 3.2.5. Anh h ̉ ưởng của tuổi cây đến   biểu hiện tạm thời các gen mã hố các   protein tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP Kết quả thu được cho thấy, cây thuốc lá ở 4 ­ 6 tuần tuổi là thích hợp để sử dụng   cho biểu hiện tạm thời các gen mã hóa các kháng ngun nghiên cứu Hình 3.11. Ảnh hưởng của tuổi cây đến sự biểu hiện tạm thời  các gen mã hóa các  protein tái tổ hợp đượ c xác định bằng lai Western blot 3.2.6. So sánh mức độ  biểu hiện các gen mã hố các protein tái tổ  hợp (M­ELP,   GP5­ELP, GP5ectoM­ELP) trong điều kiện đã được tối ưu Hình 3.12. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện tạm thời các gen mã hố các kháng   ngun tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP bằng lai miễn dịch dựa vào   protein chuẩn đã được định lượng H5­pII Kết quả  phân tích cho thấy mức độ  biểu hiện của các protein tái tổ  hợp M­ELP,   GP5­ELP và GP5ectoM­ELP, tương  ứng là 0,75%; 0,48% và 0,95 % protein hòa tan  tổng số, tương ứng là 52,4 mg/kg; 35 mg/kg và 66,8 mg/kg lá tươi (Hình 3.12) 3.3 Tinh sạch protein tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP 3.3.1. Tối ưu nồng độ PEG 8000 cho q trình tinh sạch   Nồng độ  6% PEG 8000 bổ  sung vào dịch chiết thực vật trong quá trình tinh sạch   kháng nguyên M­ELP là tốt nhất (Hình 3.13).  Hình 3.13. Kết quả tối ưu nồng độ PEG 8000 cho tinh sạch kháng nguyên M­ELP Kết quả  cho thấy, nồng độ  8% PEG 8000 bổ  sung vào dịch chiết thực vật trong quá   trình tinh sạch kháng nguyên GP5­ELP là tốt nhất (Hình 3.14).  Hình 3.14. Kết   quả tối ưu nồng   độ PEG 8000 cho  tinh sạch kháng nguyên GP5­ELP Nồng độ  8% PEG 8000 bổ  sung vào dịch chiết thực vật trong quá trình tinh sạch  kháng nguyên GP5ectoM­ELP là tốt nhất (Hình 3.15).  Hình 3.15. Kết quả tối ưu nồng độ PEG8000 cho tinh sạch kháng nguyên GP5ectoM­ ELP 3.3.2   Tinh     protein   tái  tổ   hợp   M­ELP,   GP5­ELP     GP5ectoM­ELP    phương pháp mITC 3.3.2.1. Tinh sạch protein M­ELP Hình 3.16. Đánh giá sự  tinh sạch của protein M­ELP bằng SDS­PAGE và lai miễn   dịch. A, B: 1: Dịch chiết thơ trước xử  lý; 2: Dịch chảy qua màng; 3: Protein M­ELP   tách rửa khỏi màng; (C): Protein M­ELP thu nhận được sau khi tinh sạch.  Kết quả thu được cho thấy, đã tinh sạch thành cơng protein M­ELP tái tổ hợp (66  kDa) bằng phương pháp mITC có độ tinh sạch cao (Hình 3.16).  Định lượng protein thu nhận được bằng phương pháp đo Bradford, lai miễn dịch   và phần mềm Image J, cho thấy đã tinh sạch và thu nhận đúng protein M­ELP (hình  3.17) với hiệu suất thu hồi là 86,5%, mức độ tinh sạch là 82,1% Hình 3.17. Định lượng protein tái tổ hợp M­ELP bằng lai miễn dịch ScFV-Cmyc (đối chứng dương) đưa vào giếng với nồng độ 50, 100, 150, 200 ng/giếng 3.4.2.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp GP5­ELP  Kết quả thu được cho thấy, đã tinh sạch thành cơng protein GP5­ELP tái tổ hợp bằng  phương pháp mITC có độ  tinh sạch cao (Hình 3.18). Hiệu suất thu hồi protein GP5­ ELP là 98%, mức độ tinh sạch là 81,1% Hình 3.18. Đánh giá sự tinh sạch của protein GP5­ELP bằng lai Western blot và điện   di SDS­PAGE Hình  3.19.  Định lượng protein tái tổ hợp GP5­ELP bằng lai Western blot và hàm   lượng ScFV­Cmyc 3.4.2.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp GP5ectoM­ELP  Kết quả  thu được cho thấy, đã tinh sạch thành cơng protein GP5ectoM­ELP tái tổ  hợp bằng phương pháp mITC có độ  tinh sạch cao (Hình 3.20)  Hiệu suất thu hồi  protein GP5­ELP là 95%, mức độ tinh sạch là 98% Hình 3.20. Đánh giá sự tinh sạch của protein GP5ectoM­ELP bằng lai Western blot  và  điện di SDS­PAGE Hình  3.21.  Định lượng protein tái tổ hợp GP5ectoM­ELP bằng lai Western blot và  ScFV 3.5 Tính sinh miễn dịch dịch thể của các kháng ngun tái tổ hợp trên động vật  thí nghiệm        3.5.1. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột 3.5.1.1. Khả năng kích thích tạo kháng thể IgG đặc hiệu của kháng M­ELP Hình 3.22  Xác định  kháng thể  IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh chuột   được tiêm M­ELP bằng ELISA; Giá trị ELISA trung bình của huyết thanh chuột có độ  lệch chuẩn được thể  hiện ở từng chấm đen. Một chấm đen là giá trị  ELISA của một   con chuột. Thanh ngang là giá trị  trung bình của nhóm chuột (3 con chuột/nhóm) (*:   P≤0.05) Kết quả  cho thấy,  kháng ngun M­ELP tái tổ  hợp được tạo ra có khả  năng kích  thích phản ứng miễn dịch, sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trên chuột  sau 2 lần tiêm phát hiện bằng ELISA (Hình 3.22) và sau 3 lần tiêm phát hiện bằng lai   Western blot (Hình 3.23) Hình 3.23. Kết quả Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng M­ELP trong   huyết thanh chuột. A: Lai miễn dịch chéo, kháng ngun là M­ELP, kháng thể sơ cấp là  huyết thanh thu từ nhóm được tiêm vaccine PRRS nhược độc, kháng thể thứ cấp là anti­ mouse IgG gắn HRP, B và C: Sau 2, 3 lần tiêm M­ELP và PBS 3.5.1.2. Khả năng tạo kháng thể đặc hiệu IgG của kháng ngun GP5­ELP Kết quả  cho thấy, kháng ngun GP5­ELP tái tổ  hợp được tạo ra có khả  năng kích  thích phản ứng miễn dịch, sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trên chuột  sau 2 lần tiêm phát hiện bằng ELISA (Hình 3.24) và lai Western blot (Hình 3.25) Hình 3.24. Xác định kháng th ể IgG đặ c hiệ u kháng PRRSV trong huy ết thanh   chuộ t đượ c tiêm GP5­ELP b ằng k ỹ thu ật ELISA Hình 3.25. Kết quả Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5­ELP   trong huyết thanh chuột 3.5.1.3 Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng ngun GP5ectoM­ELP Kết quả cho thấy, kháng ngun GP5ectoM­ELP tái tổ hợp được tạo ra có khả năng   kích thích phản  ứng miễn dịch, sản sinh kháng thể  IgG đặc hiệu trên chuột sau 2   lần tiêm phát hiện bằng ELISA (Hình 3.25) và lai Western blot (Hình 3.27) Hình 3.26. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huy ết thanh   chuột đượ c tiêm GP5ectoM­ELP bằng k ỹ thu ật ELISA Từ kết quả phát hiện kháng thể kháng PRRSV bằng ELISA và Western blot trong  huyết thanh chuột, cho thấy 3 loại kháng ngun có khả  năng kích thích hình thành   kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột Hình 3.27. Kết quả Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5ectoM­ELP   trong huyết thanh chuột 3.5.2 Gây miễn dịch trên lợn Dựa trên các kết quả đạt được trên chuột, hai loại kháng ngun là GP5­ELP và  GP5ectoM­ELP được lựa chọn để  tiếp tục đánh giá tính sinh miễn dịch trên lợn   Kháng nguyên GP5­ELP và GP5ectoM­ELP được định lượng   bằng lai Western blot  dựa vào protein chuẩn đã được định lượng (H5­pII)3 bằng kháng thể  kháng   Cmyc  (Hình 3.28). Từ kết quả định lượng này, hai loại kháng nguyên được chuẩn về nồng   độ 150 µg/ml mỗi loại và gây miễn dịch cho lợn thí nghiệm Hình 3.28. Kết quả định lượng các protein GP5­ELP, GP5ectoM­ELP bằng lai   Western blot dựa vào protein chuẩn đã được định lượng (H5­pII)3 bằng kháng thể   kháng Cmyc 3.5.2.1. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5­ELP  Hình 3.29. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh của lợn   được tiêm GP5­ELP bằng phản ứng ELISA Kháng thể  IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh lợn được phân tích  ở  ngày thứ  28 (sau 2 lần tiêm kháng ngun) và ngày thứ  35 (sau 3 lần tiêm kháng  ngun) được xác định bằng phản  ứng ELISA (Hình 3.32) và lai Western blot (Hình  3.29). Giá trị  ELISA phân tích huyết thanh của nhóm chuột được tiêm GP5­ELP là  thấp hơn so với vaccine PRRS nhược độc trên lợn.  Ở  nhóm lợn đối chứng âm WT   khơng phát hiện được kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV Hình 3.30. Kết quả lai Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5­ELP   trong huyết thanh của lợn 3.5.2.2. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5ectoM­ELP  Hình 3.31. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh lợn   được tiêm GP5ectoM­ELP bằng ELISA Phản  ứng ELISA cho kết quả  dương tính với kháng thể  IgG đặc hiệu kháng   PRRSV   các mẫu huyết thanh của nhóm lợn được tiêm dịch chiết thực vật chứa   protein GP5ectoM­ELP và vaccine PRRS nhược độc (Hình 3.31).  Hình 3.32. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5ectoM­ELP trong huyết thanh   lợn bằng lai Western blot 3.5.2.3. Xác định kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh lợn bằng phương pháp miễn   dịch một lớp (IPMA) Hình 3.33  Xác định kháng thể  IgG đặc hiệu kháng GP5­ELP, GP5ectoM­ELP và   vaccine PRRS nhược độc bằng xét nghiệm miễn dịch đơn lớp (IPMA)  Các tế bào bị  nhiễm PRRSV được  ủ  với huyết thanh đã được pha loãng. Các kháng thể  IgG đặc   hiệu kháng PRRSV gắn với tế bào bị  nhiễm virus và được phát hiện qua IPMA, sử  dụng các kháng thể Rabit anti­pig IgG cộng hợp peroxidase là kháng thể thứ cấp; Đối   với   GP5­ELP,   GP5ectoM­ELP     WT:   Tiêm   vào     ngày   0,   14     28;   Đối   với  vaccine PRRS nhược độc tiêm 1 lần duy nhất vào ngày 0; Huyết thanh của tất cả các  nhóm thu vào các ngày 0, 14, 28, 35 và 49 sau khi tiêm chủng Phân tích huyết thanh của các lơ lợn thí nghiệm được tiêm vaccine PRRS nhược   độc và 2 loại protein tái tổ  hợp GP5­ELP, GP5ectoM­ELP bằng IPMA đều cho kết   dương tính với kháng thể  IgG đặc hiệu kháng PRRSV. Huyết thanh của nhóm  lợn được tiêm dịch chiết lá thuốc lá WT, cho kết quả  âm tính (Hình 3.33). Từ  kết   phát hiện kháng thể  đặc hiệu kháng PRRSV bằng phản  ứng ELISA và kháng   thể  kháng GP5­ELP, GP5ectoM­ELP bằng lai Western blot, cho thấy kháng ngun  GP5­ELP, GP5ectoM­ELP có khả năng kích thích hình thành kháng thể đặc hiệu IgG  kháng GP5 và GP5ectoM của PRRSV trên lợn Hình 3.34. Phát hiện IgG đặc hiệu kháng PRRSV bằng xét nghiệm miễn dịch đơn   lớp (IPMA). Các tế bào bị nhiễm PRRSV được ủ với huyết thanh đã được pha lỗng.  Các kháng thể  IgG đặc hiệu PRRSV gắn với tế  bào bị  nhiễm virus và được phát   hiện qua IPMA, sử  dụng các kháng thể  Rabit anti­pig IgG cộng hợp peroxidase là   kháng thể  thứ  cấp. (A): Kháng thể  IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh  của nhóm lợn được tiêm vaccine PRRS nhược độc; (B): Kháng thể  IgG đặc hiệu  kháng PRRSV trong huyết thanh của nhóm lợn được tiêm GP5­ELP; (C): Kháng thể  IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh của nhóm lợn được tiêm GP5ectoM­ ELP, (D): Huyết thanh của nhóm lợn được tiêm WT ­ âm tính với kháng thể  kháng   PRRSV  Kết quả  xét nghiệm IPMA cho thấy lợn được gây miễn dịch bởi 2 loại kháng  ngun tái tổ  hợp nghiên cứu đều cho hiệu giá kháng thể  cao. Hiệu giá kháng thể  trong huyết thanh của nhóm lợn được tiêm GP5ectoM­ELP là cao hơn so với nhóm  được tiêm GP5­ELP và nhóm tiêm vaccine   hầu hết các thời điểm phân tích huyết  thanh, đạt giá trị  cao nhất (2560) sau 35 ngày và duy trì  ổn định   ngày 49.  Ở  thời   điểm 49 ngày sau gây miễn dịch, hiệu giá kháng thể ở tất cả lợn con thí nghiệm đều  đạt giá trị ngang bằng vaccine PRRS nhược độc thương mại. Kết quả  đạt đượ c cho  thấy các protein tái tổ  hợp GP5­ELP và GP5ectoM­ELP của PRRSV  đượ c biểu      mô     thuốc       phương   pháp   biểu     gen   tạm   thời   nh   A   tumefaciens,  có hoạt tính sinh học, giữ  ngun đượ c tính kháng ngun liên quan  đến GP5 và M của chủng PRRSV ban đầu. Protein tái tổ hợp GP5­ELP, đặc biệt là   GP5ectoM­ELP là hai  ứng viên tốt cho các nghiên cứu phát triển sản xuất vaccine   phòng bệnh lợn tai xanh Chương 3 BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Trong nghiên cứu này, chúng tơi đã thiết kế và biểu hiện tạm thời gen gp5opt,  m mã hố cho kháng ngun GP5 và M của PRRSV, gen gp5ecto­m mã hố cho vùng  ngoại bào của kháng ngun GP5 (GP5 ectodomain) liên kết với kháng ngun M của   PRRSV,  dung hợp với ELP nhằm bi ểu hi ện kháng nguyên tái tổ  hợp   mức cao   trong tế bào thực vật ( pCB301 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP, pCB301 35S­gp5opt­ Histag­Cmyc­100xELP,   pCB301   35S­gp5ecto­m­Histag­Cmyc­100xELP)   K ết   qu ả  của nghiên cứu này đã biểu hiện tạm thời thành công  kháng nguyên M­ELP, GP5­ ELP và GP5ectoM­ELP trong lá thuốc lá N. benthamiana bằng phương pháp thẩm lọc  nhờ  Agrobacterium  với hàm lượng khá cao (protein M­ELP là 52,4 mg/kg lá tươi,  GP5­ELP là 35 mg/kg lá tươi và GP5ectoM­ELP là 66,8 mg/kg lá tươi). Kết quả  này  cũng tương tự  với nghiên cứu biểu hiện tạm thời protein huỳnh quang xanh (GFP)   dung hợp với đầu C của protein GP5 (GP5C­GFP) nhờ  virus vector dựa vào Pepino   mosaic virus (PepMV) đạt 37,29 mg/kg lá tươi. Vector tái tổ hợp dựa vào virus khảm  dưa chuột Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) biểu hiện các epitope trung  hoà của GP5 đạt 35,84 mg/kg lá dưa chuột tươi bằng phương pháp thẩm lọc nhờ  Agrobacterium  Tran   (2017);   biểu     tạm   thời   protein   GP5       thuốc    N.  benthamiana đạt 5 mg/kg lá tươi (Cordis, 2015). Ngược lại, các protein GP5 và M khi   biểu hiện trong cây chuyển lại đạt rất thấp, như  biểu hiện protein GP5 trong cây   thuốc lá N. tabacum chuyển gen chỉ đạt 110 ng/g lá tươi (Chia et al., 2010); biểu hiện  protein LTB ­ GP5 trong cây thuốc lá chuyển gen chỉ đạt 155 ng/g lá tươi (Chia  et al.,  2011); biểu hiện của protein GP5 trong cây khoai tây chuyển gen chỉ đạt 2,5 – 4,7 µg/g   lá tươi và 0,8 – 1,2 µg/g   củ  khoai tây (Chen and Liu,  2011), và mức độ  biểu hiện   protein GP5 trong cây chuối  chuyển gen đạt từ  157 ­ 257 ng/g lá tươi (Chan  et al.,  2013). Như vậy, mức độ biểu hiện của protein M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP   trong nghiên cứu của chúng tôi bằng phương pháp thẩm lọc nhờ  Agrobacterium  ở lá  thuốc lá  N. benthamiana  là cao hơn đáng kể  so với biểu hiện tạm thời nhờ  vector   virus thực vật hoặc trong cây chuyển gen. Nguyên nhân dẫn đến mức độ  biểu hiện   protein M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP khá cao, có thể  do các protein M, GP5   và GP5ectoM được dung hợp với ELP làm  giảm mức độ nhạy cảm của protein dung   hợp ELP đối với các protease thực vật (Zhang   et al.,  1996) hoặc giảm khả  năng bị  thủy phân (Raucher và Chilkoti, 2001)  Floss va c ̀ ộng sự  (2007) đa s ̃ ử  dung ph ̣ ương  phap t ́ ương tự  va đê xuât răng vi ̀ ̀ ́ ̀ ệc sử  dung chiên l ̣ ́ ược dung   hợp ELP co thê tăng ́ ̉   cương s ̀ ự biêu hi ̉ ện cua khang thê trung hoa HIV biêu hi ̉ ́ ̉ ̀ ̉ ện trong hat ̣  Protein HA của  virus cúm gia cầm H5N1 dung hợp với ELP được tích luỹ  trong cây thuốc lá chuyển  gen là 0,5% ­ 1% protein hồ tan tổng số (TSP) (Phan et al., 2013). Trong khi protein  HA khơng gắn ELP tích luỹ trong cây thuốc lá chuyển gen chỉ đạt 0,04% TSP của lá   Lợi ích của việc dung hợp ELP cũng đã được ghi nhận đối với kháng ngun HIV­1   (Floss  et al.,  2008, 2009), Ngồi ra,  Các gen mã hố protein mục tiêu được thiết kế  dưới sự điều khiển của promoter 35S CaMV là promorter cơ định và biểu hiện mạnh,   có thể  liên tục biểu hiện gen đích trong các mơ thực vật khác nhau,   các giai đoạn   sinh trưởng khác nhau   mọi khơng gian và thời gian (Beihaghi et al., 2018). Do đó,  các gen mã hố protein M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP dưới sự điều khiển bởi  promoter 35S CaMV đã được biểu hiện liên tục ở các mơ đã biệt hố như lá thuốc lá  N. Benthamiana. Promoter điêu khiên đ ̀ ̉ ược xem như la m ̀ ột trong nhưng u tơ qut ̃ ́ ́ ́  đinh đên m ̣ ́ ức độ  biểu hiện gen và hàm lượng protein đích. Đây có thể  cũng là một   trong những yếu tố giúp tăng cường mức độ biểu hiện 3 loại kháng ngun quan tâm   Mặt khác, có thể  do trong nghiên cứu này chúng tơi sử dụng vector hỗ trợ mang gen  mã hóa protein Hc­Pro của virus khoai tây PVY là những protein gây  ức chế  sự  câm  lặng RNA (Du et al., 2008; Ye et al., 2009).  Từ  các kết quả  biểu hiện, sinh tổng hợp protein trong lá thuốc lá cho thấy,   biểu hiện tạm thời chỉ biểu hiện protein trong các mơ đã biệt hố, khơng tạo ra cây  chuyển gen nên khơng gặp phải những vấn đề về pháp lý đối với cây chuyển gen (An   tồn sinh học, các vấn đề về mơi trường sinh thái đối với cây chuyển gen: Ảnh hưởng   đến hệ  sinh thái trong đất, phát tán nguồn gen ). Quy trình thực hiện đơn giản, giá  thành cho sản xuất thấp, có thể  sản xuất lượng protein mong muốn trong thời gian   ngắn. Mức độ  biểu hiện cao rất quan trọng. Có thể  chỉ  cần một lượng sinh khối lá   nhỏ có thể đã đáp ứng được nhiều liều vaccine. Trong khi cây chuyển gen biểu hiện  protein rất thấp, tinh sạch cũng khó khăn đối với các phần thân, rễ. Đối với phương  pháp biểu hiện tạm thời, để  duy trì ngun liệu cho sản xuất vaccine thế  hệ  mới   bằng phương pháp này chỉ cần lưu giữ các trình tự vector đã được thiết kế thành cơng  (hoặc các chủng Agrobacterium mang vector tương ứng). Đây cũng là những ưu điểm   trong sản xuất kháng ngun tái tổ hợp Kết quả  gây miễn dịch trên chuột bạch với ba loại kháng ngun nghiên cứu  đều có khả  năng kích thích đáp  ứng kháng thể  IgG đặc hiệu trên chuột.  Từ  kết quả  phân tích huyết thanh chuột bằng ELISA và Western blot cho thấy cả  ba loại kháng   ngun nghiên cứu đều kích thích hệ  miễn dịch của chuột tạo kháng thể  IgG đặc  hiệu kháng PRRSV tự  nhiên. Trong đó, kháng thể  kháng M­ELP xuất hiện muộn   nhất, sau 2 lần tiêm. Kháng thể này đã khơng được phát hiện thơng qua lai Western,   mặc dù đã được phát hiện bằng ELISA. Trong khi kháng thể  đặc hiệu IgG kháng  GP5­ELP và GP5ectoM­ELP đã được phát hiện bằng ELISA và Western blot ở tất cả  các thời điểm phân tích huyết thanh. Điều này chứng tỏ  trong huyết thanh của chuột  sau hai lần tiêm kháng ngun M­ELP có thể  đã xuất hiện kháng thể  đặc hiệu IgG   kháng M­ELP nhưng  ở một mức độ  quá nhỏ, chưa thể phát hiện trên màng lai  Kháng  nguyên GP5ectoM­ELP cho khả năng kích thích tạo kháng thể đặc hiệu tốt nhất trên  chuột trong 3 loại protein nghiên cứu. Tương tự, nghiên cứu của  Piron và cộng sự  (2014)  cho   thấy  chuột     tiêm   protein   GP5   tinh     biểu       hạt  Arabidopsis đã kích thích sản sinh kháng thể  đặc hiệu kháng GP5 trong huyết thanh;   nghiên cứu của Jiang và cộng sự  (2006),   chuột tiêm kháng ngun GP5 và M biểu  hiện từ  virus vector adenovirus có hàm lượng kháng thể  đặc hiệu cao hơn đáng kể  so với chuột chỉ được tiêm vector biểu hiện GP5 hoặc M riêng lẻ. Trong nghiên cứu  của chúng tơi, việc tạo ra kháng ngun tái tổ hợp GP5ectoM­ELP là sự kết hợp của   epitope quan trọng của kháng ngun GP5 và kháng ngun M tạo ra protein dạng  heterodimers đã giúp kích thích hệ  miễn dịch sản sinh kháng thể  đặc hiệu tốt hơn   protein M­ELP hoặc GP5­ELP riêng lẻ trên chuột. Chính vì vậy, chúng tơi chỉ lựa chọn  GP5­ELP và GP5ectoM­ELP để tiếp tục gây miễn dịch trên lợn Hiệu giá kháng thể  kháng PRRSV trong huyết thanh của lợn được xác định   bằng phản ứng IPMA Theo Jiang và cộng sự (2006), sau các kết quả đánh giá bước đầu về tính sinh miễn   dịch của vaccine DNA biểu hiện GP5, M và GP5­M trên chuột, tính sinh miễn dịch của   pCI­ORF5/ORF6 (GP5­M) được tiếp tục đánh giá ở lợn con (vật chủ tự nhiên). Tất cả lợn   con được tiêm chủng đều sản sinh kháng thể trung hòa sau 10 tuần kể từ khi tiêm mũi đầu   tiên, trong khi khơng có kháng thể trung hòa có thể phát hiện được ở lợn con được tiêm với   pCI­ORF5 (GP5 riêng lẻ). Những kết quả này chỉ ra rằng sự hình thành các phân tử protein  dị hợp GP5­M có thể liên quan đến sự biến đổi sau phiên dịch và vận chuyển GP5 và có  thể đóng một vai trò quan trọng trong phản ứng miễn dịch chống lại nhiễm PRRSV. Quan   trọng hơn, sự đồng biểu hiện của GP5 và protein M tạo thành heterodimers có thể  cải  thiện đáng kể tính sinh miễn dịch của vaccine DNA. Sự kết hợp này có thể được sử dụng    một chiến lược để  phát triển vaccine chống lại PRRSV (Jiang et al., 2006). Trong   nghiên cứu của chúng tơi, qua các kết quả gây miễn dịch trên lợn, xác định hiệu giá kháng   thể  đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh lợn bằng IPMA, cho thấy hai loại kháng   ngun tái tổ  hợp GP5­ELP và GP5ectoM­ELP đều gây ra đáp  ứng miễn dịch dịch thể,  kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu với hiệu giá kháng thể cao trên lợn. Trong đó,  kháng ngun GP5ectoM­ELP có khả năng kích thích hệ miễn dịch dịch thể với hàm lượng   kháng thể  tạo thành cao hơn so với kháng ngun GP5­ELP trong cùng một điều kiện   nghiên cứu. Như  vậy, sự  dung hợp gen gp5ecto và m tạo thành gen gp5ecto­m mã hố   kháng ngun dạng heterodimers GP5ectoM trong các tế bào thực vật, dẫn đến làm tăng   khả năng kích thích miễn dịch với hàm lượng kháng thể cao hơn hẳn so với GP5­ELP và   vaccine PRRS nhược độc ngay sau một lần tiêm kháng ngun (Ngày thứ 14 sau mũi tiêm  1). Điều này có thể là do sự dung hợp của protein GP5 miền ngồi (GP5 ectodomain) với  protein M làm tăng tính “cồng kềnh” và phức tạp của phân tử kháng ngun dẫn đến làm  tăng khả  năng kích thích sự  hình thành kháng thể  trong đáp  ứng miễn dịch chống lại   PRRSV, gây đáp ứng miễn dịch tốt hơn so với protein GP5 riêng lẻ. Kháng ngun tái tổ  hợp GP5ectoM­ELP chứa những quyết định kháng ngun quan trọng (epitope) quan trọng   trong việc kích thích hình thành kháng thể đặc hiệu của GP5 và tồn bộ phân tử protein M   Ngồi ra, GP5ectoM­ELP chứa đi ELP, tuy nhiên ELP đã được chứng minh là khơng ảnh  hưởng đến tính sinh miễn dịch của các protein mục tiêu khi được dung hợp cùng ELP   (Phan et al., 2012). Như vậy, việc kết hợp với protein M cũng có thể là một trong những lý   do giúp cho phân tử GP5ectoM­ELP có khả năng kích thích đáp ứng kháng thể đặc hiệu  tốt. Mặc dù trong nghiên cứu này, kháng thể trung hồ chưa được xác định nhưng từ các  kết quả  thu được thơng qua việc xác định hiệu giá kháng thể  bằng IPMA, cũng đã cho   thấy khả năng kích thích tạo kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV ở các con lợn là khá tốt   Trong đó, GP5ectoM có khả năng kích thích tạo kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV tốt hơn  so với GP5 (Nhanh hơn, hàm lượng kháng thể cao hơn) Các hướng nghiên cứu trên thực vật nhằm tạo cây/củ ăn được phòng PRRS chưa   cho hiệu quả như mong muốn. Mặt khác, việc kích thích hệ miễn dịch tạo kháng thể của  protein tái tổ hợp qua đường miệng cũng có thể bị giảm hiệu quả do sự phân cắt của các  protease trong niêm mạc miệng, hệ tiêu hố dẫn đến làm giảm hàm lượng kháng ngun  hoặc thay đổi cấu trúc của kháng ngun. Hơn nữa, cũng rất khó khăn trong việc kiểm  sốt về liều lượng cho lợn ăn, lợn cần ăn bao nhiêu lần, liều lượng mỗi lần cho ăn là bao   nhiêu cũng là những vấn đề  cần phải được nghiên cứu kỹ  lưỡng khi sử dụng vaccine   đường miệng (Gây miễn dịch cục bộ). Hiện nay, các vaccine phòng PRRS trên thị trường  chủ yếu vẫn là vaccine đường tiêm (Vaccine nhược độc và vaccine bất hoạt). Như vây, hai  loại kháng ngun GP5 và GP5ectoM cần được tiếp tục nghiên cứu đánh giá khả năng bảo  hộ trên lợn, đánh giá khả năng trung hồ PRRSV và phát triển vaccine đường tiêm.  Trong nghiên cứu này, mục đích là xác định đáp ứng kháng thể có chủ đích nhằm  xem xét khả năng kích thích đáp ứng kháng thể dịch thể ở lợn của các kháng ngun mục  tiêu có nguồn thực vật. Do đó, chúng tơi chưa xem xét, đánh giá độ dài miễn dịch ở lợn nên   khơng đưa ra nhận định về sự biến đổi hàm lượng kháng thể IPMA trong huyết thanh lợn  sau 49 ngày. Để có các thơng tin khác về đáp ứng miễn dịch đầy đủ, về tính bảo hộ của  kháng ngun nhằm sản xuất vaccine cần phải thực hiện những nghiên cứu chun sâu   khác, chẳng hạn như khảo sát nồng độ kháng ngun, số lần tiêm kháng ngun GP5­ELP  và GP5ectoM­ELP nhắc lại, phản ứng trung hồ virus PRRS, sự tăng sinh tế bào lympho,  chiều dài miễn dịch, các chất bổ trợ, đường tiêm v.v. để  nghiên cứu phát triển dựa vào   GP5­ELP hoặc GP5ectoM­ELP cũng có thể tiếp tục nghiên cứu đánh giá khả năng trung  hồ PRRSV, khả năng bảo hộ của kháng ngun nghiên cứu dựa trên mối tương quan về  hàm lượng kháng thể  IPMA đặc hiệu từ  nghiên cứu này. Theo TCVN 8685­12­2014,   ngưỡng bảo hộ của kháng thể trong máu lợn là 1/640: Đạt giá trị bảo hộ. Như vậy, với  hiệu giá kháng thể được xác định bằng IPMA đạt ngưỡng bảo hộ cho lợn ở các nhóm lợn   thí nghiệm đạt giá trị lớn hơn 1/640 từ ngày 28 (Nhóm lợn được tiêm GP5ectoM­ELP hiệu   giá đạt 1066,67 và tăng lên đến 2560 ở ngày 35­49; nhóm lợn được tiêm GP5­ELP có hiệu  giá kháng thể đạt 853,33 và tăng lên trong khi nhóm được tiêm vaccine đạt 533,33 ở ngày  28) Xét nghiệm hiệu giá kháng thể  bằng phản  ứng IPMA sử  dụng chủng virus   thực địa độc lực cao VN07196 đã phát hiện được những phản ứng dương tính và định  lượng được hàm lượng kháng thể trong huyết thanh của lợn con trong thời gian theo   dõi   Mặt   khác,   kết     lai   miễn   dịch   chéo   (Hình   3.36:   vaccine*     Hình   3.38:  vaccine*) sử  dụng kháng nguyên là GP5­ELP/GP5ectoM­ELP thu   ngày 35, kháng   thể  sơ  cấp là kháng huyết thanh của nhóm lợn được tiêm vaccine PRRS nhược độc,  kháng thể  thứ  cấp là anti­pig IgG gắn peroxidase cho thấy đã phát hiện được băng   protein đúng kích thước tương  ứng với từng loại kháng nguyên và các xét nghiệm   hiệu   giá   kháng   thể     IPMA   với   chủng   virus   thực   địa     lưu   hành   (Chủng  PRRSV 07196) cho thấy: Hai loại kháng ngun tái tổ hợp của virus PRRS gây bệnh   tại Việt Nam được biểu hiện trong thực vật vẫn giữ  được tính kháng ngun như  kháng ngun liên quan đến GP5/M của chủng virus PRRS VN07196 ban đầu, có khả  năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể tốt trên chuột bạch và lợn Qua các kết quả gây miễn dịch trên lợn, xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng  PRRSV     GP5­ELP,   GP5ectoM­ELP     huyết     lợn     xác   định   bằng  ELISA và Western blot  và hiệu giá kháng thể  đặc hiệu kháng PRRSV bằng IPMA,  cho thấy hai loại kháng ngun tái tổ hợp GP5­ELP và GP5ectoM­ELP đều gây ra đáp  ứng miễn dịch dịch thể, kích thích sản sinh kháng thể  IgG đặc hiệu với hiệu giá  kháng thể cao. Trong đó, kháng ngun GP5ectoM­ELP kích thích hệ  miễn dịch dịch   thể  với hiệu giá kháng thể  tạo thành cao hơn so với kháng ngun GP5­ELP trong  cùng một điều kiện nghiên cứu. GP5­ELP và GP5ectoM­ELP được biểu hiện tạm thời  trong mơ lá thuốc lá đã có tính sinh miễn dịch dịch thể  là khá cao trên lợn với hàm  lượng kháng thể  IgG đặc hiệu kháng PRRSV được xác định bằng IPMA cao nhất   (2560) trong 49 ngày theo dõi từ ngày 35 (đối với GP5ectoM­ELP) và ở ngày 49 (GP5­ ELP).  Theo TCVN 8685­12­2014, ngưỡng bảo hộ của kháng thể trong máu lợn là 1/640:  Đạt giá trị bảo hộ. Vì vậy, với hiệu giá kháng thể trong máu của lợn đạt 2560 là khá   cao và hồn tồn có giá trị  bảo hộ  lợn thí nghiệm. Các kết quả  đạt được là các kết   bước đầu rất cần thiết, là căn cứ  khoa học quan trọng để  khẳng định về  tính   kháng ngun, khả  năng sản sinh kháng thể  đặc hiệu kháng lại PRRSV của 2 loại  kháng ngun tái tổ hợp mục tiêu, là nhằm phục vụ sản xuất vaccine tiểu phần phòng  PRRS KẾT LUẬN VÀ KIẾN  NGHỊ KẾT LUẬN 1) Thiết kế  thành cơng ba cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen   m/gp5opt/gp5ecto­m  dung hợp ELP mã hố cho 3 loại kháng ngun  M­ELP, GP5­ ELP, GP5ectoM­ELP  của chủng virus PRRS (VN07196) và tạo được các chủng A   tumefaciens mang các vector này 2) Biểu hiện thành công protein M­ELP (52,4 mg/kg lá tươi), GP5­ELP (35,0  mg/kg lá tươi) và GP5ectoM­ELP (66,8 mg/kg lá tươi) trong lá cây thuốc lá bằng  phương pháp thẩm lọc nhờ  A. Tumefaciens với các điều kiên biểu hiện tạm thời  được tối  ưu được tối  ưu (Sử  dụng vector hỗ  trợ  pIBT­Hc­Pro PVY, nồng độ  AS   (450 µM), mật độ  vi khuẩn (OD600 = 0,5), lá non và lá bánh tẻ của cây 6 tuần tuổi  và thu hoạch lá sau 6 ngày biến nạp) 3) Cả  ba kháng ngun M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP đều kích thích  tạo kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột với liều lượng tiêm 5 µg/con. Kháng thể kháng   M­ELP xuất hiện muộn nhất (ở ngày 35 sau 3 lần tiêm); Kháng thể kháng GP5­ELP   và GP5ectoM­ELP xuất hiện sớm hơn (ở ngày 21 sau 2 lần tiêm) 4)  Kháng ngun GP5­ELP và GP5ectoM­ELP đều có tính sinh miễn dịch dịch   thể cao trên lợn, sản sinh kháng thể kháng lại PRRSV tự  nhiên. Hiệu giá kháng thể  đạt giá trị  bảo hộ  cho lợn: GP5ectoM­ELP (hiệu giá kháng thể  đạt giá trị  cao nhất   2560 từ ngày 35) kích thích tạo kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV tốt hơn GP5­ELP  (hiệu giá kháng thể đạt 2560 ở ngày 49). Kháng ngun GP5ectoM­ELP và GP5­ELP  là ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị phòng chống PRRS KIẾN NGHỊ Tiếp tục thử nghiệm một số nghiên cứu chuyên sâu khác với 2 loại kháng nguyên   GP5­ELP và GP5ectoM­ELP trên lợn như: Đánh giá khả  năng bảo hộ  của các loại  kháng nguyên vaccine: Đánh giá khả  năng trung hoà PRRSV của các kháng thể  đặc   hiệu kháng PRRSV, thí nghiệm cơng cường độc, tiếp tục đánh giá khả  năng bảo hộ  của GP5­ELP và GP5ectoM­ELP: Liều lượng tiêm, số lần tiêm, kết hợp các chất bổ  trợ  khác, theo dõi độ  dài miễn dịch, v.v. nhằm phát triển vaccine tiểu đơn vị  đường  tiêm phòng Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn ... thực hiện với đề  tài  Nghiên cứu biểu hiện kháng ngun (M, GP5, GP5ectoM)   của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ  Agrobacterium” với mục đích tạo cơ...  sở  khoa  học và thực nghiệm để biểu hiện các  gen mã hố kháng ngun của chủng virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp lợn đang lưu hành   Việt Nam  bằng phương pháp biểu hiện gen tạm thời trong thực vật phục vụ... Thiết kế được 3 cấu trúc vector chuyển gen mang gen m, gp5optimize (gp5opt)  và gp5ecto­m của chủng virus thể độc lực cao gây Hội chứng rối loạn sinh sản   và hô hấp ở lợn dưới sự điều khiển biểu hiện bởi promoter CaMV 35S.  Tối  ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hố 3 loại kháng ngun M

Ngày đăng: 18/01/2020, 20:41

Mục lục

  • 2.1.4. Hóa chất

    • 2.2.3.1. Chuẩn bị dịch khuẩn

    • 2.2.3.2. Phương pháp biến nạp gen đích vào lá cây thuốc lá

    • 2.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện biểu hiện gen tạm thời đến mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp trong lá cây thuốc lá

    • 2.2.4.1. Đánh giá ảnh hưởng của vector hỗ trợ biểu hiện gen

    • 2.2.4.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone

    • 2.2.4.3. Đánh giá ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn dùng cho biến nạp

    • 2.2.4.4. Đánh giá ảnh hưởng của tuổi của lá được xâm nhiễm

    • 2.2.4.5. Đánh giá ảnh hưởng của tuổi cây

    • 2.2.5. Tách chiết và xác định nồng độ protein tổng số

    • 2.2.8. Phương pháp đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm

    • 2.2.8.3. Xác định kháng thể kháng GP5-ELP và GP5ectoM-ELP trong huyết thanh lợn

  • Hình 3.13. Kết quả tối ưu nồng độ PEG 8000 cho tinh sạch kháng nguyên M-ELP.

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan