Mục đích của luận án nhằm tạo cơ sở khoa học và thực nghiệm để biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên của chủng virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn đang lưu hành ở Việt Nam bằng phương pháp biểu hiện gen tạm thời trong thực vật phục vụ cho định hướng phát triển sản xuất vaccine thế hệ mới.
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HẰNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUN (M, GP5, GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HƠ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY THUỐC LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC NHỜ AGROBACTERIUM Chun ngành: Hố sinh học Mã số: 9420116 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2019 Cơng trình được hồn thành tại Viện Cơng nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Trung Nam Viện Cơng nghệ sinh học 2. PGS. TS. Chu Hồng Hà Viện Cơng nghệ sinh học Phản biện 1: PGS. TS. Đồng Huy Gới Phản biện 2: GS. TS. Đậu Ngọc Hào Phản biện 3: GS. TS. Chu Hoang Mậu Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án phiên chính thức tại Viện Cơng nghệ sinh học Vào hồi ……giờ… , ngày… tháng… năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Viện Cơng nghệ sinh học Trang web của Bộ GD & ĐT NHỮNG CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Ngun Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ , Hô Thi Th ̀ ̣ ương, Nguyên Thu Giang, Pham Bich ̃ ̣ ́ Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ( ̣ ̃ ̀ ̀ 2017) Tách dòng và đồng biểu hiện gen mã hóa hai loại kháng ngun vỏ GP5ecto (vùng ngoại bào) và M của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn. Tap chi Khoa hoc ̣ ́ ̣ ĐHQGHN: Khoa hoc T ̣ ự nhien va Cong ngh ̂ ̀ ̂ ẹ, T ̂ ạp 33(1S): 150158 ̂ Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ , Hô Thi Th ̀ ̣ ương, Nguyên Thu Giang, Pham Thi ̃ ̣ ̣ Vân, Pham Bich Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ( ̣ ́ ̣ ̃ ̀ ̀ 2017). Biểu hiện và tinh sạch protein M của virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh bằng cơng nghệ biểu hiện tạm thời trong lá thuốc lá Nicotinana benthamiana. Tap chí ̣ Cơng nghệ Sinh hoc̣ 15(3): 547554 Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ , Hô Thi Th ̀ ̣ ương, Pham Bich Ngoc, Nguyên Trung ̣ ́ ̣ ̃ Nam, Chu Hoang Ha ( ̀ ̀ 2018). Xác định khả năng kích thích tạo kháng thể đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp GP5ELP của virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp lợn trên động vật thí nghiệm. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y. Tập 25(5): 3542 Ngun Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ , Hô Thi Th ̀ ̣ ương, Nguyễn Thu Giang, Pham Bich ̣ ́ Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ( ̣ ̃ ̀ ̀ 2018) Nghiên cứu tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hố kháng ngun M của virus PRRS trong lá cây thuốc lá Nicotinana benthamiana Tap chí Cơng ngh ̣ ệ Sinh hoc̣ 16(2): 293300 Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ , Pham Bich Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ̣ ́ ̣ ̃ ̀ ̀ (2018) Đánh giá khả kích thích đáp ứng kháng thể đặc hiệu kháng ngun M và GP5ectom/PRRSV được sản xuất từ thực vật trên chuột bạch. Hội nghị Khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2018: 194199 Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ , Hô Thi Th ̀ ̣ ương, Nguyên Thu Giang, Pham Bich ̃ ̣ ́ Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ( ̣ ̃ ̀ ̀ 2016). Đánh giá sự biểu hiện tạm thời kháng nguyên GP5 tái tổ hợp của virus PRRS trong mô lá thuốc lá Nicotinana tabacum. Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc lần thứ IV, khu vực phía nam, 2016: “Ứng dụng Cơng nghệ sinh học vào thực tiễn”; P1 14:57 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (Porcine reproductive and respiratory syndrome – PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hi ểm trên lợn do virus gây ra. Ở Việt Nam, bệnh còn đượ c gọi là “Bệnh lợn tai xanh” (theo ngơn ngữ đại chúng) do lợn mắc bệnh th ường b ị xung huy ết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm, sau tím xanh. PRRS gây thiệt hại kinh t ế r ất l ớn ở nh ững n ước có bệnh. PRRS đượ c phát hiện ở Mỹ vào năm 1987. Hàng năm nướ c Mỹ phải chịu những thi ệt hại do b ệnh này ướ c tính khoảng 664 tri ệu USD cho vi ệc tiêu huy l ̉ ợn chêt, l ́ ợ n ôm, chi phi chông dich ́ ́ ́ ̣ va x ̀ ử ly môi tr ́ ươ ̀ng Ở Việt Nam, dich PRRS do virus th ̣ ể độc lực cao xuất hiện lần đầu tiên vào năm 2007. Từ đo đên nay, dich đa ́ ́ ̣ ̃ xuât hi ́ ện ở hâu hêt cac đia ph ̀ ́ ́ ̣ ươ ng trong cả nươ ́c. Theo thống kê của Cục Thú y, từ cuối tháng 4/2016 đến tháng 11/2016, đã xuất hiện 14 ổ dịch PRRS t ại 8 huy ện c ủa 4 t ỉnh là Quảng Trị, Hậu Giang, Ngh ệ An và Hà Tĩnh, làm 3.433 con lợn mắc b ệnh, trong đó có 1.242 con lợn bị tiêu huỷ. PRRS đã anh hu ̉ ̛ở ng nặng nê t ̀ ới nganh chan nuoi l ̀ ̆ ̂ ợn trong n ước. B ệnh v ẫn xu ất hiện một số địa phươ ng và có tính chất 23 năm một lần. Điều này cũng cho thấy nguy cơ xuất hiện tr ở l ại c ủa d ịch b ệnh này trong thời gian tới Hiện nay, các vaccine phòng PRRS chủ yếu là vaccine vơ hoạt và nhượ c độc. Cac vaccine vô ho ́ ạt thươ ̀ng an toan nh ̀ ưng kh ả năng bao h ̉ ộ thâp. Cac vaccine ́ ́ nhượ c độc bao h ̉ ộ tốt hơn nhưng còn nhiều lo ngại về tính an tồn của các loaị vaccine này. Vaccine nhược độc có thể giam dân m ̉ ̀ ức bao h ̉ ộ do giam m ̉ ưc t ́ ương đơng v ̀ ới chung m ̉ ới (nếu có) va ban thân virus vaccine sau nhiêu lân trun nhi ̀ ̉ ̀ ̀ ̀ ễm cũng co thê ́ ̉ đột biên tr ́ ở thanh c ̀ ường độc. Mặc dù vậy, phòng chống PRRS tại Việt Nam đã đạt hiệu quả cao. Hiện nay, d ịch ch ỉ xu ất hi ện l ẻ t ẻ, trong nh ững năm gần đây hầu như khơng có dịch, một phần là nhờ biện pháp chủ động tiêm phòng cho lợn Virus gây Hội chứng rối loạn sinh s ản và hơ hấp lợn nướ c ta hiện nay được xác định là thể độc lực cao và chưa có thuốc đặc trị. Việc phòng chống dịch chủ yếu vẫn là tiêm phòng vaccine kết hợp các biện pháp thú y (Tiêu độc khử trùng, vệ sinh tru ồng tr ại, cách ly và tiêu huỷ lợn bệnh ). Để phòng chống virus thể độc lực cao đang lưu hành tại Việt Nam cần phải có thêm vaccine phù hợp Nhu cầu về các loại vaccine PRRS th ế h ệ m ới trong đó có vaccine tiểu đơn vị, an tồn và hiệu quả hơn là vấn đề cấp thiết. Protein GP5 và M là những protein c ấu trúc chính của virus PRRS (PRRSV) được lựa chọn là những ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống PRRSV. Các kháng thể kháng GP5 và M lợn là các kháng thể có khả năng trung hồ PRRSV. Sự kết hợp đoạn peptit miền ngồi của kháng ngun GP5 (GP5ecto) được cho là chứa các epitope trung hồ của GP5 với protein M với mong muốn sẽ tạo được protein tái tổ hợp heterodimer GP5ectoM có khả năng kích thích tạo đáp ứng miễn dịch mạnh và trở thành một trong những ứng viên tiềm năng để phát triển sản xuất vaccine chống PRRSV Kháng nguyên của virus PRRS có thể đượ c sản xuất trong hệ thống th ực vật nhằm phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS thơng qua phươ ng pháp biểu hiện gen tạm thời. H ệ th ống bi ểu hi ện gen t ạm th ời ở th ực v ật b ằng ph ương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium nhằm sản xuất kháng ngun có nhiều ưu điểm như: Mức độ biểu hiện kháng ngun cao, có thể sản xuất ở quy mơ lớn, phươ ng pháp thực hiện đơn giản, thời gian nhanh, khơng bị ảnh hưở ng bởi vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thể tiến hành biểu hiện trong các mơ đã biệt hóa hồn tồn như lá, cung cấp kháng ngun cho mục đích sản xuất vaccine chống ch ủng virus mới xuất hiện một cách nhanh chóng khi dịch bệnh xảy ra Căn cứ vào các luận cứ khoa học và tình hình thực tiễn nêu trên, luận án được thực hiện với đề tài “Nghiên cứu biểu hiện kháng ngun (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium” với mục đích tạo cơ sở khoa học và thực nghiệm để biểu hiện các gen mã hố kháng ngun của chủng virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp lợn đang lưu hành Việt Nam bằng phương pháp biểu hiện gen tạm thời trong thực vật phục vụ cho định hướng phát triển sản xuất vaccine thế hệ mới 2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp M/GP5/GP5ectoM của chủng virus PRRS (PRRSV) đang gây bệnh lợn tai xanh ở Việt Nam bằng công nghệ biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá phục vụ cho định hướng phát triển vaccine thế hệ mới Mục tiêu cụ thể Thiết kế được 3 cấu trúc vector chuyển gen mang gen m, gp5optimize (gp5opt) và gp5ectom của chủng virus thể độc lực cao gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn dưới sự điều khiển biểu hiện bởi promoter CaMV 35S. Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hố 3 loại kháng ngun M , GP5 và GP5ectoM của chủng PRRSV thể độc lực cao trong lá cây thuốc lá và tinh sạch được kháng ngun M, GP5 và GP5ectoM tái tổ hợp từ mơ lá thuốc lá Đánh giá được tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp M, GP5 và GP5ectoM trên động vật thí nghiệm. 3. Nội dung nghiên cứu (1) Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang các gen m/gp5opt/gp5ectom mã hoá kháng nguyên MELP/ GP5ELP /GP5ectoMELP tạo chủng Agrobacterium mang vector tương ứng; (2) Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen m/ gp5opt/ gp5ectom lá cây thuốc lá N. benthamiana Biểu hiện tạm thời và tinh sạch các kháng nguyên MELP/ GP5ELP/ GP5ectoMELP tái tổ hợp; (3) Đánh giá tính sinh miễn dịch dịch thể của kháng nguyên MELP/ GP5ELP/ GP5ectoMELP tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm 4. Đóng góp mới của luận án Luận án đã tiến hành thực hiện nghiên cứu một cách tổng thể, từ việc thiết kế vector chuyển gen mang các gen mã hóa kháng ngun của virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh, tối ưu các điều kiện biểu hiện gen tạm thời trong thực vật, biểu hiện và tinh sạch kháng ngun và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng ngun tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm. Luận án là cơng trình nghiên cứu thành cơng đầu tiên tại Việt Nam về việc thiết kế vector chuyển gen và biểu hiện tạm thời các gen m/ gp5opt/ gp5ectom mã hố kháng ngun tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP của chủng virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh đang lưu hành tại Việt Nam trong lá cây thuốc lá N benthamiana bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium. Kết quả của luận án cũng đã chứng minh được các kháng ngun tái tổ hợp M ELP, GP5ELP và GP5ectoMELP có khả năng kích thích sinh kháng thể đặc hiệu kháng virus PRRS trên động vật thí nghiệm. Trong đó, kháng ngun GP5ecto (vùng ngoại bào của GP5) dung hợp với kháng ngun M (GP5ectoMELP) kích thích đáp ứng kháng thể đặc hiệu tốt hơn kháng nguyên MELP, GP5ELP riêng lẻ. Kháng nguyên GP5ectoMELP và GP5ELP là hai ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống PRRSV thể độc lực cao đang gây bệnh ở Việt Nam 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 5.1. Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp cơ sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu trúc vector chuyển gen mang gen m/gp5opt/gp5ectom mã hóa cho các kháng ngun tái tổ hợp M, GP5 và GP5ectoM của PRRSV dung hợp Elastin like polypeptide (ELP); biểu hiện tạm thời kháng ngun tái tổ hợp trên cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium; tách chiết, tinh sạch và đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể của các kháng ngun tái tổ hợp này trên động vật thí nghiệm. Kết đề tài luận án là bằng chứng khoa học về tiềm năng của việc sản xuất, phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS trong thực vật. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen m/ gp5opt/ gp5ectom mã hóa các kháng ngun tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP của chủng virus PRRS đang lưu hành ở Việt Nam và các chủng A. tumefaciens mang các vector này có thể được sử dụng để nghiên cứu biểu hiện, sản xuất và phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS Quy trình biểu hiện gen tạm thời trên lá cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ A. tumefaciens với các điều kiện tối ưu của đề tài luận án có thể ứng dụng để sản xuất các kháng ngun tái tổ hợp MELP, GP5ELP, GP5ectoMELP hoặc các protein tái tổ hợp khác Kháng ngun tái tổ hợp GP5ELP và GP5ectoMELP được tạo ra trong đề tài luận án là hai ứng viên tiềm năng cho sản xuất vaccine tiểu đơn vị phòng bệnh lợn tai xanh ở Việt Nam 6. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 131 trang (Từ Mở đầu đến Kết luận và kiến nghị, khơng bao gồm Danh mục các cơng trình cơng bố, Tóm tát luận án bằng Tiếng Anh, tài liệu tham khảo và các phụ lục), được chia thành các phần: Mở đầu gồm 5 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 37 trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp, 17 trang; Chương 3: Kết quả nghiên cứu, 47 trang; Chương 4: Bàn luận kết quả nghiên cứu, 22 trang; Kết luận và đề nghị: 2 trang; Các cơng trình đã cơng bố liên quan đến luận án: 1 trang; Tóm tắt luận án bằng tiếng anh: 7 trang; Luận án có 7 bảng số liệu, 51 hình. Ngồi ra, tài liệu tham khảo: 229 tài liệu tham khảo, trong đó 14 tài liệu tiếng Việt và 215 tài liệu tiếng Anh; Phụ lục: 5 trang; Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo và tổng kết 16 tài liệu trong nước, 217 tài liệu nước ngồi với các nội dung liên quan, bao gồm: (1) Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn, như: Sơ lược tình hình dịch bệnh; bệnh tích của PRRS; virus PRRS; (2) Vaccine phòng PRRS: Vaccine sống nhược độc; vaccine vơ hoạt; các dạng vaccine thử nghiệm dựa vào kháng ngun GP5 và M chống PRRSV; (3) Biểu hiện tạm thời kháng ngun của PRRSV ở thực vật bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium, như: Lợi thế của phương pháp biểu hiện gen tạm thời nhờ A. tumefaciens; q trình thẩm lọc nhờ A. tumefaciens; một số giải pháp tăng cường biểu hiện gen tạm thời ở thực vật. Với các dẫn liệu thu thập được, kết quả phân tích cho thấy Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp lợn (PRRS) do virus PRRS (PRRSV) gây ra, là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở lợn, được phát hiện lần đầu tiên Mỹ vào năm 1987 và đã lây lan nhiều quốc gia trên thế giới, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn ni lợn. PRRSV là loai virus RNA khơng ơn đinh, thay đơi nhanh chóng ca vê đ ̣ ̉ ̣ ̉ ̉ ̀ ặc tính di truǹ và kháng ngun, có tốc độ tiến hóa nhanh nhất trong số các virus RNA. Điều này, gây ra nhiều khó khăn cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine phòng PRRS. Hiện nay, trên thế giới đã có hơn 20 loại vaccine thương mại phòng PRRS. Các vaccine được sản xuất từ các chủng virus dòng châu Âu và dòng Bắc Mỹ dưới hai dạng chủ yếu là vaccine sống – nhược độc và vaccine vơ hoạt. Vaccine vơ hoạt thường an tồn, có khả năng phòng ngừa các triệu chứng lâm sàng nhưng hiệu quả bảo hộ khơng cao Vaccine nhược độc tạo ra miễn dịch bảo hộ tốt với các chủng tương đồng nhưng mức bảo hộ có thể giảm dần do giảm mức tương đồng với các chủng mới, có nguy phát triển độc tính trở lại, bản thân virus vaccine sau nhiều lần truyền nhiễm có thể đột biến trở thành cường độc Ở Việt nam, phát hiện bệnh PRRS lần đầu tiên vào năm 1996 trên đàn lợn giống 51 con nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam và dịch bệnh nặng xuất hiện từ năm 2007 cho đến nay. Cơng ty Hanvet đã nghiên cứu và sản xuất thành cơng vaccine PRRS nhược độc chủng Hanvet 1.VN để phòng chống PRRS ở Việt Nam. Tuy nhiên, do sự biến đổi di truyền phức tạp c ủa PRRSV, các loại vaccine đang lưu hành trên thực địa hiện nay đang mất dần hiệu lưc. Virus gây dịch tai xanh nước ta hi ện nay được xác định là thể độc lực cao, thuọc ch ̂ ủng PRRSV Băc My type II, ́ ̃ tương đồng với chủng virus gây bệnh thể độc lực cao Trung Quốc nên việc phòng bệnh khó khăn, dịch cũng nguy hiểm hơn và cần phải có vacxin phù hợp. Để nâng cao hiệu phòng chống PRRS, việc nghiên cứu sản xuất loại vaccine thế hệ mới có sự bảo hộ cao với các biến chủng mới của PRRSV hiện nay là rất cần thiết Vaccine tiểu đơn vị được sản xuất trong thực vật phòng PRRS là hướng nghiên cứu đã được đánh giá là có nhiều triển vọng và ưu điểm như ổn định và bền vững, đảm bảo hoạt tính sinh học, dễ dàng sản xuất với khối lượng lớn, chi phí sản xuất thấp Protein GP5 M protein c ấu trúc chính virus PRRS được lựa chọn là những ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống virus PRRS. Nhi ều h ệ th ống bi ểu hi ện GP5 và M của PRRSV đã đượ c thử nghiệm Biểu gen tạm th ời th ực v ật b ằng ph ương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium là phươ ng pháp để sản xuất kháng nguyên có nhiều ưu điểm đã chứng minh, như: Hàm lượ ng kháng nguyên cao, có thể sản xuất với số lượ ng lớn, chi phí thấp, thực hiện đơn giản, thời gian nhanh, khơng bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thể tiến hành biểu hiện trong các mơ đã biệt hóa hồn tồn như mơ lá. Với sự hiểu rõ về cấu trúc phân tử hệ gen và tính kháng ngun của virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh và các thành tựu đạt được về biểu hiện, sản xuất vaccine tiểu đơn vị trong thực vật phòng chống bệnh virus là căn cứ để chúng tơi thực hiện đề tài luận án này Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Chủng vi khuẩn Chủng Escherichia coli DH5α; A. tumefaciens C58C1; chủng A. tumefaciens C58C1 mang vector pIBT35S2bCMV/ pIBT35SHCPro PVY. 2.1.2. Các vector và vật liệu thực vật, động vật Vector nhân dòng pRTRA chứa đoạn promoter 35S và đoạn 100xELP ( pRTRA 35SH5HistagCmyc100xELP) (Scheller và đồng tác giả, 2006; Hoang, 2012). Vector pCB301Kan (Xiang et al., 1999); Plasmid pGEMPRRS (VN07196) mang gen m và gp5 phân lập từ virus PRRS chủng Việt Nam; vector pBSK mang đoạn gen gp5opt (gp5 optimize) đã được tối ưu mã di truyền. Cây thuốc lá Nicotiana benthamiana; Chuột bạch chủng BALB/C; Lợn con 20 ngày tuổi; tế bào MARC 145 và chủng virus PRRS 07196. 2.1.3. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu Cặp mồi nhân gen gp5opt GP5optimizeBamHI F GP5optimizeBamHI R; cặp mồi nhân gen gp5ectom là GP5ecto NcoIF và GP5ecto pspOMIR, MpspOMIF và MBamHIR; cặp mồi nhân gen m là MBamHIF và MBamHIR; cặp mồi giải trình tự vector là 35SSQF và 35STerm 2.1.4. Hóa chất Kit tách chiết plasmid, kit thơi gel và kit tinh sạch DNA (QIAGEN), thang DNA 1 Kb, thang protein (Fermentas), cac loai enzyme c ́ ̣ ắt giới hạn cua Fermentas ̉ Các hoá chất Yeast extract, Agarose, Trypton, v.v loại kháng sinh kanamycin, rifamycine và các hóa chất thơng dụng khác của các hãng Merck, Sigma,v.v Kháng thể kháng Cmyc, kháng thể antimouse IgG cộng hợp HRP (Promega USA), kháng ngun scFv (50 ng/µl), kháng thể rabit antipig IgG cộng hợp Peroxidase, hóa chất hiện màu TMB, DAB, kit hiện phim (Thermo Scientific), Protein (H5pII)3 v.v 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Nhân dòng gen m, gp5opt và gp5ectom và ghép nối vào vector pRTRA Đoạn gen m và gp5ectom được nhân dòng bằng PCR sử dụng khn là plasmid pGEMPRRS (VN07196) và đoạn gen gp5opt được nhân dòng từ khn là plasmid pBSK mang gen gp5opt với các mồi đặc hiệu tương ứng. Thành phần phản ứng PCR bao gồm 0,3 μM primer, 0,2 μM dNTPs, 2,5U Pwo SuperYield DNA polymerase, 5 μl đệm 10X Pwo SuperYield PC, 20 ng DNA khn trong tổng số 50 µl hỗn hợp. Chu trình nhiêt nh ̣ sau: 940C/ 3 phút; 32 chu kỳ với 940C/ 30 giây, 550C/ 50 giây, 720C/ 1 phút; tiếp đó là 720C/ 10 phút và sản phẩm được giữ 40C. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8%, sau đó được tinh sạch và xử lý với enzyme cắt giới hạn đã được thiết kế để ghép nối vào plasmid pRTRA 35SHistagCmyc100xELP và biến nạp vào E. coli theo phương pháp sốc nhiệt của Sambrook và đtg (2012). Khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp được chọn lọc trên mơi trường LB đặc bổ sung kháng sinh 50 mg/l kanamycin. Vector tái tổ hợp được tách chiết từ các khuẩn lạc dương tính (ColonyPCR) được giải trình tự và phân tích kiểm tra tính chính xác bằng phần mềm BioEdit 7.0 và Lasergen 7 (DNAstarinc, Madison, WI, USA) 2.2.2. Thiết kế cấu trúc vector pCB301 mang gen m/ gp5opt/ gp5ectom Vector nhân dòng pRTRA tái tổ hợp mang gen m, gp5opt và gp5ectom và vector pCB301 phân cắt enzyme HindIII Các sản phẩm cắt từ vector pRTRA bao gồm 35SmHistagCmyc100xELP; 35Sgp5optHistagCmyc100xELP; 35Sgp5ectomHistagCmyc100xELP và được ghép nối vào vector pCB301 sử dụng T4 DNA ligase và được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt (Sambrook et al., 2012). Việc chọn các dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp được thực hiện trên mơi trường LB đặc có chứa 50 mg/l kanamycin và bằng phản ứng ColonyPCR. Các vector tái tổ hợp pCB301 mang gen m/ gp5opt/gp5ectom, được tách chiết từ các dòng khuẩn lạc dương tính và kiểm tra bằng phản ứng cắt với enzyme giới hạn HindIII và NcoI. Các vector chuyển gen sau đó được biến nạp vào chủng A. tumefaciens C58C1 bằng phương pháp xung điện. Tách chiết và tinh sạch plasmid: Plasmid được tách chiết theo phương pháp của Sambrook và cộng sự (2012) Sử dụng bộ Kit do hãng Fermentas cung cấp để tinh sạch plasmid. Phương pháp xử lý DNA bằng enzyme cắt giới hạn: Thành phần phản ứng cắt được thực hiện theo sự hướng dẫn của hãng sản xuất bộ Kit sử dụng enzyme 2.2.3. Biểu hiện tạm thời gen mã hố kháng ngun tái tổ hợp trong lá thuốc lá Hình 3.7. Ảnh hưởng của vector hỗ trợ pIBT35S2bCMV và pIBT35SHCPro PVY đến mức độ biểu hiện kháng ngun tái tổ hợp thơng qua kế quả lai Western sử dụng kháng thể kháng Cmyc 3.2.2. Anh h ̉ ưởng của nồng độ AS đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hố các kháng ngun MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP Thí nghiệm với 2 nồng độ AS là 450 µM và 600 µM; kết quả cho thấy sử dụng nồng độ AS 450 µM là phù hợp nhất cho biểu hiện tạm thời của các gen mã hố các protein tái tổ hợp ở lá thuốc lá (Hình 3.8) Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến sự biểu hiện của các gen mã hóa các protein tái tổ hợp được xác định bằng lai Western blot sử dụng kháng thể kháng Cmyc 3.2.3. Anh h ̉ ưởng của mật độ vi khuẩn đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hố các protein tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP Hình 3.9. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn (OD600) đến sự biểu hiện tạm thời của các gen mã hố các kháng ngun MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP được xác định bằng lai Western Thí nghiệm biến nạp được tiến hành với dịch khuẩn có các giá trị OD600 là 0,2; 0,5 và 1,0. Kết quả thu được cho thấy mật độ vi khuẩn với giá trị OD600 = 0,5 là phù hợp nhất cho biểu hiện tạm thời các gen mã hố các protein tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELPở lá thuốc lá (Hình 3.9) 3.2.4. Anh h ̉ ưởng của tuổi sinh lý của lá đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hố các protein tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP Kết quả thu được cho thấy tuổi sinh lý của lá ảnh hưởng rõ rệt đến hiểu quả biểu hiện gen tạm thời. Lá non và lá bánh tẻ là thích hợp nhất cho biểu hiện của các gen mã hóa các kháng ngun MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP tái tổ hợp. Hình 3.10. Ảnh hưởng của tuổi sinh lý của lá đến biểu hiện tạm thời các gen mã hố cho các protein tái tổ hợp được xác định bằng lai Western blot 3.2.5. Anh h ̉ ưởng của tuổi cây đến biểu hiện tạm thời các gen mã hố các protein tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP Kết quả thu được cho thấy, cây thuốc lá ở 4 6 tuần tuổi là thích hợp để sử dụng cho biểu hiện tạm thời các gen mã hóa các kháng ngun nghiên cứu Hình 3.11. Ảnh hưởng của tuổi cây đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hóa các protein tái tổ hợp đượ c xác định bằng lai Western blot 3.2.6. So sánh mức độ biểu hiện các gen mã hố các protein tái tổ hợp (MELP, GP5ELP, GP5ectoMELP) trong điều kiện đã được tối ưu Hình 3.12. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện tạm thời các gen mã hố các kháng ngun tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP bằng lai miễn dịch dựa vào protein chuẩn đã được định lượng H5pII Kết quả phân tích cho thấy mức độ biểu hiện của các protein tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP, tương ứng là 0,75%; 0,48% và 0,95 % protein hòa tan tổng số, tương ứng là 52,4 mg/kg; 35 mg/kg và 66,8 mg/kg lá tươi (Hình 3.12) 3.3 Tinh sạch protein tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP 3.3.1. Tối ưu nồng độ PEG 8000 cho q trình tinh sạch Nồng độ 6% PEG 8000 bổ sung vào dịch chiết thực vật trong quá trình tinh sạch kháng nguyên MELP là tốt nhất (Hình 3.13). Hình 3.13. Kết quả tối ưu nồng độ PEG 8000 cho tinh sạch kháng nguyên MELP Kết quả cho thấy, nồng độ 8% PEG 8000 bổ sung vào dịch chiết thực vật trong quá trình tinh sạch kháng nguyên GP5ELP là tốt nhất (Hình 3.14). Hình 3.14. Kết quả tối ưu nồng độ PEG 8000 cho tinh sạch kháng nguyên GP5ELP Nồng độ 8% PEG 8000 bổ sung vào dịch chiết thực vật trong quá trình tinh sạch kháng nguyên GP5ectoMELP là tốt nhất (Hình 3.15). Hình 3.15. Kết quả tối ưu nồng độ PEG8000 cho tinh sạch kháng nguyên GP5ectoM ELP 3.3.2 Tinh protein tái tổ hợp MELP, GP5ELP GP5ectoMELP phương pháp mITC 3.3.2.1. Tinh sạch protein MELP Hình 3.16. Đánh giá sự tinh sạch của protein MELP bằng SDSPAGE và lai miễn dịch. A, B: 1: Dịch chiết thơ trước xử lý; 2: Dịch chảy qua màng; 3: Protein MELP tách rửa khỏi màng; (C): Protein MELP thu nhận được sau khi tinh sạch. Kết quả thu được cho thấy, đã tinh sạch thành cơng protein MELP tái tổ hợp (66 kDa) bằng phương pháp mITC có độ tinh sạch cao (Hình 3.16). Định lượng protein thu nhận được bằng phương pháp đo Bradford, lai miễn dịch và phần mềm Image J, cho thấy đã tinh sạch và thu nhận đúng protein MELP (hình 3.17) với hiệu suất thu hồi là 86,5%, mức độ tinh sạch là 82,1% Hình 3.17. Định lượng protein tái tổ hợp MELP bằng lai miễn dịch ScFV-Cmyc (đối chứng dương) đưa vào giếng với nồng độ 50, 100, 150, 200 ng/giếng 3.4.2.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp GP5ELP Kết quả thu được cho thấy, đã tinh sạch thành cơng protein GP5ELP tái tổ hợp bằng phương pháp mITC có độ tinh sạch cao (Hình 3.18). Hiệu suất thu hồi protein GP5 ELP là 98%, mức độ tinh sạch là 81,1% Hình 3.18. Đánh giá sự tinh sạch của protein GP5ELP bằng lai Western blot và điện di SDSPAGE Hình 3.19. Định lượng protein tái tổ hợp GP5ELP bằng lai Western blot và hàm lượng ScFVCmyc 3.4.2.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp GP5ectoMELP Kết quả thu được cho thấy, đã tinh sạch thành cơng protein GP5ectoMELP tái tổ hợp bằng phương pháp mITC có độ tinh sạch cao (Hình 3.20) Hiệu suất thu hồi protein GP5ELP là 95%, mức độ tinh sạch là 98% Hình 3.20. Đánh giá sự tinh sạch của protein GP5ectoMELP bằng lai Western blot và điện di SDSPAGE Hình 3.21. Định lượng protein tái tổ hợp GP5ectoMELP bằng lai Western blot và ScFV 3.5 Tính sinh miễn dịch dịch thể của các kháng ngun tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm 3.5.1. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột 3.5.1.1. Khả năng kích thích tạo kháng thể IgG đặc hiệu của kháng MELP Hình 3.22 Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh chuột được tiêm MELP bằng ELISA; Giá trị ELISA trung bình của huyết thanh chuột có độ lệch chuẩn được thể hiện ở từng chấm đen. Một chấm đen là giá trị ELISA của một con chuột. Thanh ngang là giá trị trung bình của nhóm chuột (3 con chuột/nhóm) (*: P≤0.05) Kết quả cho thấy, kháng ngun MELP tái tổ hợp được tạo ra có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch, sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trên chuột sau 2 lần tiêm phát hiện bằng ELISA (Hình 3.22) và sau 3 lần tiêm phát hiện bằng lai Western blot (Hình 3.23) Hình 3.23. Kết quả Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng MELP trong huyết thanh chuột. A: Lai miễn dịch chéo, kháng ngun là MELP, kháng thể sơ cấp là huyết thanh thu từ nhóm được tiêm vaccine PRRS nhược độc, kháng thể thứ cấp là anti mouse IgG gắn HRP, B và C: Sau 2, 3 lần tiêm MELP và PBS 3.5.1.2. Khả năng tạo kháng thể đặc hiệu IgG của kháng ngun GP5ELP Kết quả cho thấy, kháng ngun GP5ELP tái tổ hợp được tạo ra có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch, sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trên chuột sau 2 lần tiêm phát hiện bằng ELISA (Hình 3.24) và lai Western blot (Hình 3.25) Hình 3.24. Xác định kháng th ể IgG đặ c hiệ u kháng PRRSV trong huy ết thanh chuộ t đượ c tiêm GP5ELP b ằng k ỹ thu ật ELISA Hình 3.25. Kết quả Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5ELP trong huyết thanh chuột 3.5.1.3 Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng ngun GP5ectoMELP Kết quả cho thấy, kháng ngun GP5ectoMELP tái tổ hợp được tạo ra có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch, sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột sau 2 lần tiêm phát hiện bằng ELISA (Hình 3.25) và lai Western blot (Hình 3.27) Hình 3.26. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huy ết thanh chuột đượ c tiêm GP5ectoMELP bằng k ỹ thu ật ELISA Từ kết quả phát hiện kháng thể kháng PRRSV bằng ELISA và Western blot trong huyết thanh chuột, cho thấy 3 loại kháng ngun có khả năng kích thích hình thành kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột Hình 3.27. Kết quả Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5ectoMELP trong huyết thanh chuột 3.5.2 Gây miễn dịch trên lợn Dựa trên các kết quả đạt được trên chuột, hai loại kháng ngun là GP5ELP và GP5ectoMELP được lựa chọn để tiếp tục đánh giá tính sinh miễn dịch trên lợn Kháng nguyên GP5ELP và GP5ectoMELP được định lượng bằng lai Western blot dựa vào protein chuẩn đã được định lượng (H5pII)3 bằng kháng thể kháng Cmyc (Hình 3.28). Từ kết quả định lượng này, hai loại kháng nguyên được chuẩn về nồng độ 150 µg/ml mỗi loại và gây miễn dịch cho lợn thí nghiệm Hình 3.28. Kết quả định lượng các protein GP5ELP, GP5ectoMELP bằng lai Western blot dựa vào protein chuẩn đã được định lượng (H5pII)3 bằng kháng thể kháng Cmyc 3.5.2.1. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5ELP Hình 3.29. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh của lợn được tiêm GP5ELP bằng phản ứng ELISA Kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh lợn được phân tích ở ngày thứ 28 (sau 2 lần tiêm kháng ngun) và ngày thứ 35 (sau 3 lần tiêm kháng ngun) được xác định bằng phản ứng ELISA (Hình 3.32) và lai Western blot (Hình 3.29). Giá trị ELISA phân tích huyết thanh của nhóm chuột được tiêm GP5ELP là thấp hơn so với vaccine PRRS nhược độc trên lợn. Ở nhóm lợn đối chứng âm WT khơng phát hiện được kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV Hình 3.30. Kết quả lai Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5ELP trong huyết thanh của lợn 3.5.2.2. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5ectoMELP Hình 3.31. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh lợn được tiêm GP5ectoMELP bằng ELISA Phản ứng ELISA cho kết quả dương tính với kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV các mẫu huyết thanh của nhóm lợn được tiêm dịch chiết thực vật chứa protein GP5ectoMELP và vaccine PRRS nhược độc (Hình 3.31). Hình 3.32. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5ectoMELP trong huyết thanh lợn bằng lai Western blot 3.5.2.3. Xác định kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh lợn bằng phương pháp miễn dịch một lớp (IPMA) Hình 3.33 Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5ELP, GP5ectoMELP và vaccine PRRS nhược độc bằng xét nghiệm miễn dịch đơn lớp (IPMA) Các tế bào bị nhiễm PRRSV được ủ với huyết thanh đã được pha loãng. Các kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV gắn với tế bào bị nhiễm virus và được phát hiện qua IPMA, sử dụng các kháng thể Rabit antipig IgG cộng hợp peroxidase là kháng thể thứ cấp; Đối với GP5ELP, GP5ectoMELP WT: Tiêm vào ngày 0, 14 28; Đối với vaccine PRRS nhược độc tiêm 1 lần duy nhất vào ngày 0; Huyết thanh của tất cả các nhóm thu vào các ngày 0, 14, 28, 35 và 49 sau khi tiêm chủng Phân tích huyết thanh của các lơ lợn thí nghiệm được tiêm vaccine PRRS nhược độc và 2 loại protein tái tổ hợp GP5ELP, GP5ectoMELP bằng IPMA đều cho kết dương tính với kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV. Huyết thanh của nhóm lợn được tiêm dịch chiết lá thuốc lá WT, cho kết quả âm tính (Hình 3.33). Từ kết phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV bằng phản ứng ELISA và kháng thể kháng GP5ELP, GP5ectoMELP bằng lai Western blot, cho thấy kháng ngun GP5ELP, GP5ectoMELP có khả năng kích thích hình thành kháng thể đặc hiệu IgG kháng GP5 và GP5ectoM của PRRSV trên lợn Hình 3.34. Phát hiện IgG đặc hiệu kháng PRRSV bằng xét nghiệm miễn dịch đơn lớp (IPMA). Các tế bào bị nhiễm PRRSV được ủ với huyết thanh đã được pha lỗng. Các kháng thể IgG đặc hiệu PRRSV gắn với tế bào bị nhiễm virus và được phát hiện qua IPMA, sử dụng các kháng thể Rabit antipig IgG cộng hợp peroxidase là kháng thể thứ cấp. (A): Kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh của nhóm lợn được tiêm vaccine PRRS nhược độc; (B): Kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh của nhóm lợn được tiêm GP5ELP; (C): Kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh của nhóm lợn được tiêm GP5ectoM ELP, (D): Huyết thanh của nhóm lợn được tiêm WT âm tính với kháng thể kháng PRRSV Kết quả xét nghiệm IPMA cho thấy lợn được gây miễn dịch bởi 2 loại kháng ngun tái tổ hợp nghiên cứu đều cho hiệu giá kháng thể cao. Hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của nhóm lợn được tiêm GP5ectoMELP là cao hơn so với nhóm được tiêm GP5ELP và nhóm tiêm vaccine hầu hết các thời điểm phân tích huyết thanh, đạt giá trị cao nhất (2560) sau 35 ngày và duy trì ổn định ngày 49. Ở thời điểm 49 ngày sau gây miễn dịch, hiệu giá kháng thể ở tất cả lợn con thí nghiệm đều đạt giá trị ngang bằng vaccine PRRS nhược độc thương mại. Kết quả đạt đượ c cho thấy các protein tái tổ hợp GP5ELP và GP5ectoMELP của PRRSV đượ c biểu mô thuốc phương pháp biểu gen tạm thời nh A tumefaciens, có hoạt tính sinh học, giữ ngun đượ c tính kháng ngun liên quan đến GP5 và M của chủng PRRSV ban đầu. Protein tái tổ hợp GP5ELP, đặc biệt là GP5ectoMELP là hai ứng viên tốt cho các nghiên cứu phát triển sản xuất vaccine phòng bệnh lợn tai xanh Chương 3 BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Trong nghiên cứu này, chúng tơi đã thiết kế và biểu hiện tạm thời gen gp5opt, m mã hố cho kháng ngun GP5 và M của PRRSV, gen gp5ectom mã hố cho vùng ngoại bào của kháng ngun GP5 (GP5 ectodomain) liên kết với kháng ngun M của PRRSV, dung hợp với ELP nhằm bi ểu hi ện kháng nguyên tái tổ hợp mức cao trong tế bào thực vật ( pCB301 35SmHistagCmyc100xELP, pCB301 35Sgp5opt HistagCmyc100xELP, pCB301 35Sgp5ectomHistagCmyc100xELP) K ết qu ả của nghiên cứu này đã biểu hiện tạm thời thành công kháng nguyên MELP, GP5 ELP và GP5ectoMELP trong lá thuốc lá N. benthamiana bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium với hàm lượng khá cao (protein MELP là 52,4 mg/kg lá tươi, GP5ELP là 35 mg/kg lá tươi và GP5ectoMELP là 66,8 mg/kg lá tươi). Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu biểu hiện tạm thời protein huỳnh quang xanh (GFP) dung hợp với đầu C của protein GP5 (GP5CGFP) nhờ virus vector dựa vào Pepino mosaic virus (PepMV) đạt 37,29 mg/kg lá tươi. Vector tái tổ hợp dựa vào virus khảm dưa chuột Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) biểu hiện các epitope trung hoà của GP5 đạt 35,84 mg/kg lá dưa chuột tươi bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium Tran (2017); biểu tạm thời protein GP5 thuốc N. benthamiana đạt 5 mg/kg lá tươi (Cordis, 2015). Ngược lại, các protein GP5 và M khi biểu hiện trong cây chuyển lại đạt rất thấp, như biểu hiện protein GP5 trong cây thuốc lá N. tabacum chuyển gen chỉ đạt 110 ng/g lá tươi (Chia et al., 2010); biểu hiện protein LTB GP5 trong cây thuốc lá chuyển gen chỉ đạt 155 ng/g lá tươi (Chia et al., 2011); biểu hiện của protein GP5 trong cây khoai tây chuyển gen chỉ đạt 2,5 – 4,7 µg/g lá tươi và 0,8 – 1,2 µg/g củ khoai tây (Chen and Liu, 2011), và mức độ biểu hiện protein GP5 trong cây chuối chuyển gen đạt từ 157 257 ng/g lá tươi (Chan et al., 2013). Như vậy, mức độ biểu hiện của protein MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP trong nghiên cứu của chúng tôi bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium ở lá thuốc lá N. benthamiana là cao hơn đáng kể so với biểu hiện tạm thời nhờ vector virus thực vật hoặc trong cây chuyển gen. Nguyên nhân dẫn đến mức độ biểu hiện protein MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP khá cao, có thể do các protein M, GP5 và GP5ectoM được dung hợp với ELP làm giảm mức độ nhạy cảm của protein dung hợp ELP đối với các protease thực vật (Zhang et al., 1996) hoặc giảm khả năng bị thủy phân (Raucher và Chilkoti, 2001) Floss va c ̀ ộng sự (2007) đa s ̃ ử dung ph ̣ ương phap t ́ ương tự va đê xuât răng vi ̀ ̀ ́ ̀ ệc sử dung chiên l ̣ ́ ược dung hợp ELP co thê tăng ́ ̉ cương s ̀ ự biêu hi ̉ ện cua khang thê trung hoa HIV biêu hi ̉ ́ ̉ ̀ ̉ ện trong hat ̣ Protein HA của virus cúm gia cầm H5N1 dung hợp với ELP được tích luỹ trong cây thuốc lá chuyển gen là 0,5% 1% protein hồ tan tổng số (TSP) (Phan et al., 2013). Trong khi protein HA khơng gắn ELP tích luỹ trong cây thuốc lá chuyển gen chỉ đạt 0,04% TSP của lá Lợi ích của việc dung hợp ELP cũng đã được ghi nhận đối với kháng ngun HIV1 (Floss et al., 2008, 2009), Ngồi ra, Các gen mã hố protein mục tiêu được thiết kế dưới sự điều khiển của promoter 35S CaMV là promorter cơ định và biểu hiện mạnh, có thể liên tục biểu hiện gen đích trong các mơ thực vật khác nhau, các giai đoạn sinh trưởng khác nhau mọi khơng gian và thời gian (Beihaghi et al., 2018). Do đó, các gen mã hố protein MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP dưới sự điều khiển bởi promoter 35S CaMV đã được biểu hiện liên tục ở các mơ đã biệt hố như lá thuốc lá N. Benthamiana. Promoter điêu khiên đ ̀ ̉ ược xem như la m ̀ ột trong nhưng u tơ qut ̃ ́ ́ ́ đinh đên m ̣ ́ ức độ biểu hiện gen và hàm lượng protein đích. Đây có thể cũng là một trong những yếu tố giúp tăng cường mức độ biểu hiện 3 loại kháng ngun quan tâm Mặt khác, có thể do trong nghiên cứu này chúng tơi sử dụng vector hỗ trợ mang gen mã hóa protein HcPro của virus khoai tây PVY là những protein gây ức chế sự câm lặng RNA (Du et al., 2008; Ye et al., 2009). Từ các kết quả biểu hiện, sinh tổng hợp protein trong lá thuốc lá cho thấy, biểu hiện tạm thời chỉ biểu hiện protein trong các mơ đã biệt hố, khơng tạo ra cây chuyển gen nên khơng gặp phải những vấn đề về pháp lý đối với cây chuyển gen (An tồn sinh học, các vấn đề về mơi trường sinh thái đối với cây chuyển gen: Ảnh hưởng đến hệ sinh thái trong đất, phát tán nguồn gen ). Quy trình thực hiện đơn giản, giá thành cho sản xuất thấp, có thể sản xuất lượng protein mong muốn trong thời gian ngắn. Mức độ biểu hiện cao rất quan trọng. Có thể chỉ cần một lượng sinh khối lá nhỏ có thể đã đáp ứng được nhiều liều vaccine. Trong khi cây chuyển gen biểu hiện protein rất thấp, tinh sạch cũng khó khăn đối với các phần thân, rễ. Đối với phương pháp biểu hiện tạm thời, để duy trì ngun liệu cho sản xuất vaccine thế hệ mới bằng phương pháp này chỉ cần lưu giữ các trình tự vector đã được thiết kế thành cơng (hoặc các chủng Agrobacterium mang vector tương ứng). Đây cũng là những ưu điểm trong sản xuất kháng ngun tái tổ hợp Kết quả gây miễn dịch trên chuột bạch với ba loại kháng ngun nghiên cứu đều có khả năng kích thích đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột. Từ kết quả phân tích huyết thanh chuột bằng ELISA và Western blot cho thấy cả ba loại kháng ngun nghiên cứu đều kích thích hệ miễn dịch của chuột tạo kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV tự nhiên. Trong đó, kháng thể kháng MELP xuất hiện muộn nhất, sau 2 lần tiêm. Kháng thể này đã khơng được phát hiện thơng qua lai Western, mặc dù đã được phát hiện bằng ELISA. Trong khi kháng thể đặc hiệu IgG kháng GP5ELP và GP5ectoMELP đã được phát hiện bằng ELISA và Western blot ở tất cả các thời điểm phân tích huyết thanh. Điều này chứng tỏ trong huyết thanh của chuột sau hai lần tiêm kháng ngun MELP có thể đã xuất hiện kháng thể đặc hiệu IgG kháng MELP nhưng ở một mức độ quá nhỏ, chưa thể phát hiện trên màng lai Kháng nguyên GP5ectoMELP cho khả năng kích thích tạo kháng thể đặc hiệu tốt nhất trên chuột trong 3 loại protein nghiên cứu. Tương tự, nghiên cứu của Piron và cộng sự (2014) cho thấy chuột tiêm protein GP5 tinh biểu hạt Arabidopsis đã kích thích sản sinh kháng thể đặc hiệu kháng GP5 trong huyết thanh; nghiên cứu của Jiang và cộng sự (2006), chuột tiêm kháng ngun GP5 và M biểu hiện từ virus vector adenovirus có hàm lượng kháng thể đặc hiệu cao hơn đáng kể so với chuột chỉ được tiêm vector biểu hiện GP5 hoặc M riêng lẻ. Trong nghiên cứu của chúng tơi, việc tạo ra kháng ngun tái tổ hợp GP5ectoMELP là sự kết hợp của epitope quan trọng của kháng ngun GP5 và kháng ngun M tạo ra protein dạng heterodimers đã giúp kích thích hệ miễn dịch sản sinh kháng thể đặc hiệu tốt hơn protein MELP hoặc GP5ELP riêng lẻ trên chuột. Chính vì vậy, chúng tơi chỉ lựa chọn GP5ELP và GP5ectoMELP để tiếp tục gây miễn dịch trên lợn Hiệu giá kháng thể kháng PRRSV trong huyết thanh của lợn được xác định bằng phản ứng IPMA Theo Jiang và cộng sự (2006), sau các kết quả đánh giá bước đầu về tính sinh miễn dịch của vaccine DNA biểu hiện GP5, M và GP5M trên chuột, tính sinh miễn dịch của pCIORF5/ORF6 (GP5M) được tiếp tục đánh giá ở lợn con (vật chủ tự nhiên). Tất cả lợn con được tiêm chủng đều sản sinh kháng thể trung hòa sau 10 tuần kể từ khi tiêm mũi đầu tiên, trong khi khơng có kháng thể trung hòa có thể phát hiện được ở lợn con được tiêm với pCIORF5 (GP5 riêng lẻ). Những kết quả này chỉ ra rằng sự hình thành các phân tử protein dị hợp GP5M có thể liên quan đến sự biến đổi sau phiên dịch và vận chuyển GP5 và có thể đóng một vai trò quan trọng trong phản ứng miễn dịch chống lại nhiễm PRRSV. Quan trọng hơn, sự đồng biểu hiện của GP5 và protein M tạo thành heterodimers có thể cải thiện đáng kể tính sinh miễn dịch của vaccine DNA. Sự kết hợp này có thể được sử dụng một chiến lược để phát triển vaccine chống lại PRRSV (Jiang et al., 2006). Trong nghiên cứu của chúng tơi, qua các kết quả gây miễn dịch trên lợn, xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh lợn bằng IPMA, cho thấy hai loại kháng ngun tái tổ hợp GP5ELP và GP5ectoMELP đều gây ra đáp ứng miễn dịch dịch thể, kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu với hiệu giá kháng thể cao trên lợn. Trong đó, kháng ngun GP5ectoMELP có khả năng kích thích hệ miễn dịch dịch thể với hàm lượng kháng thể tạo thành cao hơn so với kháng ngun GP5ELP trong cùng một điều kiện nghiên cứu. Như vậy, sự dung hợp gen gp5ecto và m tạo thành gen gp5ectom mã hố kháng ngun dạng heterodimers GP5ectoM trong các tế bào thực vật, dẫn đến làm tăng khả năng kích thích miễn dịch với hàm lượng kháng thể cao hơn hẳn so với GP5ELP và vaccine PRRS nhược độc ngay sau một lần tiêm kháng ngun (Ngày thứ 14 sau mũi tiêm 1). Điều này có thể là do sự dung hợp của protein GP5 miền ngồi (GP5 ectodomain) với protein M làm tăng tính “cồng kềnh” và phức tạp của phân tử kháng ngun dẫn đến làm tăng khả năng kích thích sự hình thành kháng thể trong đáp ứng miễn dịch chống lại PRRSV, gây đáp ứng miễn dịch tốt hơn so với protein GP5 riêng lẻ. Kháng ngun tái tổ hợp GP5ectoMELP chứa những quyết định kháng ngun quan trọng (epitope) quan trọng trong việc kích thích hình thành kháng thể đặc hiệu của GP5 và tồn bộ phân tử protein M Ngồi ra, GP5ectoMELP chứa đi ELP, tuy nhiên ELP đã được chứng minh là khơng ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch của các protein mục tiêu khi được dung hợp cùng ELP (Phan et al., 2012). Như vậy, việc kết hợp với protein M cũng có thể là một trong những lý do giúp cho phân tử GP5ectoMELP có khả năng kích thích đáp ứng kháng thể đặc hiệu tốt. Mặc dù trong nghiên cứu này, kháng thể trung hồ chưa được xác định nhưng từ các kết quả thu được thơng qua việc xác định hiệu giá kháng thể bằng IPMA, cũng đã cho thấy khả năng kích thích tạo kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV ở các con lợn là khá tốt Trong đó, GP5ectoM có khả năng kích thích tạo kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV tốt hơn so với GP5 (Nhanh hơn, hàm lượng kháng thể cao hơn) Các hướng nghiên cứu trên thực vật nhằm tạo cây/củ ăn được phòng PRRS chưa cho hiệu quả như mong muốn. Mặt khác, việc kích thích hệ miễn dịch tạo kháng thể của protein tái tổ hợp qua đường miệng cũng có thể bị giảm hiệu quả do sự phân cắt của các protease trong niêm mạc miệng, hệ tiêu hố dẫn đến làm giảm hàm lượng kháng ngun hoặc thay đổi cấu trúc của kháng ngun. Hơn nữa, cũng rất khó khăn trong việc kiểm sốt về liều lượng cho lợn ăn, lợn cần ăn bao nhiêu lần, liều lượng mỗi lần cho ăn là bao nhiêu cũng là những vấn đề cần phải được nghiên cứu kỹ lưỡng khi sử dụng vaccine đường miệng (Gây miễn dịch cục bộ). Hiện nay, các vaccine phòng PRRS trên thị trường chủ yếu vẫn là vaccine đường tiêm (Vaccine nhược độc và vaccine bất hoạt). Như vây, hai loại kháng ngun GP5 và GP5ectoM cần được tiếp tục nghiên cứu đánh giá khả năng bảo hộ trên lợn, đánh giá khả năng trung hồ PRRSV và phát triển vaccine đường tiêm. Trong nghiên cứu này, mục đích là xác định đáp ứng kháng thể có chủ đích nhằm xem xét khả năng kích thích đáp ứng kháng thể dịch thể ở lợn của các kháng ngun mục tiêu có nguồn thực vật. Do đó, chúng tơi chưa xem xét, đánh giá độ dài miễn dịch ở lợn nên khơng đưa ra nhận định về sự biến đổi hàm lượng kháng thể IPMA trong huyết thanh lợn sau 49 ngày. Để có các thơng tin khác về đáp ứng miễn dịch đầy đủ, về tính bảo hộ của kháng ngun nhằm sản xuất vaccine cần phải thực hiện những nghiên cứu chun sâu khác, chẳng hạn như khảo sát nồng độ kháng ngun, số lần tiêm kháng ngun GP5ELP và GP5ectoMELP nhắc lại, phản ứng trung hồ virus PRRS, sự tăng sinh tế bào lympho, chiều dài miễn dịch, các chất bổ trợ, đường tiêm v.v. để nghiên cứu phát triển dựa vào GP5ELP hoặc GP5ectoMELP cũng có thể tiếp tục nghiên cứu đánh giá khả năng trung hồ PRRSV, khả năng bảo hộ của kháng ngun nghiên cứu dựa trên mối tương quan về hàm lượng kháng thể IPMA đặc hiệu từ nghiên cứu này. Theo TCVN 8685122014, ngưỡng bảo hộ của kháng thể trong máu lợn là 1/640: Đạt giá trị bảo hộ. Như vậy, với hiệu giá kháng thể được xác định bằng IPMA đạt ngưỡng bảo hộ cho lợn ở các nhóm lợn thí nghiệm đạt giá trị lớn hơn 1/640 từ ngày 28 (Nhóm lợn được tiêm GP5ectoMELP hiệu giá đạt 1066,67 và tăng lên đến 2560 ở ngày 3549; nhóm lợn được tiêm GP5ELP có hiệu giá kháng thể đạt 853,33 và tăng lên trong khi nhóm được tiêm vaccine đạt 533,33 ở ngày 28) Xét nghiệm hiệu giá kháng thể bằng phản ứng IPMA sử dụng chủng virus thực địa độc lực cao VN07196 đã phát hiện được những phản ứng dương tính và định lượng được hàm lượng kháng thể trong huyết thanh của lợn con trong thời gian theo dõi Mặt khác, kết lai miễn dịch chéo (Hình 3.36: vaccine* Hình 3.38: vaccine*) sử dụng kháng nguyên là GP5ELP/GP5ectoMELP thu ngày 35, kháng thể sơ cấp là kháng huyết thanh của nhóm lợn được tiêm vaccine PRRS nhược độc, kháng thể thứ cấp là antipig IgG gắn peroxidase cho thấy đã phát hiện được băng protein đúng kích thước tương ứng với từng loại kháng nguyên và các xét nghiệm hiệu giá kháng thể IPMA với chủng virus thực địa lưu hành (Chủng PRRSV 07196) cho thấy: Hai loại kháng ngun tái tổ hợp của virus PRRS gây bệnh tại Việt Nam được biểu hiện trong thực vật vẫn giữ được tính kháng ngun như kháng ngun liên quan đến GP5/M của chủng virus PRRS VN07196 ban đầu, có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể tốt trên chuột bạch và lợn Qua các kết quả gây miễn dịch trên lợn, xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV GP5ELP, GP5ectoMELP huyết lợn xác định bằng ELISA và Western blot và hiệu giá kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV bằng IPMA, cho thấy hai loại kháng ngun tái tổ hợp GP5ELP và GP5ectoMELP đều gây ra đáp ứng miễn dịch dịch thể, kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu với hiệu giá kháng thể cao. Trong đó, kháng ngun GP5ectoMELP kích thích hệ miễn dịch dịch thể với hiệu giá kháng thể tạo thành cao hơn so với kháng ngun GP5ELP trong cùng một điều kiện nghiên cứu. GP5ELP và GP5ectoMELP được biểu hiện tạm thời trong mơ lá thuốc lá đã có tính sinh miễn dịch dịch thể là khá cao trên lợn với hàm lượng kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV được xác định bằng IPMA cao nhất (2560) trong 49 ngày theo dõi từ ngày 35 (đối với GP5ectoMELP) và ở ngày 49 (GP5 ELP). Theo TCVN 8685122014, ngưỡng bảo hộ của kháng thể trong máu lợn là 1/640: Đạt giá trị bảo hộ. Vì vậy, với hiệu giá kháng thể trong máu của lợn đạt 2560 là khá cao và hồn tồn có giá trị bảo hộ lợn thí nghiệm. Các kết quả đạt được là các kết bước đầu rất cần thiết, là căn cứ khoa học quan trọng để khẳng định về tính kháng ngun, khả năng sản sinh kháng thể đặc hiệu kháng lại PRRSV của 2 loại kháng ngun tái tổ hợp mục tiêu, là nhằm phục vụ sản xuất vaccine tiểu phần phòng PRRS KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1) Thiết kế thành cơng ba cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen m/gp5opt/gp5ectom dung hợp ELP mã hố cho 3 loại kháng ngun MELP, GP5 ELP, GP5ectoMELP của chủng virus PRRS (VN07196) và tạo được các chủng A tumefaciens mang các vector này 2) Biểu hiện thành công protein MELP (52,4 mg/kg lá tươi), GP5ELP (35,0 mg/kg lá tươi) và GP5ectoMELP (66,8 mg/kg lá tươi) trong lá cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ A. Tumefaciens với các điều kiên biểu hiện tạm thời được tối ưu được tối ưu (Sử dụng vector hỗ trợ pIBTHcPro PVY, nồng độ AS (450 µM), mật độ vi khuẩn (OD600 = 0,5), lá non và lá bánh tẻ của cây 6 tuần tuổi và thu hoạch lá sau 6 ngày biến nạp) 3) Cả ba kháng ngun MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP đều kích thích tạo kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột với liều lượng tiêm 5 µg/con. Kháng thể kháng MELP xuất hiện muộn nhất (ở ngày 35 sau 3 lần tiêm); Kháng thể kháng GP5ELP và GP5ectoMELP xuất hiện sớm hơn (ở ngày 21 sau 2 lần tiêm) 4) Kháng ngun GP5ELP và GP5ectoMELP đều có tính sinh miễn dịch dịch thể cao trên lợn, sản sinh kháng thể kháng lại PRRSV tự nhiên. Hiệu giá kháng thể đạt giá trị bảo hộ cho lợn: GP5ectoMELP (hiệu giá kháng thể đạt giá trị cao nhất 2560 từ ngày 35) kích thích tạo kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV tốt hơn GP5ELP (hiệu giá kháng thể đạt 2560 ở ngày 49). Kháng ngun GP5ectoMELP và GP5ELP là ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị phòng chống PRRS KIẾN NGHỊ Tiếp tục thử nghiệm một số nghiên cứu chuyên sâu khác với 2 loại kháng nguyên GP5ELP và GP5ectoMELP trên lợn như: Đánh giá khả năng bảo hộ của các loại kháng nguyên vaccine: Đánh giá khả năng trung hoà PRRSV của các kháng thể đặc hiệu kháng PRRSV, thí nghiệm cơng cường độc, tiếp tục đánh giá khả năng bảo hộ của GP5ELP và GP5ectoMELP: Liều lượng tiêm, số lần tiêm, kết hợp các chất bổ trợ khác, theo dõi độ dài miễn dịch, v.v. nhằm phát triển vaccine tiểu đơn vị đường tiêm phòng Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn ... thực hiện với đề tài Nghiên cứu biểu hiện kháng ngun (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium” với mục đích tạo cơ... sở khoa học và thực nghiệm để biểu hiện các gen mã hố kháng ngun của chủng virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp lợn đang lưu hành Việt Nam bằng phương pháp biểu hiện gen tạm thời trong thực vật phục vụ... Thiết kế được 3 cấu trúc vector chuyển gen mang gen m, gp5optimize (gp5opt) và gp5ectom của chủng virus thể độc lực cao gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn dưới sự điều khiển biểu hiện bởi promoter CaMV 35S. Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hố 3 loại kháng ngun M