Luận án là nghiên cứu đầu tiên trên thế giới và Việt Nam đánh giá tác dụng kháng ung thư đầu cổ người dòng tế bào Hep2 của virus vaccine sởi phối hợp với kháng thể đơn dòng Nimotuzumab cả in vitro cũng như trên mô hình cấy ghép trên chuột thiếu hụt miễn dịch (in vivo).
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGÔ THU HẰNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ ĐẦU CỔ CỦA VIRUS VACCINE SỞI PHỐI HỢP VỚI NIMOTUZUMAB TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2020 \ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGÔ THU HẰNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ ĐẦU CỔ CỦA VIRUS VACCINE SỞI PHỐI HỢP VỚI NIMOTUZUMAB TRÊN THỰC NGHIỆM Chuyên ngành: Khoa học y sinh Mã số: 9720101 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: GS TS NGUYỄN LĨNH TOÀN PGS TS HỒ ANH SƠN HÀ NỘI– 2020 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập Học viện Quân Y, giúp đỡ Nhà trường Phòng, Ban, Bộ mơn Học viện, đến tơi hồn thành chương trình học tập Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Đảng ủy - Ban Giám đốc, Phòng Sau đại học, Bộ môn Sinh lý bệnh - Học viện Quân Y Đảng ủy, Ban Giám hiệu Trường Cao đẳng Y tế Hà Đông tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến Giáo sư, Tiến sỹ Nguyễn Lĩnh Tồn, Phó Giáo sư, Tiến sỹ Hồ Anh Sơn, người Thầy kính mến hết lịng giúp đỡ, dạy, động viên, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến Phó Giáo sư, Tiến sỹ Cấn Văn Mão – chủ nhiệm Bộ môn, thầy giáo tồn thể cán nhân viên Bộ mơn Sinh lý bệnh, Học viên Quân Y giúp đỡ, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho q trình học tập, nghiên cứu để tơi hồn thành luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn Giáo sư, Phó Giáo sư, Tiến sỹ, Nhà khoa học Hội đồng chấm luận văn dành thời gian ý kiến quý báu q trình hồn thiện bảo vệ luận án Tơi vơ biết ơn chăm sóc, động viên Gia đình, Cha Mẹ, Chồng hai thân yêu tôi, luôn bên cạnh chia sẻ với điều sống Tôi trân trọng cảm ơn quan tâm giúp đỡ tình cảm q báu bạn bè, đồng nghiệp dành cho Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Ngô Thu Hằng LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan là cơng trình nghiên cứu với hướng dẫn khoa học tập thể cán hướng dẫn Các kết nêu luận án là trung thực và công bố phần bài báo khoa học Luận án chưa cơng bớ Nếu có điều sai xin hoàn toàn chịu trách nhiệm Hà Nội, ngày tháng Tác giả luận án Ngô Thu Hằng năm 2020 MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình LỜI CẢM ƠN i Phospholipase C xi DANH MỤC CÁC BẢNG xiii DANH MỤC HÌNH xiv ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ UNG THƯ ĐẦU CỔ 1.1.1 Khái niệm ung thư đầu cổ .3 1.1.2 Tỷ lệ mắc ung thư đầu cổ .4 1.2 CÁC YẾU TỐ NGUY CƠ LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƯ ĐẦU CỔ 1.2.1 Khói th́c và ung thư 1.2.2 Rượu liên quan đến ung thư 1.2.3 HPV và ung thư biểu mô tế bào vảy họng miệng .7 1.2.4 EBV và ung thư biểu mô họng mũi 1.3 CƠ CHẾ BỆNH PHÂN TỬ CỦA UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO VẢY ĐẦU VÀ CỔ 1.3.1 Đột biến gen liên quan đến tăng sinh tế bào .10 1.3.1.1 Đột biến gen P53 10 1.3.1.2 Đột biến gen mã hóa Retinoblastoma 11 1.3.1.3 Đột biến gen mã hóa CDKN2A .12 1.3.1.4 Đột biến gen CCND1 .12 1.3.2 Đột biến gen Notch/p63 13 1.3.3.1 Vai trị thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì .13 Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal growth factor receptor EGFR) thành viên họ thụ thể ErbB (Erythroblastic B), bao gồm thành viên: EGFR (ErbB-1), HER2/neu (ErbB-2), HER3 (ErbB-3) HER4 (ErbB-4) Protein EGFR gồm 1210 acid amin có trọng lượng phân tử 170 kiloDaltons (kDa), có cấu trúc gồm vùng: vùng ngoại bào chứa miền tương tác với yếu tố tăng trưởng, vùng xuyên màng vùng nội bào chứa miền kinase phosphoryl hóa tyrosine protein (nên gọi thụ thể tyrosine kinase) .13 1.3.3.2 Vai trò RAS 16 1.3.3.3 Vai trò PIK3CA/PTEN 17 1.3.4 Vai trò tín hiệu TGF-β/SMAD đới với kết dính và xâm lấn 18 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẦU CỔ 1.4.1 Các phương pháp điều trị kinh điển 1.4.2 Các liệu pháp điều trị đích ung thư tế bào vảy vùng đầu và cổ 19 1.4.2.1 Liệu pháp hướng đích thụ thể yếu tố phát triển biểu bì 20 1.4.2.2 Liệu pháp chất ức chế tyrosine kinase 22 1.4.2.3 Liệu pháp hướng đích thụ thể tăng sinh biểu mô mạch máu 22 Thụ thể tăng sinh biểu mơ mạch máu (VEGF) protein tín hiệu tạo tế bào mà có vai trị kích thích tăng sinh mạch Sự thiếu oxy mô yếu tố mà tạo biểu mức VEGF Vấn đề xảy vùng hoại tử thiếu oxy tổ chức khối u Do đó, biểu mức VEGF xuất phổ biến HNSCC, tăng biểu VEGF kích thích tăng trưởng khối u cách thay đổi mật độ vi mạch vùng lân cận tế bào, di cư tế bào hình thành di xa tế bào ung thư Có chứng ngày rõ giảm nhạy cảm với xạ tiến triển HNSCC có liên quan đến kích thích hình thành mạch máu tế bào khối u trải qua xạ trị .22 1.4.2.4 Liệu pháp hướng đích đường tín hiệu PI3K/AKT/mTOR 23 1.4.2.5 Liệu pháp hướng đích thụ thể chết tế bào theo chương trình 23 1.5 KHÁNG THỂ ĐƠN DỊNG NIMOTUZUMAB TRONG LIỆU PHÁP ĐIỀU TRỊ ĐÍCH UNG THƯ ĐẦU CỔ 1.5.1 Khái niệm kháng thể đơn dòng .24 1.5.2 Cơ chế tác dụng Nimotuzumab điều trị ung thư đầu cổ 24 1.6 VIRUS VACCINE SỞI TRONG LIỆU PHÁP VIRUS LY GIẢI TẾ BÀO UNG THƯ 1.6.1 Virus sởi 27 1.6.1.1 Virus sởi hoang dại 27 1.6.1.2 Chủng virus vaccine sởi giảm độc lực 29 1.6.2 Thụ thể virus sởi 30 1.6.3 Hiệu lực vaccine sởi giảm độc lực và tính an toàn 31 1.6.4 Virus vaccine sởi và phản ứng miễn dịch chống ung thư 32 1.6.4.1 Tế bào ung thư đầu cổ có thụ cảm thể đặc hiệu với virus vaccine sởi 32 1.6.4.2 MeV ly giải tế bào ung thư thông qua protease đặc hiệu 32 1.6.4.3 Sự khiếm khuyết phản ứng Interferon 33 1.6.5 Các chế gây ly giải tế bào ung thư 33 1.6.5.1 MeV trực tiếp giết chết tế bào u qua hình thành hợp bào .33 1.6.5.2 Ly giải tế bào u qua trung gian kích thích miễn dịch đặc hiệu kháng u .34 1.6.5.3 Nhiễm MeV kích hoạt tế bào gai 34 1.6.5.4 Ảnh hưởng MeV loại tế bào miễn dịch khác .35 1.6.6 Các thử nghiệm lâm sàng .36 1.7 SỬ DỤNG PHỐI HỢP VIRUS VACCINE SỞI VÀ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG NIMOTUZUMAB TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ CHƯƠNG 2: 39 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .39 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1 Động vật 39 2.1.2 Vaccine sởi 39 2.1.3 Các dòng tế bào 39 2.1.4 Kháng thể đơn dòng Nimotuzumab 40 2.1.5 Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 40 2.1.5.1 Thiết bị sử dụng .40 2.1.5.2 Các dụng cụ thí nghiệm tiêu hao 40 2.1.5.3 Hóa chất 40 Môi trường nuôi cấy tế bào Vero M199, môi trường nuôi cấy tế bào ung thư EMEM mã No.30-2004 cung cấp công ty ATCC bổ sung thêm 10% huyết bê (FBS - fetal bovine serum) kháng sinh (100 U/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin) .40 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Đánh giá khả ức chế tế bào và chết theo chương trình virus vaccine sởi phới hợp Nimotuzumab dịng tế bào ung thư đầu cổ người Hep2 41 2.2.1.1 Các tiêu đánh giá .41 2.2.1.2 Các kỹ thuật thực 42 2.2.2 Đánh giá tác dụng kháng ung thư MeV phối hợp Nimotuzumab mơ hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khới u đầu cổ người Hep2 58 2.2.2.1 Chỉ tiêu đánh giá 58 2.2.2.2 Các kỹ thuật thực 58 2.3 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KẾT QUẢ, XỬ LÝ SỐ LIỆU 2.5 ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU TRÊN ĐỘNG VẬT 2.6 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU CHƯƠNG 3: 67 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 67 3.1 TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA VIRUS VACCINE SỞI PHỐI HỢP VỚI NIMOTUZUMAB IN VITRO 3.1.1 Tăng sinh virus vaccine và dòng tế bào 67 3.1.1.1 Tăng sinh dòng tế bào .67 Quan sát kính hiển vi thường: Sau 24 giờ, tế bào bám dính phân bố tương đối bề mặt đĩa nuôi cấy Tốc độ tăng sinh gấp đơi dịng tế bào Hep2 khoảng 24 giờ, tế bào phát triển tốt đạt khoảng 80-90% bề mặt nuôi cấy sau 6-7 ngày nuôi cấy tế bào (hình 3.1) 68 3.1.1.2 Tăng sinh virus vaccine 68 3.1.2 Chuẩn độ virus CCID50 .69 3.1.3 Tế bào Hep2 điều trị virus tạo hợp bào in vitro 70 3.1.4 Kết đánh giá khả ức chế tế bào thử nghiệm MTT 71 3.1.4.1 Kết ức chế tế bào nhóm nghiên cứu 71 3.1.5 Đánh giá tỷ lệ tế bào chết theo chương trình (chết apoptosis) 76 3.1.5.1 Hình thái tế bào chết apoptosis kính hiển vi thường .76 3.1.5.2 Đánh giá tế bào chết apoptosis hoại tử phương pháp flow cytometry .78 3.2 KẾT QUẢ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA VIRUS VACCINE SỞI VÀ NIMOTUZUMAB TRÊN MƠ HÌNH CHUỘT THIẾU HỤT MIỄN DỊCH MANG KHỐI UNG THƯ ĐẦU CỔ NGƯỜI 3.2.1 Kết tạo khối u tế bào Hep2 chuột nude .96 3.2.2 Kết tác dụng kháng ung thư MeV và Nimotuzumab 97 3.2.2.1 Tình trạng tồn thân chuột q trình thí nghiệm 97 Sau ghép tế bào Hep2, chuột ăn uống, tăng cân, vận động bình thường, nhanh nhẹn, đáp ứng với kích thích bình thường, hậu môn khô, không thấy biểu lỏng Tại chỗ tiêm da chuột bình thường, khơng chảy máu, khơng nhiễm trùng (bảng 3.6) 97 3.2.2.2 Diễn biến trọng lượng thể chuột nghiên cứu 98 3.2.2.3 Kết thể tích trung bình khối u chuột nghiên cứu 99 3.2.2.4 Kết thời gian sống, tỉ lệ chết chuột nude sau thời gian điều trị MeV Nimotuzumab 104 3.2.2.5 Tỷ lệ sống tích lũy chuột thí nghiệm nhóm chứng nhóm điều trị 106 3.2.3 Kết đánh giá tế bào chết theo chương trình phương pháp Flow cytometry tế bào tách từ mô ung thư .109 3.2.4 Hình ảnh mơ bệnh học khới ung thư đầu cổ người Hep chuột thiếu hụt miễn dịch ghép dị loài 110 3.2.5 Đánh giá siêu cấu trúc tế bào ung thư đầu cổ người Hep2 sau điều trị MeV phới hợp với Nimotuzumab kính hiển vi điện tử truyền qua 111 CHƯƠNG 4: 114 BÀN LUẬN 114 4.1 LỰA CHỌN KẾT HỢP VIRUS VACCINE SỞI VÀ KHÁNG THỂ 114 4.2 TÁC DỤNG LY GIẢI TẾ BÀO HEP2 IN VITRO CỦA MEV VÀ NIMOTUZUMAB 118 4.2.1 Xác định nồng độ virus phương pháp chuẩn độ CCID50 .118 4.2.3 Đánh giá khả ức chế tế bào thử nghiệm MTT 123 4.2.4.1 Hình thái tế bào chết apoptosis kính hiển vi thường 127 4.2.4.2 Đánh giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis hoạt tử phương pháp flow cytometry 130 4.2.5 MeV và Nimotuzumab có tác dụng ức chế q trình tăng sinh tế bào in vitro thơng qua kích hoạt STAT3, ISG15 133 4.3 HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ CỦA MEV KẾT HỢP NIMOTUZUMAB TRÊN MƠ HÌNH CHUỘT THIẾU HỤT MIỄN DỊCH MANG KHỐI UNG THƯ BIỂU MÔ VẢY ĐẦU CỔ .136 4.3.1 Tỷ lệ tạo khối ung thư chuột nude kỹ thuật ghép dị loại .136 4.3.2 MeV kết hợp Nimotuzumab không gây độc toàn thân cho chuột nude mang khối u đầu cổ 139 4.3.3 MeV và Nimotuzumab có tác dụng hạn chế phát triển khới ung thư biểu mô vảy đầu cổ 140 4.3.4 Kết hợp MeV và Nimotuzumab có tác dụng kéo dài thời gian sớng chuột mang khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ .143 136 Nimotuzumab cao nhóm điều trị đơn (hình 3.24) Sự tăng phiên mã STAT3 có tác dụng tăng apoptosis, giảm tăng sinh, xâm lấn tế bào ung thư Khi so sánh biểu ISG15 và STAT3 nhóm điều trị hai thời điểm 48 và 72 cho thấy: nhóm điều trị Nimotuzumab phiên mã ISG15 và STAT3 thời điểm 72 tăng so với nhóm 48 giờ; ngược lại nhóm điều trị MeV biểu gen thời điểm 72 lại có xu hướng giảm so với thời điểm 48 (hình 3.24; hình 3.25) Kết này phù hơp với kết đánh giá khả tăng cường apoptosis tế bào nuôi cấy phương pháp Flow cytometry MeV có tác dụng làm tăng apoptosis sớm ngày từ thời điểm 48 giờ, sau tăng q trình apoptosis muộn và hoại tử tế bào thời điểm 72 và 96 Còn Nimotuzumab có tác dụng kích thích q trình apoptosis mạnh thời điểm 72 và 96 Và kết hợp làm tăng hiệu điều trị so với hai nhóm điều trị đơn Như vậy, chế và vai trò STAT3 ung thư là phức tạp Cần tiếp tục nghiên cứu rõ chế tác động STAT3 tới phát triển, xâm lấn, di tế bào khối u thời điểm khác 4.3 HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ CỦA MEV KẾT HỢP NIMOTUZUMAB TRÊN MƠ HÌNH CHUỘT THIẾU HỤT MIỄN DỊCH MANG KHỐI UNG THƯ BIỂU MÔ VẢY ĐẦU CỔ 4.3.1 Tỷ lệ tạo khối ung thư chuột nude kỹ thuật ghép dị loại Mơ hình ung thư biểu mô tế bào vảy đầu cổ chuột nhắt thiếu hụt miễn dịch BALB/c tỷ lệ 100% sau ghép 106 tế bào Hep2 vị trí da đùi phải vào ngày thứ 11 Chuột bắt đầu xuất khới u vị trí tiêm 3-4 ngày sau ghép, thể tích khới u tăng dần Chuột vận động, lại bình thường, khơng tiêu chảy, khơng sưng nề, không chảy máu, không nhiễm trùng nơi tiêm Kết này cho thấy khối ung thư đã tạo thành công chuột nude 137 Chúng lựa chọn phương pháp ghép tế bào ung thư vào tổ chức da chuột là cách làm phổ biến, đã tác giả thực trước , , Bằng phương pháp này, đã ghép thành công tế bào ung thư biểu mô vảy đầu cổ (Hep2) chuột nhắt thiếu hụt miễn dịch BALB/c Sau ghép, tế bào Hep2 phát triển tốt thể động để tạo thành khối u với tỷ lệ thành công cao (100%) sau 11 ngày vị trí ghép da vùng đùi phải Phương pháp tiêm tế bào vào tổ chức da này có ưu điểm là kỹ thuật tiến hành đơn giản, khơng cần gây mê động vật, khới u phát triển, dễ dàng can thiệp vào khối u để điều trị và đo kích thước thước kẹp Trong nghiên cứu này, ghép với số lượng tế bào 10 tế bào Hep2/chuột Số lượng tế bào này tương đương với số lượng tế bào số nghiên cứu và ngoài nước trước Một số tác giả nước sử dụng liều 10 tế bào để tạo khối ung thư vị trí da chuột và có kết tớt như: Tác giả Nguyễn Đình Bảng và cộng ghép 106 tế bào PC-3/chuột để tạo khối ung thư tuyến tiền liệt người chuột thiếu hụt miễn dịch Nghiên cứu Khánh Thị Nhi và cộng đã sử dụng 107 tế bào PC-3/chuột để tạo khối u vùng đùi phải chuột thiếu hụt miễn dịch để tạo khối ung thư tế bào tuyến tiền liệt người Trên giới số nghiên cứu sử dụng sớ lượng tế bào nhiều so với nghiên cứu để tạo khối ung thư chuột thí nghiệm: Nghiên cứu Shen F và cộng đã ghép 0,2 x 10 tế bào CT 26/chuột Sau tạo khối ung thư biểu mơ tế bào vảy đầu cổ dịng Hep2 chuột BALB/c đã tiến hành phân tích giải phẫu bệnh lý khới ung thư chuột Hình ảnh vi thể khới ung thư biểu mơ tế bào vảy dòng Hep2 chuột thiếu hụt miễn dịch có đặc điểm giớng khới ung thư biểu mô tế bào vảy nguyên phát người: tế bào biểu mô tăng sinh mạnh, xếp sát nhau, ranh giới tế bào không rõ Các tế bào u có nhân trịn 138 bầu dục, tăng sắc, nhiều tế bào có hạt nhân to, rơ Mật độ nhân chia cao, nhiều nhân chia bất thường Bào tương hẹp, sớ bào tương có nhánh (hình 3.33) Điều chứng tỏ chúng tơi ghép tế bào ung thư biểu mơ vảy đầu cổ vị trí da chuột thiếu hụt miễn dịch khới u tạo mang đầy đủ đặc tính tế bào ung thư người nguyên phát là ung thư biểu mơ biệt hóa Việc ghép thành cơng tế bào ung thư biểu mô vảy đầu cổ Hep2 vào chuột thiếu hụt miễn dịch BALB/c đã cung cấp thêm mơ hình ung thư động vật thiếu hụt miễn dịch mang đặc điểm, tính chất, khả gây bệnh tế bào ung thư người nguyên phát để phục vụ nghiên cứu tiền lâm sàng ung thư Kết này có ý nghĩa việc lựa chọn giống chuột để gây mô hình ung thư lựa chọn liều tế bào ung thư để ghép vào chuột Trong nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch và kháng ung thư virus vaccine sởi kết hợp với kháng thể đơn dòng Nimotuzumab, chúng tơi đã lựa chọn thực nghiệm nhóm chuột thiếu hụt miễn dịch BALB/c 40 chuột BALB/c nude ghép 10 tế bào ung thư biểu mơ vảy đầu cổ Hep2 vị trí da đùi phải Sau 11 ngày tiêm tế bào, tỉ lệ xuất u đạt 40/40 (100%) Sử dụng chuột thiếu hụt miễn dịch là bước đột phá nghiên cứu ung thư, đã cho phép nghiên cứu ung thư người thể động vật để đánh giá phát triển tế bào ung thư, phát chế bệnh sinh bệnh, đánh giá tác dụng điều trị tế bào khối u việc khảo sát hiệu liệu pháp điều trị ung thư trước đưa vào ứng dụng điều trị lâm sàng, đồng thời có hạn chế cần nghiên cứu khắc phục Sử dụng mơ hình này tiếp tục là phương pháp quan trọng nghiên cứu ung thư 139 4.3.2 MeV kết hợp Nimotuzumab khơng gây độc tồn thân cho chuột nude mang khối u đầu cổ An toàn là điều quan trọng, đặc biệt có tỷ lệ lớn bệnh nhân ung thư tuổi cao và trạng yếu Trong nghiên cứu này, chúng tơi theo dõi tính an toàn MeV và Nimotuzumab chuột mang khối ung thư đầu cổ người sau tiêm vaccine sởi và kháng thể đơn dòng Nimotuzumab Sau tiêm MeV nội u (6 lần, lần/tuần) và Nimotuzumab đường tĩnh mạch đuôi (liều nhất), chuột hoạt động bình thường, khơng chảy máu, chỗ tiêm khơng nhiễm khuẩn, khơng lt, chuột hoạt động bình thường, vận động nhanh nhẹn, không lỏng Trọng lượng chuột tăng dần tương ứng với tăng kích thước khới u, khơng có khác biệt trọng lượng nhóm điều trị MeV và Nimotuzumab với nhóm chứng thời điểm nghiên cứu Kết cho thấy MeV và Nimotuzumab không gây độc toàn thân chuột nude mang khối u tế bào Hep2 Trong q trình nghiên cứu, chuột nhóm chăm sóc điều kiện thí nghiệm nhau, chuột khơng có dấu hiệu bệnh lý khác gây tử vong, Như vậy, tỉ lệ chuột chết và số ngày sớng chuột nhóm phụ thuộc vào phát triển, tiến triển và hậu khối u tế bào Hep2 gây nên Trong 50 năm qua, MeV sống, giảm độc lực đã tiêm chủng cho tỷ người với độ an toàn cao đã ghi nhận Trong thử nghiệm lâm sàng virus sởi – là virus gây ly giải tế bào cho thấy khả dung nạp tốt và gây tác dụng không mong muốn mức độ nhẹ Một liều vaccine chuẩn không 1.000 liều CCID50 tiêm da so với liều tiêm tĩnh mạch cao là 10 11 CCID50 tiêm tĩnh mạch thử nghiệm lâm sàng để điều trị bệnh đa u tủy xương tiến triển Mặc dù phần lớn là bệnh nhân lớn tuổi và đã trải qua nhiều đợt hóa trị liệu làm thể suy yếu, suy giảm miễn dịch họ đã dung nạp điều trị MeV tớt Nhìn chung, MeV giảm độc lực coi là loại vaccine 140 an toàn Nimotuzumab (Cimaher) chứng minh có hiệu quả, an toàn, biến chứng nặng điều trị HNSCC tiến triển không phẫu thuật cách an toàn , 4.3.3 MeV Nimotuzumab có tác dụng hạn chế phát triển khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ Để đánh giá tác dụng ức chế phát triển khối HNSCC MeV phối hợp với Nimotuzumab in vivo, tiêm 106 tế bào (0,1 ml dung dịch khối u nồng độ 107 tế bào/ml) Hep2 vị trí da đùi phải phù hợp cho liệu pháp điều trị tiêm MeV nội u, gia tăng khả virus tiếp xúc và xâm nhập vào khới u Khi thể tích khới u đạt khoảng 220-240 mm3, chuột chia thành nhóm (Nhóm chứng: chuột tiêm tĩnh mạch PBS liều 0,1 ml/chuột; Nhóm MeV: chuột được tiêm MeV trực tiếp vào khối u lần, lần/tuần, liều 107pfu/lần/con; Nhóm Nimotuzumab: chuột tiêm tĩnh mạch dung dịch Nimotuzumab liều 100μg/chuột; Nhóm MeV+Nimotuzumab: chuột được tiêm MeV trực tiếp vào khối u lần, lần/tuần, liều 107pfu/lần/con và tiêm tĩnh mạch đuôi dung dịch Nimotuzumab liều 100μg/chuột) Tại thời điểm phân nhóm điều trị thể tích khới u nhóm chuột là tương đương, khơng có khác biệt (bảng 3.8) Tại tất thời điểm nghiên cứu kích thước khới u nhóm điều trị thấp nhóm chứng, khác biệt có ý nghĩa thớng kê nhóm chuột điều trị MeV và Nimotuzumab so với nhóm chứng (bảng 3.9, 3.10, 3.11, 3.12; hình 3.28, hình 3.29) Mặt khác, tất các thời điểm nghiên cứu thể tích khới u nhóm điều trị phới hợp MeV và Nimotuzumab thấp nhóm điều trị đơn MeV và Nimotuzumab, nhiên khác biệt này chưa có ý nghĩa thớng kê (p > 0,05) Kết đã việc kết hợp MeV và Nimotuzumab làm tăng hiệu kháng HNSCC động vật thực nghiệm và chế kết nghiên cứu này cần bàn luận để làm sáng tỏ 141 MeV chủng Edmonston sử dụng thụ cảm thể đặc hiệu CD46 – thụ thể thường biểu mức tế bào ung thư, đặc biệt là tế bào ung thư ung thư tế bào vảy, HNSCC tỷ lệ biểu thụ thể CD46 lên tới 85-99% Dịng tế bào ung thư biểu mô vảy đầu cổ người Hep2, có biểu lộ cao thụ thể CD46 và EGFR Hình ảnh mơ bệnh học tế bào Hep2 ghép chuột thiếu hụt miễn dịch cho thấy khối u ghép mang đặc tính khới u ngun (hình 3.33) Do vậy, MeV dễ dàng xâm nhập và giết chết tế bào ung thư này lại ảnh hưởng đới với tế bào bình thường MeV có khả trực tiếp giết chết tế bào ung thư thơng qua hình thành hợp bào, khả virus tạo hợp bào tương quan với tiềm ly giải tế bào ung thư chúng Ngoài khả ly giải tế bào khối u, MeV cịn có khả kích hoạt hệ thớng miễn dịch tham gia hiệu vào liệu pháp điều trị sử dụng MeV Hoạt động kháng u qua trung gian miễn dịch bẩm sinh và thích ứng phới hợp với phá hủy tế bào trực tiếp là cần thiết tạo nên thành công liệu pháp sử dụng OLV , , Các nghiên cứu in vitro và in vivo đã khẳng định tác dụng kháng ung thư MeV dòng tế bào ung thư người khác Msaouel P và cộng (2009), nghiên cứu virus vaccine sởi kháng ung thư tuyến tiền liệt Kết với tổng liều 6×106 TCID50 MeV đường đưa phúc mạc bụng dẫn đến giảm tăng trưởng khối u có ý nghĩa thớng kê (p = 0,004) mơ hình chuột ghép dị loài mang khới ung thư tuyến tiền liệt người tế bào PC-3 Li H và cộng (2012) đã nghiên cứu khả MV-NIS kháng tế bào HNSCC chuột nude mang khối u tế bào FaDu Kết cho thấy phát triển khối u bị ức chế đáng kể chuột điều trị MVNIS so với nhóm chứng (p < 0,05) Nhiều thử nghiệm lâm sàng đã chứng hiệu MeV điều trị khối ung thư người như: MeV với liều 102 -103 TCID50 142 có tác dụng làm thối triển khối u bệnh nhân bị ung thư tế bào T giai đoạn IIb muộn ; MeV làm tăng thời gian sớng trung bình bệnh nhân ung thư buồng trứng so với thời gian sống kỳ vọng thời điểm công bố , Hiện có sớ thử nghiệm lâm sàng sử dụng MeV nghiên cứu, bao gồm bệnh nhân bị ung thư nguyên bào sợi thần kinh (NCT00503177), ung thư biểu mô tế bào vảy (NCT01846091), u bướu thần kinh ngoại vi (NCT02700230) đa u tủy xương (NCT02192775, NCT00450814), ung thư buồng trứng, ung thư dày và phúc mạc (NCT00408590, NCT02364713) Sự phát triển lĩnh vực này quan trọng cho hướng tương lai việc sử dụng MeV là tác nhân ly giải tế bào Kết nghiên cứu cho thấy kết hợp MeV với kháng thể đơn dòng Nimotuzumab làm tăng cường hiệu kháng u Sự kết hợp MeV với liệu pháp miễn dịch khác cần quan tâm và nghiên cứu sâu tương tác MeV ly giải tế bào và vi mơi trường khới u cải thiện kết điều trị EGFR thường có biểu mức số ung thư biểu mô, có HNSCC EGFR giữ vai trị quan trọng phát triển, xâm lấn, di và tăng sinh tân tạo mạch máu và tiên lượng xấu và đáp ứng với xạ trị khối u HNSCC , , Trong thử nghiệm tiền lâm sàng in vitro nghiên cứu in vivo, Nimotuzumab chứng minh là có tác dụng chớng tăng sinh mạnh, và hoạt hố apoptosis thơng qua việc gắn đặc hiệu Nimotuzumab với EGFR, phức hợp này làm ức chế đường phosphorin hoá EGFR làm tế bào ngừng phân bào phase G1 S, tế bào ung thư bị tác động ngừng phân chia, cảm ứng chết tế bào theo chương trình Tác dụng gây độc tế bào ung thư cịn thơng qua đường hoạt hóa bổ thể để làm tan tế bào ung thư, qua chế tăng kết dính miễn dịch làm tăng cường chức đại thực bào tham gia tiêu diệt tế bào ung thư thông qua chế gây 143 độc tế bào phụ thuộc kháng thể: tế bào NK vớn có thụ thể với mảnh Fc IgG, nhận tín hiệu từ kháng thể đơn dịng và tăng khả gây độc tế bào ung thư chúng đã gắn kháng thể Nimotuzumab chứng minh có hiệu điều trị HNSCC tiến triển không phẫu thuật Nimotuzumab chứng minh là an toàn và biến chứng nặng , Như vậy, MeV và Nimotuzumab chứng là an toàn, tác dụng phụ, có khả nhắm đích với tế bào HNSCC có biểu lộ thụ thể CD46 và EGFR cao, có tác dụng tăng q trình apoptosis tế bào u, tăng kích thích hệ miễn dịch để tăng cường khả ly giải tế bào ung thư Một số nghiên cứu đã chứng minh hiệu kháng ung thư tăng lên phối hợp OLV với với liệu pháp miễn dịch , , Kết nghiên cứu khẳng định khả ức chế phát triển khối u tăng lên phới hợp MeV và kháng thể đơn dịng Nimotuzumab mơ hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khới ung thư biểu mô vảy đầu cổ người 4.3.4 Kết hợp MeV Nimotuzumab có tác dụng kéo dài thời gian sống chuột mang khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ Tác dụng kháng ung thư MeV và Nimotuzumab cịn đánh giá thơng qua thời gian sớng trung bình, tỷ lệ chuột chết và tỷ lệ sớng sót nhóm điều trị so với nhóm chứng Sau 60 ngày theo dõi, thu kết quả: thời gian sớng trung bình nhóm kết hợp MeV và Nimotuzumab là 58,1 ngày, MeV là: 49,1 ngày; nhóm Nimotuzumab là: 45,4 ngày; nhóm chứng là 38,6 ngày; khác biệt nhóm chứng và nhóm kết hợp MeV và Nimotuzumab với p = 0,009 (hình 3.30) Kết thúc thí nghiệm, sớ chuột cịn sớng nhóm chứng là 2/10 (20%), nhóm MeV là 6/10 (60%, nhóm Nimotuzumab là 4/10 (40%), và nhóm MeV + Nimotuzumab là 8/10 (80%); khác biệt nhóm chứng và nhóm kết hợp MeV và Nimotuzumab với p < 0.05 (hình 3.31) Đồng thời, tỉ lệ sớng sót tích 144 lũy tính đến thời điểm ngày thứ 60 sau điều trị nhóm điều trị kết hợp MeV và Nimotuzumab là 0,80 cao so với nhóm MeV là 0,60; nhóm Nimotuzumab là 0,40 và nhóm chứng với tỉ lệ sớng sót là 0,20 Kết nghiên cứu tương đồng với số nghiên cứu khác chứng minh MeV có tác dụng kéo dài thời gian sớng chuột nude ghép dị loài dịng tế bào ung thư người khác Meng X và cộng (2010), nghiên cứu virus vaccine sởi dòng Edmonston kháng ung thư thận mơ hình chuột nude mang khối tế bào A498, kết sau 80 ngày theo dõi, nhóm điều trị MeV tỷ lệ sớng cải thiện đáng kể so với nhóm chứng khơng điều trị (nhóm tiêm MV-NPL (55%), so với nhóm đới chứng (0%), nhóm tiêm MV-Etag (0%) và nhóm tiêm MV-P(11%)) Msaouel P và cộng (2009), nghiên cứu virus vaccine sởi kháng ung thư tuyến tiền liệt mơ hình chuột nude mang khới tế bào PC-3, kết cho thấy MV-CEA có tác dụng kéo dài thời gian sớng so với nhóm bất hoạt UV; thời gian sớng sót chuột điều trị MV-CEA là 77 ngày so với 45 ngày nhóm bất hoạt UV; 60% chuột cịn sớng vào ngày 90 nhóm MV-CEA so với 0% nhóm bất hoạt UV; 20% sớ chuột nhóm MVCEA thối u hoàn toàn Li H và cộng (2012) đã nghiên cứu khả MV-NIS kháng tế bào HNSCC chuột nude mang khối u tế bào FaDu Kết cho thấy thời gian sớng trung bình chứng dùng PBS 131I là khoảng 29 ngày, nhóm chuột điều trị MV-NIS là 41 ngày (p < 0,05) và nhóm kết hợp MV-NIS và 131 I là 47 ngày (p < 0,01) Nimotuzumab chứng minh có hiệu giúp kéo dài thời gian sớng điều trị HNSCC , , ung thư biểu mô tế bào vảy thực quản Kéo dài thời gian sớng sau chẩn đốn và điều trị, nâng cao chất lượng sớng cho người bệnh là tiêu chí lâm sàng quan trọng cho phương pháp hay thuốc điều trị ung thư nào Kết nghiên cứu cho thấy sử dụng kết hợp MeV và Nimotuzumab giúp kéo dài 145 thời gian sống trung bình, tăng tỷ lệ sớng sót so với điều trị đơn MeV Nimotuzumab Điều này là phù hợp với kết thử nghiệm in vitro chúng tôi: thử nghiệm MTT đánh giá khả ức chế tế bào Hep2, Flow cytometry đánh giá khả apoptosis tế bào khối u, thử nghiệm Realtime PCR đánh giá phiên mã gen STAT3 và ISG15 liên quan đến trình apoptosis tế bào ung thư Kết của thử nghiệm in vitro cho thấy điều trị kết hợp MeV và kháng thể đơn dịng Nimotuzumab tăng khả ức chế tế bào khối u, tăng tỷ lệ tế bào apoptosis, tăng tỷ lệ tế bào chết hoại tử so với điều trị đơn MeV Nimotuzumab Kết nghiên cứu là sở quan trọng cho bước nghiên cứu để kết hợp MeV và Nimotuzumab điều trị khối ung thư đầu cổ lâm sàng 4.3.5 Kết phân tích siêu cấu trúc tế bào Hep2 chuột nude điều trị MeV kết hợp với Nimotuzumab Chết tế bào apoptosis đặc trưng loạt thay đổi hình dạng và cấu trúc tế bào bao gồm nhân, tế bào chất và màng tế bào Những thay đổi nhân tế bào là thay đổi đặc trưng nhất, thay đổi quan trọng khác xảy tế bào chất với thay đổi cấu trúc và chức bào quan đặc biệt là ti thể Ti thể đóng vai trò quan trọng việc điều chỉnh tế bào chết theo chương trình Ti thể chứa nhiều protein pro-apoptotic Apoptosis Inducing Factor (AIF), Smac/DIABLO và cytochrome C Những yếu tớ này giải phóng từ ti thể sau hình thành lỗ rỗng màng ti thể gọi là lỗ chuyển hóa thấm Những lỗ rỗng này hình thành thơng qua hoạt động thành phần pro-apoptotic họ protein bcl-2, kích hoạt tín hiệu apoptotic stress tế bào, tổn thương gốc tự thiếu yếu tố tăng trưởng Ti thể đóng vai trị quan trọng việc khuếch đại tín hiệu apoptotic từ thụ thể tử vong, với thụ thể bổ sung caspase kích hoạt protein bcl-2 pro-apoptotic, Bid 146 Để quan sát cách rõ rệt biến đổi tế bào khối u (in vivo) trình apoptosis, chúng tơi sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) đánh giá thay đổi siêu cấu trúc tế bào u Hep2 cấy ghép chuột nude sau điều trị MeV và kháng thể đơn dịng Nimotuzumab Kết cho thấy có hình ảnh tế bào Hep2 bình thường và tế bào Hep2 trình chết apoptosis Hình ảnh tế bào Hep2 bình thường có chromatin hạch nhân hình trịn, bắt màu đậm, ranh giới rõ ràng, bào quan nguyên vẹn, có vi nhung mao bề mặt ngoài tế bào Tế bào Hep2 sinh sản hình thức nhân đơi (hình 3.34) Hình ảnh tế bào Hep2 trình chết apoptosis bao gồm: tế bào co trịn lại, vi nhung mao, hình ảnh virus vaccine sởi xâm nhập vào tế bào Hep2 tạo thành hợp bào là tế bào kích thước lớn, nhiều nhân bắt màu đậm, ngưng tụ điều trị sắc thể, phân mảnh hạt nhân, có giọt lipid và biến đổi đường nét hạt nhân, nhiều khơng bào tế bào chất, hình thành nhiều tế bào bọt, có tế bào hoại tử thứ phát (hình 3.35) Những biến đổi tế bào trình chết apoptosis chúng tơi tương tự hình ảnh số nghiên cứu trước nghiên cứu biến đổi tế bào trình apoptosis Hình ảnh tế bào Hep2 điều trị MeV co cụm tạo thành hợp bào (hình 3.35) nghiên cứu phù hợp với chế quan trọng gây ly giải tế bào ung thư virus sởi là hình thành hợp bào đã phân tích Quan sát kính hiển vi điện tử truyền qua, chúng tơi cịn thấy hình ảnh tế bào hoại tử (hình 3.35) Đây là tế bào hoại tử sau điều trị MeV autophagy, đường giết chết tế bào u điều trị OLV khác với kích hoạt đường apoptosis Điều này củng cớ thêm MeV giết chết tế bào đường gây hoại tử tế bào hay chết autophagy Chết tế bào có chọn lọc tự thực bào (autophagy) đã chứng minh là có vai trị kiểm sốt phóng thích cytochrome C và ức chế trình apoptosis tạo điều kiện cho virus nhân lên tế bào u Các nghiên cứu 147 trước cho chết tế bào autophagy là chế bảo vệ tế bào khỏi hóa chất độc và yếu tớ có hại tế bào bị stress, làm giảm xu hướng tế bào trải qua apoptosis Apoptosis coi là chế mà qua tế bào vật chủ bảo vệ chớng lại điều trị virus OLV sử dụng autophagy để chớng lại q trình apoptosis và có lợi cho chép Do autophagy thúc đẩy lây nhiễm MeV, trì lây lan virus dẫn đến hoại tử tế bào cạn kiệt ATP Do đó, tế bào chết hoạt tử là đường ly giải tế bào u OLV Như vậy, MeV ngoài khả kích thích đường tế bào chết apoptosis - chế quan trọng gây chết tế bào ung thư cịn có khả gây chết tế bào u đường khác hoại tử tế bào hay autophagy, từ làm giảm phát triển khối u 4.4 HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI Trong nghiên cứu này đánh giá tác dụng kháng ung thư virus vaccine sởi và Nimotuzumab in vitro và in vivo Trên mơ hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối HNSCC người tế bào Hep2, thử nghiệm đường đưa MeV vào thể chuột là đường nội u Đây là hạn chế sử dụng MeV để điều trị khối u người phần lớn dân sớ có miễn dịch với sởi Các chương trình tiêm chủng mở rộng MeV bắt đầu vào cuối năm 70 để ngăn chặn khả lây lan cao MV-wt Ở nhiều quốc gia, tỷ lệ tiêm chủng MeV đạt 90% dân số, đặc biệt là với diện kháng thể trung hịa tồn śt đời Những kháng thể trung hịa hạn chế lây nhiễm MeV đối với tế bào khới u Thật vậy, mơ hình cấy ghép tế bào u tủy người vào chuột nude, kháng thể trung hoà làm giảm hiệu liệu pháp điều trị sử dụng MeV MeV tiêm cách có hệ thớng Vấn đề đặt là thay tiêm MeV trực tiếp vào máu tiêm tế bào nhiễm MeV và xem tế bào nhiễm virus là 148 “vật mang” virus để bảo vệ virus khỏi trụng hòa kháng thể ; tiêm MeV trực tiếp vào bên khối u; tiêm vào phúc mạc; đưa virus vào thể sau đã sử dụng thuốc ức chế miễn dịch Kết nghiên cứu cho thấy tác dụng kháng ung thư đầu cổ in vitro và in vivo điều trị kết hợp đồng thời MeV và Nimotuzumab cao đáng kể điều trị đơn với MeV Nimotuzumab Tuy nhiên chế tác dụng kháng ung thư điều trị kết hợp đồng thời MeV và Nimotuzumab nhiều điều chưa rõ Điều này mở hướng nghiên cứu chế tác dụng kháng ung thư sử dụng phối hợp hai liệu pháp đặc biệt đối với ung thư đầu cổ 149 KẾT LUẬN MeV phối hợp Nimotuzumab có tác dụng ức chế tế bào ung thư biểu mơ vảy đầu cổ người dịng Hep2 in vitro MeV ly giải tế bào Hep2 trực tiếp tạo hợp bào ngày thứ điều trị virus, hiệu ngày thứ và Thử nghiệm MTT thời điểm 72 và 96 sau điều trị MeV và Nimotuzumab cho thấy tỉ lệ tế bào sớng ba nhóm điều trị (MeV, Nimotuzumab và phối hợp MeV+Nimotuzumab) thấp so với nhóm chứng Tỉ lệ tế bào sớng nhóm điều trị phới hợp MeV+Nimotuzumab thấp so với nhóm điều trị đơn MeV và Nimotuzumab (p < 0,001) MeV và Nimotuzumab có khả ly giải tế bào Hep2 thơng qua đường chết tế bào theo chương trình (apoptosis), hiệu tốt thời điểm 72 Tỉ lệ tế bào apoptosis nhóm điều trị cao nhóm chứng (p < 0,05) Nhóm phới hợp MeV+Nimotuzumab có tỉ lệ tế bào chết theo chương trình giai đoạn sớm, giai đoạn muộn và tế bào chết hoại tử cao nhóm điều trị đơn (p < 0,05) Tăng cường phiên mã STAT3 và ISG15 (thời điểm 72 và 96 giờ) nhóm điều trị cao nhóm chứng, nhóm điều trị phối hợp cao điều trị đơn MeV phối hợp Nimotuzumab có tác dụng kháng ung thư chuột mang khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ người dịng Hep2 (in vivo) MeV và Nimotuzumab có tác dụng kháng ung thư chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ người Hep2: - Làm chậm q trình phát triển khới u rõ rệt so với nhóm chứng (p < 0,05) Khới u nhóm điều trị phới hợp có xu hướng phát triển chậm nhóm điều trị đơn - Thời gian sớng trung bình nhóm điều trị dài so với nhóm 150 chứng (p = 0,009) Tỷ lệ chuột sớng nhóm chứng là 2/10 (20%), nhóm MeV là 6/10 (60%), nhóm Nimotuzumab là 4/10 (40%), và nhóm phối hợp là 8/10 (80%) (p < 0,05) - Tỷ lệ sớng tích luỹ tính đến thời điểm 60 ngày theo dõi nhóm chứng là 0,2; nhóm MeV là 0,6; nhóm Nimotuzumab là 0,4 và nhóm kết hợp MeV và Nimotuzumab là 0,8 (p < 0,05) - Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào Hep2 sau điều trị MeV khẳng định thêm tác dụng gây tổn thương tế bào u Hep2 MeV thông qua đường gây chết tế bào theo chương trình và hoại tử tế bào ... Nimotuzumab thực nghiệm? ?? nhằm mục tiêu: Đánh giá tác dụng kháng ung thư virus vaccine sởi phối hợp với Nimotuzumab in vitro Đánh giá tác dụng kháng ung thư virus vaccine sởi phối hợp với Nimotuzumab. .. QUÂN Y NGÔ THU HẰNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ ĐẦU CỔ CỦA VIRUS VACCINE SỞI PHỐI HỢP VỚI NIMOTUZUMAB TRÊN THỰC NGHIỆM Chuyên ngành: Khoa học y sinh Mã số: 9720101 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC... nào và ngoài nước đánh giá hiệu kháng ung thư virus vaccine sởi phối hợp với Nimotuzumab Chính v? ?y, nghiên cứu sử dụng virus vaccine sởi phới hợp với kháng thể đơn dịng Nimotuzumab mong đợi