Tóm tắt luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đầu cổ của Virus Vaccine sởi phối hợp với Nimotuzumab trên thực nghiệm

Luận án với mục tiêu đánh giá tác dụng kháng ung thư của virus vaccine sởi phối hợp với Nimotuzumab in vitro. Đánh giá tác dụng kháng ung thư của virus vaccine sởi phối hợp với Nimotuzumab trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư đầu cổ (in vivo).

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO                   BỘ QUỐC PHỊNG HỌC VIỆN QN Y NGƠ THU HẰNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ  ĐẦU CỔ CỦA VIRUS VACCINE SỞI PHỐI HỢP  VỚI NIMOTUZUMAB TRÊN THỰC NGHIỆM Chun ngành : Khoa học y sinh Mã số : 9720101 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI ­ 2020 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QN Y Hướng dẫn khoa học: GS. TS. NGUYỄN LĨNH TỒN PGS.TS. HỒ ANH SƠN Phản biện 1: GS. TS. VĂN ĐÌNH HOA Phản biện 2: PGS. TS. TRỊNH TUẤN DŨNG Phản biện 3: PGS. TS. PHẠM TUẤN CẢNH Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp  trường họp tại Học viện Qn y vào hồi    giờ     ngày    tháng  năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại: ­ Thư viện Quốc gia ­ Thư viện Học viện Qn y ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh ung thư  là một vấn đề  sức khỏe lớn, ngày càng được  quan tâm ở tất cả các nước trên thế giới. Ung thư đầu cổ (UTĐC)   là khối u ác tính phát triển trong khu vực này của cơ  thể, 90%  UTĐC có mơ bệnh học là ung thư  biểu mơ tế  bào vảy. Trên thế  giới, UTĐC đứng hàng thứ 7 với 4,8% tổng số các ca ung thư mới   chẩn đốn. Trị  liệu bằng virus ly giải tế  bào (Oncolytic virus – OLV) dựa trên cơ chế chính là các OLV có khả năng xâm nhập và  nhân lên đặc hiệu trong các tế  bào ung thư của khối u gây ly giải  tế  bào, kích thích các tế  bào ung thư  chết theo chương trình, kích  thích đáp ứng miễn dịch chống ung thư Nimotuzumab là kháng thể đơn dịng hướng đích là thụ thể tăng   trưởng biểu bì (EGFR) có tác dụng chống tăng sinh mạch, kìm hãm   tăng   sinh   tế   bào,   cảm   ứng   tế   bào   chết   theo   chương   trình  (apoptosis), làm tế bào tăng nhạy cảm với xạ trị và hóa trị liệu Chúng tơi tiến hành đề  tài “Nghiên cứu tác dụng kháng ung   thư  đầu cổ  của virus vaccine sởi phối hợp với Nimotuzumab   trên thực nghiệm” nhằm 2 mục tiêu: Đánh giá tác dụng kháng ung thư  của virus vaccine sởi   phối hợp với Nimotuzumab in vitro Đánh giá tác dụng kháng ung thư  của virus vaccine sởi   phối hợp với Nimotuzumab trên mơ hình chuột thiếu hụt   miễn dịch mang khối ung thư đầu cổ (in vivo)  Tính cấp thiết: Nghiên cứu tác dụng kháng UTĐC người của virus vaccine sởi  (MeV) phối hợp Nimotuzumab cả in vitro và trên mơ hình cấy ghép  trên chuột thiếu hụt miễn dịch, làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp  theo về  cơ  chế  tác dụng phối hợp MeV và Nimotuzumab kháng u,  tiến   tới     thử   nghiệm   lâm   sàng   sử   dụng   phối   hợp   MeV     Nimotuzumab điều trị  bệnh nhân ung thư  nói chung và UTĐC nói   riêng.   Đóng góp mới của luận án:  Luận án là nghiên cứu đầu tiên đánh giá tác dụng kháng ung thư  đầu   cổ   người   dòng   tế   bào   Hep2     phối   hợp   MeV   và  Nimotuzumab    in  vitro         mơ   hình   cấy   ghép     chuột thiếu hụt miễn dịch. Từ  đó làm cơ  sở  cho các nghiên cứu   tiếp theo tiến tới các thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư  Bố cục luận án:  Luận án có 150 trang, bao gồm: Đặt vấn đề (2 trang), Chương   1: Tổng quan (36 trang), Chương 2: Đối tượng và phương pháp  nghiên cứu (27 trang), Chương 3: Kết quả  (47 trang), Chương 4:   Bàn luận (35 trang), Kết luận (2 trang), Kiến nghị (1 trang) Luận án có 175 tài liệu tham khảo (tiếng Anh: 171) CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về ung thư đầu cổ Ung thư đầu cổ (UTĐC) là những khối u ác tính phát sinh trong  vùng đầu cổ  như: ung thư  khoang miệng, mũi, xoang cạnh mũi,  lưỡi, họng, tuyến nước bọt và thanh quản.  Tỉ lệ mắc UTĐC ngày càng gia tăng cả ở Việt Nam và trên một  số  khu vực thế  giới. Đây là một bệnh ác tính có tiên lượng xấu,   nguy hiểm và có nhiều biến chứng lớn. Các yếu tố nguy cơ chính   liên quan đến UTĐC bao gồm sử dụng thuốc lá, uống rượu, nhiễm  HPV ­ đối với ung thư họng miệng, nhiễm EBV­ đối với ung thư  vịm họng.  Các gen gây ung thư trong HNSCC thường liên quan đến 4 con  đường chức năng chính: tăng sinh tế bào, sự biệt hóa biểu mơ vảy,   sự tồn tại của tế bào và xâm lấn/di căn 1.2. Liệu pháp hướng đích thụ thể yếu tố phát triển biểu bì  1.2.1. Vai trị của EGFR trong ung thư biểu mơ vảy đầu cổ Thụ  thể  yếu tố  tăng trưởng biểu bì (Epidermal growth factor   receptor ­ EGFR) có trọng lượng phân tử 170 kiloDaltons (kDa) Khi yếu tố  tăng trưởng biểu mơ  (EGF)  liên kết vào thụ  thể  (EGFR), hai phân tử EGFR kết hợp với nhau (dimer hóa)  từ  đó tự  phosphoryl hóa vùng tyrosine kinase  gây hoạt hố các tyrosin đặc  hiệu và các protein tín hiệu nội bào phụ  thuộc thụ  thể  EGFR gây  phiên mã các gen đích thúc đẩy q trình tăng sinh tế bào, sống sót (ức   chế chết tế bào theo chương trình ­ apoptosis), xâm lấn và di căn tế  bào EGFR đặc biệt quan trọng trong bệnh sinh của ung thư biểu mơ  tế bào vảy đầu cổ  (HNSCC). Sự biểu hiện của EGFR  gặp   92%  trong các khối HNSCC. Hơn nữa, sự biểu hiện của EGFR tăng cao  trong các khối u trong giai đoạn tiến triển hoặc trong các khối u kém   biệt hóa 1.2.2. Nimotuzumab trong điều trị ung thư đầu cổ Nimotuzumab là một kháng thể đơn dịng có khả năng gắn kết đặc  hiệu với EGFR, ngăn chặn kích hoạt thụ thể. Nó nhận ra miền ngoại   bào của EGFR và cạnh tranh vị trí gắn của yếu tố tăng trưởng biểu bì   (EGF), ngăn ngừa EGF liên kết và kích hoạt EGFR tiếp theo, ức chế  hoạt tính của tyrosin kinase, do đó ức chế sự tăng trưởng của các tế  bào khối u.  Ngồi ra để đáp ứng với EGFR bị phong tỏa bởi Nimotuzumab,   các tế bào khối u giảm khả năng tiết ra các yếu tố tăng sinh mạch   máu,  như  yếu tố  tăng trưởng nội mơ mạch máu (VEGF), dẫn đến  giảm sự hình thành mạch máu và tăng số lượng tế bào apotosis.  Nimotuzumab (Cimaher)  được chứng minh có hiệu quả  trong  điều trị  HNSCC tiến triển khơng phẫu thuật được. Nimotuzumab   được chứng minh là an tồn và ít biến chứng nặng 1.3. Virus vaccine Sởi (MeV) trong liệu pháp virus điều trị  ung  thư 1.3.1. Virus sởi Virus sởi là virus có đường kính khoảng 100­300 nm, với một   lõi   RNA   sợi   đơn   (­),  thuộc   chi  Morbillivirus    họ  Paramyxoviruses,     bao   quanh       capsid   xoắn   Các  glycoprotein   vỏ   bọc     MeV     protein   hemagglutinin   (H)   và  fusion (F) làm trung gian cho sự gắn và sự hòa hợp của virus với tế  bào Trong   liệu   pháp   OLV     nay,   sử   dụng     chủng   vaccine   MeV thuộc các dịng Edmonston bao gồm một số chủng biến đổi   thích nghi trong thí nghiệm, liên quan chặt chẽ nguồn gốc từ một   chủng   lâm   sàng   lấy   từ   họng       em   bé   có   tên     David   Edmonston   (năm   1954)     cấy   truyền       tế   bào   khác  nhau, tạo ra chủng MeV giảm độc lực hơn và không gây bệnh 1.3.2. Thụ thể của MeV MeV sử  dụng ba thụ  cảm thể  là CD46, CD150 và nectin­4 để  xâm nhập vào tế  bào đích, trong đó quan trọng nhất là thụ  thể  CD46.  CD46  là một glycoprotein xun màng type  1  biểu hiện phổ  biến   tất cả  các tế  bào có nhân. Thụ  thể  CD46 được tìm thấy  biểu hiện   mức cao   các tế  bào ung thư   Ở  các tế  bào bình  thường  có   biểu     CD46   thấp,   MeV   có   khả   năng  lây   nhiễm  nhưng sự hình thành hợp bào là khơng đáng kể.  Ở  các tế  bào ung   thư  có biểu hiện thụ  thể  CD46 cao,   nhiễm  MeV dẫn đến phản  ứng hợp bào mạnh mẽ: MeV gắn với thụ  thể  xâm nhập vào tế  bào, tăng sinh trong tế bào, hình thành hợp bào và tiêu diệt tế  bào  qua trung gian CD46 tăng lên rõ rệt.  1.3.3. Tính an tồn của vaccine sởi giảm độc lực MeV đáp  ứng đầy đủ  tiêu chuẩn của một  OLV lý tưởng phải  có được tính lựa chọn các khối u cao, khơng gây bệnh cho các mơ   lành cơ  thể,  ổn định về  mặt di truyền và khơng có nguy cơ  gây  bệnh cho cộng đồng 1.3.4. Các cơ chế gây ly giải tế bào ung thư 1.3.4.1. MeV trực tiếp giết chết tế bào u qua hình thành hợp bào  Sự hợp nhất giữa tế bào nhiễm virus và tế bào bình thường lân  cận tạo thành hợp bào. Một tế bào bị nhiễm virus có thể hợp nhất  50­100 tế bào lân cận với nhau tạo thành một hợp bào. Đây là một   cơ chế lây lan virus mà khơng cần giải phóng các hạt virus trưởng   thành ra khỏi tế bào. Q trình hợp nhất tế bào làm cho virus giảm   tiếp xúc với kháng thể  trung hịa của cơ  thể  vật chủ, virus tránh  được sự kiểm sốt của hệ miễn dịch.  1.3.4.2. Ly giải tế  bào u qua trung gian kích thích miễn dịch đặc   hiệu kháng u MeV tạo ra 2 loại tín hiệu nguy hiểm là tín hiệu nguy hiểm nội   sinh (DAMP), các tín hiệu nguy hiểm ngoại sinh (PAMP), chúng  kích hoạt đáp ứng miễn dịch đặc hiệu góp phần quan trọng ly giải   tế bào u như: sản xuất IFN, các cytokine, hoạt hóa tế bào NK, đại   thực bào, tế bào DC, tế bào lympho T.  1.4. Sử dụng phối hợp virus vaccine sởi và kháng thể đơn dịng   Nimotuzumab trong điều trị ung thư Có 2 thử nghiệm sử  dụng MeV có khả  năng nhắm mục tiêu là   EGFR để xâm nhập và ly giải tế bào ung thư nguyên bào thần kinh      thử   nghiệm   với   đối   tượng     tế   bào   HNSCC   Cả     thử  nghiệm đều cho thấy khả năng ức chế và gây chết tế  bào ung thư    MeV   nhắm   mục   tiêu   EGFR      in   vitro   in   vivo.  Nimotuzumab là kháng thể đơn dòng ức chế EGFR đã được chứng  minh  có hiệu quả   trong  điều trị   HNSCC  Từ   những cơ   sở  trên,  chúng     tiến   hành   phối   hợp   MeV   với   kháng   thể   đơn   dịng  Nimotuzumab nhằm mục đích cộng hợp tác dụng điều trị  ung thư  theo cơ  chế  của hai liệu pháp trên để  có thể  đem lại hiệu quả  tốt   trong điều trị HNSCC in vitro và in vivo CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Động vật: Chuột nhắt thiếu hụt miễn dịch  chủng BALB/c,  6 ­ 8 tuần tuổi, trọng lượng từ 18­22g, đủ tiêu chuẩn thí nghiệm 2.1.2. Vaccine sởi (MeV): virus vaccine sởi chủng Edmonton 2.1.3. Các dịng tế bào: Tế bào ung thư biểu mơ vảy đầu cổ người  dịng Hep2, tế bào thận khỉ (tế bào Vero)  2.1.4. Kháng thể đơn dịng Nimotuzumab:chế phẩm CIMAher 2.1.5. Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 2.1.5.1. Thiết bị sử dụng:  Thước  kẹp  NSK 150mm, cân điện tử  TE3102S Sartorius,  phịng  sạch ni chuột, phịng ni cấy tế bào, máy li tâm, máy đo mật độ  quang, máy realtime PCR, máy flow cytometry, pipet các kích cỡ khác  2.1.5.2. Các dụng cụ  thí nghiệm tiêu hao: Phiến 6, 96 giếng, đầu  cơn, các đĩa ni cấy, lọc vi khuẩn, ống falcon, eppendorf  2.1.5.3. Hóa chất:  Môi   trường   nuôi   cấy   tế   bào   M199,  EMEM,  bộ   kít   làm   thử  nghiệm MTT, Annexin V/PI  Fluorescein isothiocyanate; bộ kít tách  RNA, chuyển cDNA, primers, master Mix, cồn 70, 900 2.2. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu  được  tiến hành theo  phương  pháp  thực  nghiệm,  tiến cứu, chọn thời điểm so sánh đánh giá trước, trong và sau điều  trị.  2.2.1. Đánh giá khả  năng  ức chế  tế  bào và chết theo chương   trình của virus vaccine sởi phối hợp Nimotuzumab trên dịng tế   bào ung thư đầu cổ người Hep2 2.2.1.1. Các chỉ tiêu đánh giá ­ Xác   định   nồng   độ   virus     phương   pháp   chuẩn   độ  CCID50 ­ Đánh giá khả  năng  ức chế  tế  bào Hep2 bằng thử  nghiệm   MTT ­ Đánh giá tỉ  lệ  tế  bào chết theo chương trình và hoại tử  bằng phương pháp flow cytometry 13 3.1.5   Đánh   giá   tỷ   lệ   tế   bào   chết   theo   chương   trình   (chết   apoptosis) 3.1.5.1. Hình thái tế bào chết apoptosis dưới kính hiển vi thường Hình 3.11.  Hình thái tế  bào chết apoptosis dưới kính hiển vi  thường: 24 giờ sau điều trị bằng virus đã thấy tế bào có xu hướng   co nhỏ lại. 48, 72 giờ, tế bào Hep2 có những hình ảnh nhiễm virus  rõ: co trịn lại, tế bào hịa màng tạo thành những hợp bào. 96 giờ tế  bào bong ra, có nhiều tế bào hoại tử và nổi trên bề mặt mơi trường   ni cấy.  3.1.5.2. Đánh giá tế  bào chết apoptosis và hoại tử  bằng phương   pháp flow cytometry  Hình 3.12. Ở cả 3 thời điểm 48, 72 và 96 giờ, tỷ lệ tế bào chết   nhóm chứng thấp hơn   3 nhóm điều trị, tỷ  lệ  tế  bào chết  ở  nhóm phối hợp MeV+Nimotuzumab cao hơn nhóm điều trị  đơn. (p  nhóm phối hợp ­ nhóm chứng: p