Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ

Mục đích của luận án nhằm nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp M/GP5/GP5ectoM của chủng virus PRRS (PRRSV) đang gây bệnh lợn tai xanh ở Việt Nam bằng công nghệ biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá phục vụ cho định hướng phát triển vaccine thế hệ mới.

i VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HẰNG  NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M,  GP5, GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI  LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY  THUỐC LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC  NHỜ AGROBACTERIUM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC i ii HÀ NỘI – 2018  ii iii VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HẰNG  NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M,  GP5, GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI  LOẠN SINH SẢN VÀ HƠ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY  THUỐC LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC  NHỜ AGROBACTERIUM Chun ngành: Hố sinh học Mã số: 94 20 116 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học:   1. TS. Nguyễn Trung Nam  Viện Cơng nghệ sinh học 2. PGS. TS. Chu Hồng Hà Viện Cơng nghệ sinh học iii iv HÀ NỘI – 2018  iv v LỜI CẢM ƠN Luận án được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ gen,  Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Phòng thử nghiệm sinh học, Viện Cơng nghệ  sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Cơng nghệ  Việt Nam và Trung tâm Chẩn  đốn Thú y Trung ương. Với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài thuộc nhiệm vụ nghiên   cứu thường xun của Phòng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ gen, Viện Cơng  nghệ sinh học.  Trong suốt q trình học tập, nghiên cứu và hồn thành luận án, tơi ln   nhận được sự giúp đỡ của tập thể cán bộ  hướng dẫn, các thầy cơ giáo, các nhà  khoa học, các anh chị  em đồng nghiệp và q cơ  quan, phòng ban. Tơi xin chân  thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, Bộ phận đào tạo sau đại học, các phòng chức năng   của Viện Cơng nghệ  sinh học đã tạo điều kiện cho tơi học tập và hồn thành  luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai thầy, PGS.TS. Chu Hồng Hà và  TS. Nguyễn Trung Nam đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, tạo mọi   điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tơi trong suốt thời gian thực hiện và hồn thành luận   án Tơi xin chân thành cảm  ơn GS.TS. Lê Trần Bình, PGS.TS. Phạm Bích  Ngọc, PGS.TS. Đinh Duy Kháng, PGS.TS. Tơ Long Thành, TS. Nguyễn Tường  Vân, ThS. Hồ Thị Thương và tập thể cán bộ  Phòng Cơng nghệ  tế  bào thực vật,  Phòng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ  gen đã ln giúp đỡ, chia sẻ  những  kiến thức q báu và tạo những điều kiện tốt nhất cho tơi trong suốt q trình  thực hiện luận án Tơi xin chân thành cảm  ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Lâm nghiệp,   Ban Lãnh đạo, cùng tồn thể cán bộ  của Viện Cơng nghệ  sinh học Lâm nghiệp   đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để cho tơi n tâm học tập và thực hiện luận án Cuối cùng, tơi xin cảm  ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã ln   động viên, giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện luận án này        Hà Nội, ngày    tháng    năm 2018 v vi Nghiên cứu sinh                                                                                         Nguyễn Thị Minh Hằng vi i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: Đây là cơng trình nghiên cứu của tơi dưới sự  hướng dẫn khoa học của  PGS.TS. Chu Hồng Hà, TS. Nguyễn Trung Nam và một số  kết quả  cùng cộng   tác với các cộng sự khác Các số  liệu và kết quả  trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã  được cơng bố trên các tạp chí khoa học chun ngành với sự đồng ý và cho phép  của các đồng tác giả Phần kết quả còn lại của luận án chưa được ai cơng bố  trong bất kỳ  cơng  trình nào khác.  Hà Nội, ngày    tháng    năm 2018               Tác giả Nguyễn Thị Minh Hằng i ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH   MỞ ĐẦU    1     Chương 1   6   TỔNG QUAN TÀI LIỆU                                                                                                      6  Chương 2   43   VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU                                                            43  Chương 3   61   KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU                                                                                                   61  Chương 4   108   BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU                                                                           108  KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ                                                                                            132  NHỮNG CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN                            132  TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH                                                                    133  TÀI LIỆU THAM KHẢO                                                                                                  140 ii iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AS aa 2b CMV Acetosyringone Amino acid  (axit amin) Cucumber mosaic virus (CMV) 2b protein (Protein 2b của virus  bp BSA CaMV Cs DNA ER ELISA ELP et al Fc GFP GP5 GP5ecto HC­Pro HP­PRRSV khảm dưa chuột) Base pair (Cặp base) Bovine serum albumin Cauliflower mosaic virus (Virus khảm súp lơ) Cộng sự Deoxyribonucleic acid Endoplasmic reticulum (Lưới nội chất) Enzyme linked immunosorbent assay Elastin­like polypeptide And co­workers  (và các cộng sự) Fragment crystallizable Green fluorescent protein (Protein huỳnh quang xanh) Glycoprotein 5 Ectodomain of glycoprotein (Vùng ngoại bào của protein GP5) Helper component protease (Protein hỗ trợ) Highly pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrome  virus (Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp thể độc  HRP IPMA lực cao) Horseradish peroxidase Immunoperoxidase monolayer assay (Xét nghiệm miễn dịch đơn  IgG kb kDa LB  lớp cộng hợp enzyme peroxidase) Immunoglobulin G Kilobase Kilodalton Luria­Bertani (Môi trường nuôi khuẩn Luria­Bertani)  iii iv LV M MES mg MLV Lelystad virus Matrix/ Membrance protein 2­(N­ Morpholino)ethanesulfonic acid Milligram Modified­live virus (Virus sống đã làm biến đổi = virus nhược  mITC độc) Membrane­based  Inverse transition cycling (Chu trình chuyển pha  nptII nghịch đảo qua màng) Gene mã hố  Neomycin phosphotransferase (Gen kháng  Nos nsp OD kanamycin) Nopaline synthase terminator Non­structural protein Optical density (Mật độ quang) ORF Open reading frame (Khung đọc mở) PBS Phosphate­buffered saline PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Fc Stabilizing domain ­ "Fragment of crystallizable chain of IgG"  PRRSV (Vùng hằng định của kháng thể IgG) Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus (Virus gây  RNA hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn) Ribonucleic acid ScFv Single chain variable fragment SDS­PAGE Sodium dodecyl sulphate­polyacrylamide gel electrophoresis TSP Total soluble protein (Protein tổng hợp) 35S Ter 35S Terminator (Trình tự kết thúc phiên mã) VLP Virus­like particle WT Wild type (Cây khơng chuyển gen) DANH MỤC BẢNG iv 153 population of growing pigs. Vaccine 30(2): 407­413 110 Liu   K   (2015)   Purification   of   recombinant   proteins   in   plants   using   small­  molecule   dependent   inteins   fused   to   ELP   or   HFBI   Electronic   thesis   and  Dissertation Repository. Pp: 3048 111 Lomonossoff GP and D'Aoust MA (2016) Plant­produced biopharmaceuticals:  A   case   of   technical   developments   driving   clinical   deployment  Science  353(6305): 1237­ 1240 112 Lunney   JK,   Fang   Y,   Ladinig   A,   Chen   N,   Li   Y,   Rowland   B   et   al   (2016)  Porcine   reproductive   and   respiratory   syndrome   virus   (PRRSV):   pathogenesis  and interaction with the immune system. Annu Rev Anim Biosci 4: 129–154 113 Magnuson NS, Linzmaier PM, Gao JW, Reeves R, An G and Lee JM (1996)  Enhanced recovery of a secreted mammalian protein from suspension culture of  genetically modified tobacco cells.Protein Expr Purif  7(2): 220­228 114 Mark   Mogler   (2012)   Evaluation   of   replicon   particle   vaccines   for   porcine  reproductive   and   respiratory   syndrome   virus  Graduate     theses   and   Dissertations. 12841. http://lib.dr.iastate.edu/etd/12841 115 Marsian J and Lomonossoff GP (2016) Molecular pharming ­ VLPs made in  plants. Curr Opin Biotechnol 37: 201­206 116 Mateu E and Diaz I (2007) The challenge of PRRS immunology  Vet. J. Vet  Sep;177(3): 345­351 117 Meng   XJ   (2000)   Heterogenity   of   porcine   reproductive   and   respiratory  syndrome   virus:   implications   for   current   vaccine   efficacy   and   future   vaccine  development. Veterinary Microbiology, Vol.74: 309 ­ 329.  118 Meng XJ, Paul PS, Halbur PG, and Lum MA (1996) Characterization of a  high­virulence   US   isolate   of   porcine   reproductive   and   respiratory   syndrome  virus in a continuous cell line, ATCC CRL11171  J. Vet. Diagn. Invest. (8):  374–381 119 Mengeling WL, Lager KM, and Vorwald AC (1998) Clinical consequences of  154 exposing   pregnant   gilts   to   strains   of   porcine   reproductive   and   respiratory  syndrome (PRRS) virus isolated from field cases of ”atypical” PRRS  Am. J.  Vet. Res. 59: 1540–1544 120 Mersereau   M,   Pazour   GJ,   Das   A   (1990)   Efficient   transformation   of  Agrobacterium tumefaciens by electroporation. J Gene 90 (1): 149­51 121 Mett   V,   Musiychuk   KBiH, Farrance CE,   Horsey A, Ugulava N, Shoji Y,  Rosa P, Palmer GA, Rabindran S, Streatfield SJ, Boyers A, Russell M, Mann A,  Lambkin   R,   Oxford   JS,   Schild   GC,   Yusibov   V   (2008)   A   plant­produced  influenza   subunit   vaccine   protects  ferrets against virus challenge  Influenza   Other Respi. Viruses 2: 33­40 122 Mett V, Farrance CE, Green BJ and Yusibov V (2008) Plants as biofactories.  Biologicals 36(6): 354­358 123 Metwally S, Mohamed F, Faaberg K, Burrage T, Prarat M, Moran K, Bracht  A, Mayr G, Berninger M, Koster L, To TL, Nguyen VL, Reising M, Landgraf J,  Cox   L,   Lubroth   J,   Carrillo   C   (2010)   Pathogenicity   and   molecular  characterization   of   emerging   porcine   reproductive   and   respiratory   syndrome  virus in Vietnam in 2007. Transbound Emerg Dis. 57(5): 315­29 124 Meulenberg JJM, van Nieuwstadt AP, van Essen­Zandbergen A, et al., (1997)  Posttranslational processing and identification of a neutralization domain of the  GP4 protein encoded by ORF4 of Lelystad virus. J Virol  71(8): 6061–6067 125 Meyer   DE   and   Chilkoti   A   (1999)   Purification   of   recombinant   proteins   by  fusion   with   thermally­responsive   polypeptides  Nat   Biotechnol  17(11):   1112­ 1115 126  Meyer DE and Chilkoti A (2002a) Genetically encoded synthesis of protein­ based   polymers   with   precisely   specified   molecular   weight   and   sequence   by  recursive   directional   ligation:   Examples   from   the   elastin­like   polypeptide  system. Biomacromolecules 3(2): 357–367 127   Meyer   DE   and   Chilkoti   A   (2002b)   18:   Protein   purification   by   inverse  155 transition   cycling   Golemis   E   and   Adams   PD   (Eds.),   Protein­protein  interactions:  A   molecular   cloning   manual   Long   Island:   Cold   Spring   Harbor  Laboratory Press. pp: 329­344 128 Meyer DE, Trabbic­Carlson K and Chilkoti A (2001) Protein purification by  fusion  with  an  environmentally   responsive   elastin­like   polypeptide:  Effect   of  polypeptide length on the purification of thioredoxin  Biotechnol Prog. 17(4):  720–728 129 Moloney MM and Holbrook LA (1997) Subcellular targeting and purification  of recombinant proteins in plant production systems. Biotechnol Genet Eng Rev.  14: 321­336 130 Morgan SB, Frossard JP, Pallares FJ, Gough J, Stadejek T, Graham SP et al.,  (2014) Pathology and virus distribution in the lung and lymphoid tissues of pigs  experimentally   inoculated   with   three   distinct   type     PRRS   virus   isolates   of  varying pathogenicity. Transbound. Emerg. Dis. 63(3): 285–295 131 Music N, Gagnon CA (2010) The role of porcine reproductive and respiratory  syndrome   (PRRS)   virus   structural   and   non­structural   proteins   in   virus  pathogenesis. Anim. Health. Res. Rev. 11(2): 135­163 132 Nam HM, Chae KS, Song YJ, Lee NH, Lee JB, Park SY, Song CS, Seo KH,  Kang SM, Kim MC and others (2013) Immune responses in mice vaccinated  with   virus­like   particles   composed   of   the   GP5   and   M   proteins   of   porcine  reproductive and respiratory syndrome virus. Arch Virol 158(6): 1275­1285 133 Nan Y, Wu C, Gu G, Sun W, Zhang YJ, Zhou EM (2017) Improved Vaccine  against PRRSV: Current Progress and Future Perspective. Front. Microbiol 134 Nauwynck HJ et al., (2012) Micro­Dissecting the Pathogenesis and Immune  Response   of   PRRSV   Infection   Paves   the   Way   for   More   Efficient   PRRSV  Vaccines.Transbound. Emerg. Dis. 59(1): 50­54.  135 Nelson EA, Christopher­Hennings J and Benfield DA (1994) Serum immune  responses   to   the   proteins   of   porcine   reproductive   and   respiratory   syndrome  156 (PRRS) virus. J. Vet. Diagn. Invest 6(4): 410 – 415 136 Neumann  EJ   et  al.,   (2005)   Assessment   of  the   economic   impact  of   porcine  reproductive   and   respiratory   syndrome   on   swine   production   in   the   United  States.J Am Vet Med Assoc. 227(3): 385­392.  137 Nguyên Thi Minh Hăng, Hô Thi Th ̃ ̣ ̀ ̀ ̣ ương, Nguyên Thu Giang, Pham Bich ̃ ̣ ́   Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha (2016). Đánh giá s ̣ ̃ ̀ ̀ ự biểu hiện tạm  thời   kháng   nguyên   GP5   tái   tổ   hợp     virus   PRRS     mô     thuốc     Nicotinana tabacum. Hội nghị Cơng nghệ  sinh học tồn quốc lần thứ IV, khu   vực phía nam, 2016: “Ứng dụng Cơng nghệ sinh học vào thực tiễn”; P1­14:57 138 Ngun Thi Minh Hăng, Hơ Thi Th ̃ ̣ ̀ ̀ ̣ ương, Pham Bich Ngoc, Nguyên Trung ̣ ́ ̣ ̃   Nam, Chu Hoang Ha ( ̀ ̀ 2018). Xác định khả năng kích thích tạo kháng thể  đặc  hiệu của kháng ngun tái tổ hợp GP5­ELP của virus PRRS gây hội chứng rối  loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn trên động vật thí nghiệm. Tạp chí Khoa học kỹ  thuật thú y 25(5): 35­42 139 Nielsen HS, Liu G, Nielsen J, Oleksiewicz, Botner A, Storgaard T, Faaberg  KS (2003) Generation of an Infectious Clone of VR­2332, a Highly Virulent  North   American­Type   Isolate   of   Porcine   Reproductive   and   Respiratory  Syndrome Virus. J Virol  77(6): 3702–3711 140 Nilubol D, Platt KB, Halbur PG, Torremorell M, Harris DL (2004) The effect  of   a   killed   porcine   reproductive   and   respiratory   syndrome   virus   (PRRSV)  vaccine treatment on virus shedding in previously PRRSV infected pigs  Vet  Microbiol 102(1­2): 11–18 141 Oleksiewicz   MB,   Bøtner   A,   Toft   P,   Normann   P,   and   Storgaard   T   (2001)  Epitope   Mapping   Porcine   Reproductive   and   Respiratory   Syndrome   Virus   by  Phage   Display:   the   nsp2   Fragment   of   the   Replicase   Polyprotein   Contains   a  Cluster of B­Cell Epitopes. Journal of Virology  75(7): 3277–3290 142 Oleksiewicz   MB,   Botner,   Normann   P   (2002)   Porcine   B­cells   recognize  epitopes that are conserved between the structural proteins of American­ and  157 European­type   porcine   reproductive   and   respiratory   syndrome   virus  J   Gen  Virol 83(6): 1407­1418.  143 Opriessnig T, Halbur PG, Yoon KY, Pogranichniy RM, Harmon KM, Evans R  et   al.,   (2002)   Comparison   of   molecular   and   biological   characteristics   of   a  modified   live   porcine   reproductive   and   respiratory   syndrome   virus   (PRRSV)  vaccine   (ingelvac   PRRS   MLV),   the   parent   strain   of   the   vaccine   (ATCC  VR2332),  ATCC  VR2385,  and  two  recent field  isolates  of PRRSV  J  Virol.  76(23): 11837­11844 144 Ostrowski M, Galeota JA, Jar AM, Platt KB, Osorio FA, Lopez OJ (2002)  Identification   of   neutralizing   and   nonneutralizing   epitopes   in   the   porcine  reproductive and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain  J. Virol.  76(9):  4241–4250 145   Park   SI,   Seo   JY   and   Kim   TJ   (2016)   Heterologous   expression   of   porcine  reproductive   and   respiratory   syndrome   virus   glycoprotein     in   Bordetella  bronchiseptica aroA mutant. J Vet Med Sci. 78(10): 1625­1629 146 Patel   J,   Zhu   H,   Menassa   R,   Gyenis   L,   Richman   A   and   Brandle   J   (2007)  Elastin­like   polypeptide   fusions   enhance   the   accumulation   of   recombinant  proteins in tobacco leaves. Transgenic Res. 16(2): 239–249 147 Peyret H,   Lomonossoff GP (2013) The  pEAQ vector series: the  easy and  quick way to produce recombinant proteins in plants. Plant Mol Biol  Volume  83(1­2): 51–58 148 Phan HT (2012) ELPylated avian flu vaccines from plants: Improvement of  expression and development of a new purification strategy. Ph.D Dissertation,  IPK, Gatersleben, Germany.  149 Phan HT, Pohl J, Floss DM et al., (2013) ELPylated haemagglutinins produced  in   tobacco   plants   induce   potentially   neutralizing   antibodies   against   H5N1  viruses   in   mice   Journal   Article,   Research   Support,   Non­U.S   Gov't,  Plant  Biotechnol J. 11(5): 582­593 158 150 Piron R, Koker SD, Paepe AD, Goossens J, Johan Grooten, Nauwynck Hans,  Depicker Ann (2014) Boosting In Planta Production of Antigens Derived from  the   Porcine   Reproductive   and   Respiratory   Syndrome   Virus   (PRRSV)   and  Subsequent   Evaluation   of  Their   Immunogenicity  A   PRRSV   Subunit   Vaccine   Produced In Planta Seeds 9(3): 1­16 151 Pirzadeh B, Dea S (1998) Immune response in pigs vaccinated with plasmid  DNA encoding ORF5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J   Gen Virol. 79(5): 989­999 152 Plagemann PG (2004a) GP5 ectodomain epitope of porcine reproductive and  respiratory syndrome virus, strain Lelystad virus. Virus Res. 102(2): 225­230 153 Plagemann PG, Rowland RR, Faaberg KS (2002) The primary neutralization  epitope of porcine respiratory and reproductive syndrome virus strain VR­2332  is located in the middle of the GP5 ectodomain. Arch Virol. 147(12): 2327­2347 154 Plagemann   PG(2004b)   The   primary   GP5   neutralization   epitope   of   North  American isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Vet.  Immunol. Immunopathol. 102(3): 263­ 275 155 Plana Duran J, Climent I, Sarraseca J, Urniza A, Cortes E, Casal JL (1997)  Baculovirus   expression   of   proteins   of   porcine   reproductive   and   respiratory  syndrome   virus   strain   Olot/91   Involvement   of   ORF3   and   ORF5   proteins   in  protection. Virus Gene. 14(1): 19­29 156 Potera   C   (2012)   Vaccine   manufacturing   gets   boost   from   tobacco   plants:  Canada­Based  Medicago   opens   U.S   facility   to   exploit   its   Influenza   Vaccine  production method. Genetic Engineering and Biotechnology News. 32(6): 8–10 157 Prieto C, Martinez­Lobo FJ, Diez­Fuertes F, Aguilar­Calvo P, Simarro I and ́ ́   Castro JM (2011) Immunisation of pigs with a major envelope protein sub­unit  vaccine against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)  results   in   enhanced   clinical   disease   following   experimental   challenge  Vet   J  189(3): 323­329 159 158 Provost   C,   Jia   JJ,   Music   N,Levesque   C,   Lebel   ME,   del  Castillo   JR   et  al.,  (2012) Identification of a new cell line permissive to porcine reproductive and  respiratory   syndrome   virus   infection   and   replication   which   is   phenotypically  distinct from MARC­145 cell line. Research open access. J Virology  9: 267 159 Qiang   C   (2011)   Transgenic   Horticultural   Crops:   Challenges,   and  Opportunities­Essays   by   Experts   Boca   Raton:   Taylor   &   Francis,   USA;  Expression   and   manufacture   of   pharmaceutical   proteins   in   genetically  engineered horticultural plants.  160 Qiu   HJ,   Tian   ZJ,   Tong   GZ,   Zhou   YJ,   Ni   JQ,   Luo   YZ,   Cai   XH   (2005)  Protective immunity induced by a recombinant pseudorabies virus expressing  the GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in piglets. Vet.  Immunol. Immunopathol. 106(3­4): 309–319 161 Renukaradhya  GJ,   Meng  XJ,  Calvert  JG,   Roof  M,  and Lager  KM   (2015a)  Inactivated and subunit vaccines against porcine reproductive and respiratory  syndrome: current status and future direction. Vaccine 33(27): 3065–3072 162 Rivera   AL,   Gomez­Lim ́   M,   Fernandez ́   F,   Loske   AM   (2012)   Physical   methods for genetic plant transformation. Phys Life Rev. 9(3): 308–345 163 Rossow KD (1998) Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome. J. Vet.  Pathol. 35(1): 1–20 164 Rowland   RR   (2010)   The     interaction     between     PRRSV     and     the     late  gestation pig fetus. Virus Res. 154(1­2): 114­122 165 Rybicki EP (2014) Plant­based vaccines against viruses. J. Virol. 11(1): 205­ 224 166 Salazar­Gonzalez JA, Banuelos­Hernandez B and Rosales­Mendoza S (2015)  Current status of viral expression systems in plants and perspectives for oral  vaccines development. Plant Mol Biol 87(3): 203­217 167 Sambrook J, Green MR (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual,  4th edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Volume 1.   160 168 Santi   L,   Batchelor   L,   Huang   Z,   Hjelm   B,   Kilbourne   J,   et   al.,   (2008)   An  efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk  virus­like particles. Vaccine 26(15): 1846­1854 169 Scheller J, Henggeler D, Viviani A and Conrad U (2004) Purification of spider  silk­elastin   from   transgenic   plants   and   application   for   human   chondrocyte  proliferation. Transgenic Res. 13(1): 51–57 170 Scheller   J,   Leps   M,   and   Conrad   U   (2006)   Forcing   single­chain   variable  fragment production in tobacco seeds by fusion to elastin­like polypeptids. Plant   Biotechnology Journal 4(2): 243­249 171 Seternes T, Tonheim TC, Myhr AI and Dalmo RA (2016) A plant 35S CaMV  promoter induces long­term expression of luciferase in Atlantic salmon. Sci Rep  6: 25096 172 Shen G, Jin N, Ma M, et al., (2007) Immune responses of pigs inoculated with  a   recombinant     fowlpox     virus     coexpressing     GP5/GP3     of     por­cine  reproductive and respiratory syndrome virus and swine IL­18  Vaccine  25(21):  4193­4202 173 Shen WX, Au PCK, Shi BJ, Smith NA, Dennis ES, Guo HS, Zhou CY and  WangMB   (2015)   Satellite   RNAs   interfere   with   the   function   of   viral   RNA  silencing suppressors. Front. Plant Sci. 6: 1­12 174 Shi   M   et   al.,   (2013)   The   spread   of   type     Porcine   Reproductive   and  Respiratory Syndrome   Virus  (PRRSV) in North America: a  phylogeographic  approach. Virology 447 (1­2): 146­154.  175 Shoji Y,  Bi H, Musiychuk K, Rhee A, Horsey A, Roy G, Green B, Shamloul  M, Farrance C E, and Taggart   B (2009) Plant­derived hemagglutinin protects  ferrets against challenge infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian  influenza. Vaccine 27(7): 1087­1092 176 Shoji Y, Chichester JA, Musiychuk H BiK, Rosa P, Goldschmidt L (2008)  Plant­expressed HA as a seasonal influenza vaccine candidate. Vaccine 26(23):  161 2930­2934 177 Shukla DD, Frenkel MJ, McKern NM, Ward CW, Jilka J, Tosic M, Ford RE  (1992) Present status of the sugarcane mosaic subgroup of potyviruses  Arch   Virol, Suppl. 5: 363­373 178 Sirisereewan C, Nedumpun T, Kesdangsakonwut S, Woonwong Y, Kedkovid  R, Arunorat J et al (2017) Positive immunomodulatory effects of heterologous  DNA   vaccine­modified   live   vaccine,   prime­boost   immunization,   against   the  highly­pathogenic PRRSV infection. Vet. Immunol. Immunopathol. 183: 7–15 179 Snijder EJ, Meulenberg JM (1998) The molecular biology of arteriviruses  J   Gen Virol. 79(5): 961–979 180 Spilman MS, Welbon C, Nelson E, et al., (2009) Cryo­electron tomography of  porcine   reproductive   and   respiratory   syndrome   virus:   organization   of   the  nucleocapsid. J. Gen Virol. 90(3): 527–535 181 Sun L, Cai H, Xu W, Hu Y and Lin Z (2002) CaMV 35S promoter directs  β­ glucuronidase expression in Ganoderma lucidum and Pleurotus citrinopileatus.  Appl Biochem Biotechnol. 20(3): 239­244 182 Tepfer M, Gaubert S, Leroux­Coyau M, Prince S and Houdebine LM (2004)  Transient   expression   in   mammalian   cells   of   transgenes   transcribed   from   the  Cauliflower mosaic virus 35S promoter. Environ Biosafety Res 3(2): 91­97 183 Thaa B, Sinhadri BC, Tielesch C, Krause E and Veit M (2013) Signal peptide  cleavage from GP5 of PRRSV: A minor fraction of molecules retains the decoy  epitope,   a   presumed   molecular   cause   for   viral   persistence  PLoS   ONE  8(6):  e65548 184 Thuy Thi­Dieu Nguyen, Thu Thi Nguyen, Ha Thi­Thu Le, Son Giang Nguyen,  Hung   Khanh   Vo,   Nguyen   Thao   Nguyen,   Khoa   Vo­Anh   Do   (2013)   Genetic  Analysis   of   ORF5   Porcine   Reproductive   and   Respiratory   Syndrome   Virus  (PRRSV) Isolated in Vietnam. Microbiol Immunol. 57: 518–526 185 Tian   K   et   al.,   2007   Emergence   of   fatal   PRRSV   variants:   unparalleled  162 outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique  hallmark. PLoS One, 2(6): e526.  186 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400­21:2014 về  Bệnh  động vật ­ Quy trình   chẩn đốn ­ Phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn (PRRS) 187  Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685­12:2014 về Quy trình kiểm nghiệm vắc   xin ­ Phần 12: Vắc xin nhược độc, đơng khơ phòng hội chứng rối loạn hơ hấp   và sinh sản ở lợn (PRRS) 188  Tieu Quang An, Nguyên H ̂ ̃ ưu Nam (2011), "Xac đinh m ̃ ́ ̣ ọt sô vi khuân kê ̂ ́ ̉ ́  phat gay chêt l ́ ̂ ́ ợn trong vung dich Tai xanh  ̀ ̣ ở hyẹn Van Lam ­ Hung Yen nam ̂ ̆ ̂ ̛ ̂ ̆  2010", Tap chi Khoa hoc Ky thu ̣ ́ ̣ ̃ ạt Thu y ̂ ́ , 3(XVIII): 53­60 189 Tô Long Thành (2007) Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp của lợn, Khoa  học kỹ thuật thú y, Tập 14(3): 81­88 190 Tong GZ et al., (2007) Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory  syndrome, China.Emerg Infect Dis. 13(9): 1434­1436.  191 Trabbic­Carlson   K,   Liu   L,   Kim   B   and   Chilkoti   A   (2004)   Expression   and  purification of recombinant proteins from Escherichia coli: comparison of an  elastin­like polypeptide fusion with an oligohistidine fusion. Protein Sci. 13(12):  3274–3284 192 Tran Hong Hanh (2017) Developing a plant virus­based expression system for  the   expression   of   vaccines   against   Porcine   Reproductive   and   Respiratory  Syndrome Virus. Electronic  esis and Dissertation Repository. 4726 193 Transient expression of CCL21 as recombinant protein in tomatoBeihaghia M,  Marashia H, Bagheria A,Sankianb M (2018) Transient expression of CCL21as  recombinant protein in tomato. Biotechnology Reports 17: 10­15 194 Trible BR, Popescu LN, Monday N, Calvert JG, and Rowland RR (2015) A  single amino Acid deletion in the matrix protein of porcine reproductive and  respiratory syndrome virus confers resistance to a polyclonal Swine antibody  with broadly neutralizing activity. J. Virol. 89(12): 6515–6520 163 195 Trus I, Bonckaert C, Van Der Meulen K, and Nauwynck HJ (2014) Efficacy of  an   attenuated   European   subtype     porcine   reproductive   and   respiratory  syndrome   virus   (PRRSV)   vaccine   in   pigs   upon   challenge   with   the   East  European subtype 3 PRRSV strain Lena. Vaccine 32(25): 2995–3003 196 Twyman   RM,   Stoger   E,   Schillberg   S,   Christou   P   and   Fischer   R   (2003)  Molecular farming in plants: Host systems and expression technology  Trends  Biotechnol 21(12): 570­578 197 Uribe­Campero   L,   Nunez­Palenius   HG   and   Gomez­Lim   MA   (2015)  Expression   of   peptide   nanoparticles   containing   a   porcine   reproductive   and  respiratory syndrome (PRRS) virus epitope in plants. Afri J Microbiol Res 9(24):  1600­1607 198 Vaghchhipawala   Z,   Rojas   CM,   Senthil­Kumar   M,   Mysore   KS   (2011)  Agroinoculation  and  agroinfiltration:   simple   tools   for  complex  gene   function  analyses. Methods Mol Biol. 678: 65–76 199 Verwoerd TC, van Paridon PA, van Ooyen AJ, van Lent JW, Hoekema A, and  Pen J  (1995)  Stable   accumulation  of  Aspergillus   niger  phytase  in  transgenic  tobacco leaves. Plant Physiology 109(4): 1199­1205 200 Voinnet O, Rivas S, Mestre P, Baulcombe D (2003) An enhanced transient  expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19  protein of tomato bushy stunt virus. J. Plant. 33(5): 949–956 201 Wagner B, Fuchs H, Adhami F, Ma Y, Scheiner O, and Breiteneder H (2004)  Plant virus expression systems for transient production of recombinant allergens  in Nicotiana benthamiana. Methods 32(3): 227­234 202 Walmsley AM, Arntzen CJ (2003). Plant cell factories and mucosal vaccines.  Curr. Opin. Biotechnol. 14(2): 145­150 203 Wang  X,  Wei   R,  Li  Q,  Liu  H,  Huang  B,  Gao  J,  et  al., (2013)  PK­15  cells  transfected  with  porcine  CD163  by  PiggyBac  transposon  system  are  susceptible to  porcine  reproductive  and respiratory  syndrome  virus.  J Virol  164 Methods 193(2): 383­90 204 Wang   A,   Wang   David   J,   Chowda­Reddy   RV,   Chen   H,   Ma   S   (2011)  Development   of   a   Plant­based   Vaccineagainst   Porcine   reproductive   and  respiratory syndrome virus: Research Progress and Future Prospects. J. of Plant   Science and Biotechnology 5(1): 127­131 205 Wang A, Wang DJ,Chowda­Reddy RV, Chen H, Ma S (2011) Development of  a Plant­based Vaccine against Porcine reproductive and respiratory syndrome  virus: Research Progress and Future Prospects. The Americas Journal of Plant   Science and Biotechnology 5(1): 127­131 206 Wang W, Chen X, Xue , Du Y, Lv L, Liu Q, Li X, Ma Y, Shen H and Cao Y  (2012)   Production   and   immunogenicity   of   chimeric   virus­like   particles  containing porc ine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 prote in.  Vaccine 30(49): 7072­7077 207 Wang Y,Guo J, Qiao S, Li Q, Yang J, Jin Q, Zhang G (2016) GP5 protein­ based  ELISA   for   the   detection   of   PRRSV   antibodies  Journal   of   Veterinary   Sciences Vol. 19(3): 495–501 208 Welch  SK,  Jolie  R,  Pearce  DS,  Koertje  WD,   Fuog  E,  Shields  SL,  et   al     Constructionand     evaluation     of     genetically     engineered     replication­ defective   porcine   repro­ductive   and   respiratory   syndrome   virus   vaccine  candidates.  Vet  Immunology and Immunopathology, 102(3): 277­290 209 Wieringa R, Antoine AF de Vries, Post SM, Rottier PJM (2003) Intra­ and  Intermolecular Disulfide Bonds of the GP2b Glycoprotein of Equine Arteritis  Virus: Relevance for Virus Assembly and Infectivity  J Virol.  77(24): 12996– 13004 210 Wieringa R, De Vries A A, Van Der Meulen J, Godeke GJ, Onderwater JJ,  Van Tol H et al., (2004) Structural protein requirements in equine arteritis virus  assembly. J. Virol. 78(23): 13019–13027 211 Wirth S, Calamante G, Mentaberry A, Bussmann L, Lattanzi M, Bara L et al.,  165 (2004) Expression of active human epidermal growth factor (hEGF) in tobacco  plants by integrative and non­integrative systems. Mol Breed.13(1): 23–35 212 Wissink EH, Kroese MV, van Wijk HA, Rijsewijk FA, Meulenberg JJ, Rottier  PJ (2005)Envelope protein requirements for the assembly of infectious virions  of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Virol 79(19): 12495­ 12506 213 Wu J, Li J, Tian F et al. (2009) Genetic variation and pathogenicity of highly  virulent porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerging in China.  Arch Virol 154:1597 214 Xiang C, Han P, Lutziger I, Wang K, and Oliver D (1999) A mini binary  vector series for plant transformation. Plant Mol Biol 40(4): 711­717.  215 Xu C, Min J(2011) Structure and function of WD40 domain proteins. Protein  Cell. 2(3): 202­214 216 Yang   L,   Frey   ML,   Yoon   KJ,   Zimmerman   JJ,   and   Platt   KB   (2000)  Categorization   of   North   American   porcine   reproductive   and   respiratory  syndrome  viruses: epitopic profiles of the N, M, GP5 and GP3 proteins and  susceptibility to neutralization. Arch. Virol. 145(8):1 599–1619 217 Ye   J,   Qu   J,   Zhang   J,   Geng   Y,   Fang   R   (2009)   A   critical   domain   of   the  Cucumber mosaic virus 2b protein for RNA silencing suppressor activity. FEBS   Letters 583(1): 101–106 218 Zhang X, Du P, Lu L, Xiao Q, Wang Q, Cao X, Ren B, Wei C, Li Y (2008)   Contrasting effects of HC­Pro and 2b viral suppressors from Sugarcane mosaic  virus   and   Tomato   aspermy   cucumovir   us   on   the   accumulation   of   siRNAs.  Virology 374(2): 351 – 360 219 Zhang X, Urry DW and Daniell H (1996) Expression of an environmentally  friendly   synthetic   protein­based   polymer   gene   in   transgenic   tobacco   plants.  Plant Cell Rep. 16(3­4): 174–179 220 Zhao   H,   Tan   Z,   Wen   X   and   Wang   Y   (2017)   An   Improved   Syringe  166 Agroinfiltration Protocol to Enhance Transformation Efficiency by Combinative  Use of 5­Azacytidine, Ascorbate Acid and Tween­20. Plants. 6(1): 1­10 221 Zhao   H,   Wang   Y,   Ma   Z,   Wang   Y   and   Feng   WH   (2014)   Recombinant  Kluyveromyces   lactis   expressing  highly   pathogenic   porcine   reproductive   and  respiratory   syndrome   virus   GP5   elicits   mucosal   and   cell­mediated   immune  responses in mice. J Vet Sci 15(2): 199­208 222 Zheng Q, Chen D, Li P, Bi Z, Cao R, Zhou B, Chen P (2007) Co­expressing  GP5 and M proteins under different promoters in recombinant modified vaccinia  virus ankara (rMVA)­based vaccine vector enhanced the humoral and cellular  immune   responses   of   porcine   reproductive   and   respiratory   syndrome   virus  (PRRSV). Virus Genes 35(3): 585–595 223 Zhong   Y,   Guo   A,   Li   C,   Zhuang   B,   Lai   M,   Wei   C,   Luo   J,   Li   Y   (2005)  Identification of a naturally occurring recombinant isolate of Sugarcane mosaic  virus causing maize dwarf mosaic disease. Virus Genes 30 (1): 75­83 224 Zhong   Y,   Guo   A,   Li   C,   Zhuang   B,   Lai   M,   Wei   C,   Luo   J,   Li   Y   (2005)  Identification of a naturally occurring recombinant isolate of Sugarcane mosaic  virus causing maize dwarf mosaic disease. Virus Genes 30(1): 75 –83 225 Zhou JX, Xue JD, Xu JD, Zhang JB, Liu Y, Jiang N et al., (2010) Immune  responses in pigs induced by recombinant canine adenovirus 2 expressing the  glycoprotein 5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Vet Res  Commun. 34(4): 371­380 226 Zhou   L   et   al.,   (2014)   Genetic   diversity   analysis   of   genotype     porcine  reproductive   and   respiratory   syndrome   viruses   emerging   in   recent   years   in  China. Biomed. Res Int. 3: 748068.  227 Zhou L, Wang Z, Ding Y, Ge X, Guo X, and Yang H (2015) NADC30­like  strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, China  Emerg.  Infect. Dis. 21(12): 2256–2257 228 Zhou YJ, Yu H, Tian ZJ, Li GX, Hao XF et al., (2009) Genetic diversity of the  167 ORF5 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in  China from 2006 to 2008. Virus Res. 144(1­2): 136­44 229 Zuckermann  FA,  Garcia  EA,  Luque  ID,  Christopher­Hennings J, Doster A,  Brito M, Osorio F (2007) Assessment of the efficacy of commercial porcine  reproductive   and   respiratory   syndrome   virus   (PRRSV)   vaccines   based   on  measurement of serologic response, frequency of gamma­IFN­producing cells  and virological parameters of protection upon challenge. Vet. Microbiol. 123(1­ 3): 69­85 ... VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HẰNG  NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M, GP5, GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI  LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY ...  vào các luận cứ  khoa học và tình hình thực tiễn nêu trên, luận án   được thực hiện với  đề  tài  Nghiên cứu biểu hiện kháng ngun (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn trong ... GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ  Agrobacterium” với mục đích  tạo cơ  sở  khoa học và thực nghiệm để biểu hiện các gen mã hố kháng ngun   của chủng virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn đang lưu