nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết lá cây huyền diệp (polyalthia longifolia var.pendula hort) trên vi khuẩn e.coli, salmonella spp phân lập từ phân chó tiêu chảy và thử nghiệm điều trị.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ---o0o--- NGUYỄN BÁ PHƯỚC NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG DIỆT KHUẨN IN VITRO CỦA DỊCH CHIẾT LÁ CÂY HUYỀN DIỆP POLYALTHI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-o0o -

NGUYỄN BÁ PHƯỚC

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG DIỆT KHUẨN IN VITRO CỦA DỊCH CHIẾT LÁ CÂY HUYỀN DIỆP (POLYALTHIA LONGIFOLIA VAR.PENDULA HORT) TRÊN VI KHUẨN E.COLI, SALMONELLA SPP PHÂN LẬP TỪ PHÂN CHÓ

TIÊU CHẢY VÀ THỬ NGHIỆM ĐIỀU TRỊ

CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS NGUYỄN VĂN THANH

2 TS NGUYỄN THANH HẢI

LỜI CAM ĐOAN

- Tôi xin cam đoan số và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được sử dụng công bố trong bất kỳ công trình nào khác

- Tôi xin cam đoan các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Bá Phước

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban quản lý Đào tạo, Khoa thú y đã quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn khoa học PGS.TS.Nguyễn Văn Thanh, TS.Nguyễn Thanh Hải những người đã tận tình giúp

đỡ, chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và xây dựng luận văn

Tôi xin được cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Ngoại – Sản, Khoa thú

y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn

Xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc, đội ngũ cán bộ thú y, nhân viên các Chi cục Thú y tỉnh Nam Định, Trung tâm nghiên cứu chó nghiệp vụ Khoa thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tại cơ sở

Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè, những người luôn tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu cũng như hoàn thành luận văn

Tác giả luận văn

Nguyễn Bá Phước

2.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng sản phẩm thảo dược trên thế giới và

2.2.1 Tình hình nghiên cứu và sử dụng sản phẩm thảo dược trên thế giới 6 2.2.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng sản phẩm thảo dược ở Việt Nam 7 2.3 Cây Huyền diệp (Polyalthia longifolia var.pendula Hort.) 8

2.3.4 Tổng quan các nghiên cứu về tác dụng kháng vi sinh vật của cây

2.4.3 Một số nghiên cứu về vi khuẩn gây hội chứng tiêu chảy trên chó 17

PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

4.1 Kết quả kháng sinh đồ xác định tính mẫn cảm, tính kháng thuốc của vi

4.2 Hiệu suất chiết xuất lá Huyền diệp bằng các dung môi khác nhau 31 4.3 Kiểm tra định tính xác định các nhóm hoạt chất có trong dịch chiết lá

4.4 Kiểm tra tác dụng diệt khuẩn in vitro của các dịch chiết lá Huyền diệp

4.4.1 Tác dụng diệt khuẩn in vitro của các dịch chiết trên vi khuẩn

4.4.2 Tác dụng diệt khuẩn in vitro của các dịch chiết trên vi khuẩn E coli

4.5 Đánh giá khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết trên vi khuẩn

E.coli và Salmonella có chứa plasmid mang gen kháng kháng sinh 43 4.6 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết lá cây Huyền diệp

4.7 Sử dụng cao dịch chiết lá Huyền diệp điều trị thử nghiệm trên chó bị

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

11 D1, D2, D3 Đường kính vòng vô khuẩn của các lần thử 1,2,3

12 Dtb Đường kính vòng vô khuẩn trung bình

13 Đ/c DMSO Đối chứng Dimethyl sulfoxide

14 MIC Nồng độ ức chế tối thiểu

DANH MỤC BẢNG

3.3 Bảng tiêu chuẩn đánh giá khả năng mẫn cảm và kháng thuốc của vi

4.1 Kết quả kháng sinh đồ kiểm tra tính mẫn cảm, tính kháng thuốc của vi

4.2 Hiệu suất tách chiết của dịch chiết lá Huyền diệp bằng các dung môi

4.6 Kết quả kiểm tra khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết lá cây Huyền

diệp đối với vi khuẩn chứa plasmid mang gen kháng kháng sinh 44 4.7 Khả năng diệt khuẩn in vitro dịch chiết lá cây Huyền diệp sử dụng

4.8 Kết quả thử nghiệm điều trị chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy 50

DANH MỤC HÌNH

3.1 Hệ nồng độ pha loãng cao đặc để xác định nồng độ tối thiểu tác

4.1 Mầu sắc dịch chiết lá Huyền diệp trong 5 dung môi nghiên cứu 33 4.2 Hiệu suất chiết xuất lá Huyền diệp trong các dung môi tách chiết 34 4.3 Phản ứng định tính xác định các nhóm hoạt chất có trong dịch chiết 37 4.4 Tác dụng diệt khuẩn in vitro của các dịch chiết lá Huyền diệp đối với

4.5 Tác dụng diệt khuẩn in vitro của các dịch chiết lá Huyền diệp đối với

4.6 Tác dụng diệt khuẩn in vitro của các dịch chiết lá Huyền diệp đối với

vi khuẩn chứa plasmid mang gen kháng kháng sinh 45 4.7 Khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết lá cây Huyền diệp trong

dung môi chloroform với vi khuẩn phân lập từ phân chó bị viêm ruột

4.8 Khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết lá cây Huyền diệp trong

dung môi chloroform với vi khuẩn mang plasmid chứa gen kháng

4.9 Khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết lá Huyền diệp trong dung

4.10 Tỷ lệ khỏi bệnh của chó theo thời gian điều trị 51

PHẦN I

MỞ ĐẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn và tác dụng phụ của kháng sinh trong điều trị đang là những thách thức trong y học (WHO 2014) Sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm động vật đang không những gây độc tính mà có thể gây dị ứng cho người tiêu dùng Tại một số nước phát triển, việc sử dụng kháng sinh như chất tăng trưởng hay mục đích phòng bệnh đã bị cấm Tổ chức y tế thế giới đã nhận định rằng nhiều hợp chất có nguồn gốc thực vật bản địa có khả năng thay thế thuốc kháng sinh Những nghiên cứu và trao đổi thông tin về thảo dược ngày càng được chú trọng (Amadxou, 1998) Thảo dược đang ngày càng chứng minh được vai trò quan trọng của nó trong nền công nghiệp dược phẩm như là một giải pháp an toàn sinh học thay thế cho các thuốc hóa học tổng hợp (Mahesh et al., 2008; Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho, 2013) Kháng sinh thảo dược được coi là lựa chọn thay thế hoàn hảo cho các loại kháng sinh tổng hợp vì nó ít gây ra phản ứng bất lợi, không tồn dư kháng sinh, chưa tìm thấy dòng vi khuẩn kháng và giá thành thuốc cũng hạ hơn so

với các thuốc kháng sinh tổng hợp (Gislence et al., 2000)

Cây Huyền diệp (Polyalthia longifolia var.pendula Hort.) thuộc họ Mãng Cầu (Na) – Annonaceae còn gọi là cây Hoàng Nam hay Tùng Ấn Độ, được phân bố

rộng rãi ở Bangladesh, Srilanka và trải đều tại các vùng nóng của Ấn Độ Hiện nay cây Huyền diệp đã được du nhập vào Việt Nam Tại Ấn Độ và các nước Nam Á cây Huyền diệp được sử dụng như một loại thảo dược khá thông dụng để giải nhiệt, điều trị sốt, cảm lạnh, hạ huyết áp, đái đường, bệnh lậu, rong kinh, bệnh viêm tử cung (Chanda, Nair, 2010) Các tài liệu cho thấy hầu hết những cây thuộc họ

Annonaceae đều có chứa các hoạt chất chống ung thư Các hoạt chất được chiết xuất từ những bộ phận của cây Huyền diệp có tính kháng khuẩn, chống viêm, loét, giải độc, bảo vệ gan, hạ huyết áp và kháng nấm tốt (Saleem et al., 2005; Malairajan

et al., 2008; Misra et al., 2010; Singh et al.,2012; Anzana Parvin et al., 2013)

Bệnh viêm ruột tiêu chảy là một bệnh khá phổ biến trên chó, ngoài các nguyên nhân do các bệnh truyền nhiễm như Carê, viêm ruột tiêu chảy do Parvovius

một trong những nguyên nhân gây bệnh chính là vi khuẩn E coli và Salmonella spp.(Nguyễn Tuyết Thu, 2008; Nguyễn Văn Thanh và Nguyễn Tuyết Thu, 2008)

Theo nhiều tác giả thì hiện nay nhiều chủng vi khuẩn E coli và Salmonella spp gây

bệnh tiêu chảy đã kháng lại nhiều loại kháng sinh thường dùng trong thú y (Normand et al., 2000; Frech et al., 2003; Cù Hữu Phú và cộng sự, 2004; Trương Quang và cộng sự, 2005; Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho, 2013)

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác dụng

diệt khuẩn in vitro của dịch chiết lá cây Huyền diệp (Polyalthia longifolia var.pendula Hort.) trên vi khuẩn E coli, Salmonella spp phân lập từ phân chó

tiêu chảy và thử nghiệm điều trị”

1.2 Mục đích của đề tài

Đánh giá hiệu suất chiết xuất lá Huyền diệp sử dụng các dung môi khác nhau, xác định định tính các nhóm hoạt chất có trong dịch chiết lá cây Huyền diệp Lựa chọn dung môi tốt nhất để thu dịch chiết lá cây Huyền diệp có tác dụng

diệt khuẩn in vitro đối với E coli và Salmonella spp., ngoài ra còn nghiên cứu khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết đối với E coli Top 10 có chứa plasmid

kháng đơn thuốc (ampicillin và kanamycin)

Dựa trên kết quả nghiên cứu khả năng diệt khuẩn in vitro tiến hành sử dụng dịch chiết cây Huyền diệp trong điều trị chó bị mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Chứng minh một cách khoa học về khả năng diệt khuẩn của lá cây Huyền diệp Sơ bộ định tính được các nhóm chức có khả năng diệt khuẩn (kháng sinh thực vật) có trong lá cây Góp phần bổ sung cơ sở lý luận về tác dụng dược lý và ứng dụng trong dân gian của dược liệu lá cây Huyền diệp

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Kết quả của nghiên cứu này giúp ta hiểu rõ hơn về khả năng ứng dụng của lá

cây Huyền diệp trong điều trị bệnh do vi khuẩn E coli, Salmonella spp gây bệnh

viêm ruột tiêu chảy của chó

Trên cơ sở của kết quả nghiên cứu có thể nghiên cứu điều trị thử nghiệm trên quy mô lớn Tiến tới ứng dụng dịch chiết lá cây Huyền diệp trong phòng và điều trị bệnh tiêu chảy ở chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy nói riêng và vật nuôi nói chung trong thực tiễn, góp phần giảm thiểu sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi đồng thời hạn chế sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn, góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe cộng đồng

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn

Thuốc kháng sinh dược dùng để phòng và trị bệnh gia súc, nhưng phần lớn trên 90% thuốc được sử dụng như những chất kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi và ngư nghiệp Thuốc kháng sinh được trộn vào thức ăn hỗn hợp với những nồng độ thật thấp để giúp động vật mau lớn và tăng trọng nhanh Trong thời gian qua, việc sử dụng thuốc kháng sinh trong điều trị các bệnh truyền nhiễm cho vật nuôi chưa được quan tâm đúng mức, hiện tượng sử dụng thuốc kháng sinh tràn lan, dùng kháng sinh trộn vào thức ăn để phòng bệnh, không theo quy định, không đúng nguyên tắc đã gây ra hiện tượng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt gây ra hiện tượng đa kháng thuốc ở vi sinh vật gây bệnh, làm giảm hiệu lực của kháng sinh, nguy hiểm hơn là làm mất tác dụng của kháng sinh Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn và tác dụng phụ của kháng sinh trong điều trị đang là những thách thức trong y học Theo Trợ lý Tổng Giám đốc WHO, Keiji Fukuda, nếu không phối hợp hành động tức thời, thế giới sẽ đối mặt với một kỷ nguyên “hậu thuốc kháng sinh”, khi đó các bệnh truyền nhiễm thông thường hoặc những vết thương nhỏ trước đó có thể chữa trị được thì nay có thể gây chết động vật và người

do kháng thuốc kháng sinh (WHO, 2014)

Chúng ta không thể hoàn toàn loại bỏ được hiện tượng đề kháng của kháng sinh một khi chúng xuất hiện Ngoài sự linh hoạt do đặc tính sinh học, vi khuẩn còn

có khả năng bảo tồn sự đề kháng một khi gen kháng thuốc nằm trên nhiễm sắc thể của nó Ngược lại, khi yếu tố di truyền liên quan đến đề kháng nằm trên plasmid nhất là plasmid tiếp hợp, vi khuẩn sẽ có khả năng truyền sự đề kháng này cho vi khuẩn khác cùng hay khác loài Từ đó sự kháng kháng sinh gia tăng dần lên trong quần thể vi khuẩn

Tại Vương Quốc Anh, nhiều tài liệu khoa học đã cho thấy hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh tăng dần theo thơi gian từ năm 1980 đến năm 2000,

đặc biệt với vi khuẩn E.coli và Salmonella gây bệnh cho chó với kháng sinh

penicillin amoxiclav và streptomycin (Lloyd et al., 1996; Normand et al., 2000)

Tại Thụy Sỹ cũng đã thấy xuất hiện vi khuẩn S Intermedius gây bệnh cho

chó đã có hiện tượng tăng sự kháng thuốc với nhiều loại kháng sinh như penicillin, neomycin, sulphonamide, co-trimoxazole và erythromycin (Wissing et al., 2001)

Vi khuẩn S Typhimurium (DT104) gây bệnh ở chó và mèo kháng đa thuốc

đã xuât hiện ở Anh (Wall et al., 1996; Low et al., 1996), ở Đức (Frech et al., 2003),và tại Mỹ (Centers for Disease Control and Prevention, 2001) Các chủng này thường kháng với ít nhất năm loại kháng sinh, bao gồm ampicillin, chloramphenicol, streptomycin, sulphonamide và tetracycline Theo nghiên cứu của

Zhao và cộng sự, chủng Salmonella enterica serotype Newport đã kháng lại ít nhất

9 loại kháng sinh (bao gồm cả cephalosporins) gây bệnh trên cả động vật và người ở

Mỹ (Zhao S., et al., 2003)

Kết quả nghiên cứu của Sanchez và cộng sự năm 2002 bệnh viện Thú y Đại học Georgia đã phân lập được chủng vi khuẩn E.coli từ chó đã kháng 12 loại thuốc

kháng sinh Vi khuẩn E.coli kháng chủ yếu với các nhóm cephalosporins,

β-lactams, tetracycline, spectinomycin, sulfonamides, chloramphenicol và gentamicin (Sanchez S et al 2002)

Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Phạm Khắc Hiếu và Bùi Thị Tho (1999)

đã tìm thấy chủng vi khuẩn kháng lại 11 loại kháng sinh, đồng thời cũng chứng minh khả năng di truyền tính kháng thuốc giữa các vi khuẩn thông qua plasmid

Theo nghiên cứu của Cù Hữu Phú và cộng sự (1999), 80 - 90% vi khuẩn Salmonella

phân lập được kháng mạnh với penicillin và ampicillin Nghiên cứu tính kháng kháng sinh của 106 chủng vi khuẩn phân lập được từ lợn con theo mẹ bị tiêu chảy ở một số tỉnh phía Bắc, Việt Nam, Đỗ Ngọc Thúy và cộng sự (2002) đã thu được kết quả các chủng có xu hướng kháng mạnh với các loại kháng sinh thông thường dùng

để điều trị đặc biệt với Streptomycin lên tới 88,68% Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn với trên 3 loại kháng sinh là khá phổ biến (chiếm 90,57%)

Sự kháng thuốc đang gia tăng nhanh chóng là một vấn đề nghiêm trọng, do

sinh có nguồn gốc thực vật, vì nó ít tác dụng phụ và có khả năng điều trị tốt (Sumitra Chanda et al., 2013)

2.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng sản phẩm thảo dược trên thế giới

và Việt Nam

2.2.1 Tình hình nghiên cứu và sử dụng sản phẩm thảo dược trên thế giới

Thuốc phòng trị bệnh cho người và thú nuôi hầu hết được bào chế từ hai nguồn dược liệu và hóa chất Riêng thảo dược theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới đạt tới 20.000 loài Việc sử dụng thảo dược hiện không chỉ các nước Á Đông

mà các nước phương Tây cũng tiêu thụ một lượng khá lớn Ở các nước có nền công nghiệp phát triển có tới 1/4 số thuốc có kê trong đơn đều chứa hoạt chất từ thảo dược Riêng ở Mỹ năm 1980 con số thuốc này đã có giá trị 8 tỷ USA (Viện dược liệu, 2005) Trong những năm gần đây xu hướng thế giới dùng thuốc thảo dược tự nhiên (không tách hoạt chất) ngày càng nhiều Hiện có rất nhiều biệt dược, đông dược của Trung Quốc được tiêu thụ mạnh ở các nước châu Âu

Ngày nay dược liệu có vai trò sau:

+ Dược liệu là nguồn cung cấp nguyên liệu cho việc bán tổng hợp một số hóa dược: Từ chất diosgenin của củ mài để bán tổng hợp lên thuốc steroid được sử dụng nhiều trong lâm sàng

+ Nhiều hoạt chất quan trọng: quinin, emetin, strychnin, morphin, ajmalin, vincaleucoblastin,… đều phải chiết ra từ dược liệu vì chưa tổng hợp được

+ Dược liệu mở đường cho ngành công nghiệp hóa dược phát triển:

- Biết được công thức của ephedrin hoá dược đã ngưng tụ acetyl carbinol với methylamin để có ephedrin tổng hợp

L-1-phenuy-1 Dựa vào công thức của quinin trong vỏ canhL-1-phenuy-1 kiL-1-phenuy-1 na để tổng hợp rất nhiều dẫn chất trị ký sinh trùng sốt rét

- Dựa vào artemisinin của cây thanh hao hoa vàng, các dẫn chất artesunat, arteether, artemether được bán tổng hợp cũng để trị ký sinh trùng sốt rét (Hoàng Thị Tuyết Nhung, 2012)

Từ 1950-1980 thế giới đã thử tác dụng chống ung thư như: taxol (paclitaxe) của cây Taxus brevfolia Nutt, họ Taxaceae có tác dụng chữa ung thư buồng trứng ở

thời kỳ tiến triển Năm 1992 ở Mỹ, Canada và Pháp đã sử dụng taxol trên lâm sàng Hiện nay người ta đang nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất mới từ taxol (Kingston et

al, 1990; Karpagam et al, 2009)

Các kết quả trên chỉ mới bước đầu thử nghiệm sàng lọc các loại thảo dược chưa xác định được thành phần nào trong thực vật có tác dụng trên virus

và vi khuẩn

Ngày nay, với kỹ thuật sàng lọc hoạt tính sinh học mới, hiện đại với tốc độ nhanh, lượng mẫu nhỏ, việc phát hiện các hoạt chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học mới là rất có triển vọng Sau khi phát hiện ra các chất có hoạt tính mới thì việc nghiên cứu chuyển hóa chúng thành dẫn xuất bằng nhiều con đường trong đó có hóa

tổ hợp (combinatorial chemistry) để thử hoạt tính sinh học vẫn là một lĩnh vực hấp dẫn (Trần Văn Sung và cộng sự, 2011)

Ứng dụng công nghệ thông tin trong việc thiết kế các phân tử thuốc mới, cũng như trong nghiên cứu mối tương quan Cấu trúc – Hoạt tính đang ngày càng phát triển Mặc dù đa số các công ty dược trên thế giới trong thời gian qua chưa đầu

tư tích cực lắm cho việc nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên Song, việc nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên vẫn được đẩy mạnh trong những thập niên vừa qua và chắc chắn sẽ phát triển mạnh trong thời gian tới

2.2.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng sản phẩm thảo dược ở Việt Nam

Việt Nam có độ đa dạng sinh học cao, có tới 2/3 diện tích đất tự nhiên trong nước là rừng, đồi núi và cao nguyên Theo Nguyễn Thượng Dong, Việt Nam có

10386 loài thực vật trong đó có 3830 loài có khả năng sử dụng làm thuốc Trong công nghiệp dược phẩm nhân y đã có 1340/5577 loại thuốc chiếm 24% được sản xuất từ dược liệu hay hoạt chất từ dược liệu như: Berberin, palmatin, artemisinin (Nguyễn Thượng Dong, 2001) Nhân y sử dụng dược liệu với nhiều mục đích khác nhau: thức ăn thay thế, phòng trị các bệnh truyền nhiễm, ký sinh trùng, nội khoa, ngoại khoa, sản khoa, ung thư… với rất nhiều dạng thuốc khác nhau: Thuốc sắc, thuốc cao, viên hoàn, viên nén…

Ngày nay, nhiều cây thuốc đã có hiệu quả điều trị rõ rệt, nhưng cơ chế tác

Đông y và Tây y với phương châm vừa áp dụng những kinh nghiệm chữa bệnh của cha ông ta bằng thuốc nam, vừa nghiên cứu khảo sát các tính năng tác dụng của cây thuốc bằng cơ sở khoa học hiện đại (Đỗ Tất Lợi, 1999)

Các công trình nghiên cứu về lĩnh vực Đông dược, Y dược cổ truyền bên nhân y đã và đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học ở Việt Nam và trên thế giới Các nhà khoa học nước ta đã chú ý đến việc sử dụng các loại thảo dược trong phòng và trị bệnh truyền nhiễm; bệnh ký sinh trùng; bệnh nội khoa; bệnh ngoại khoa; bệnh sản khoa… Riêng lĩnh vực thú y, nghiên cứu về cây thuốc trong phòng trị bệnh cho vật nuôi còn ít và cũng chỉ giới hạn trong việc khai thác,

áp dụng các bài thuốc cổ truyền

Về lĩnh vực thú y, các nghiên cứu sử dụng các kháng sinh thực vật trong nuôi dưỡng và phòng trị bệnh cho lợn, đặc biệt bệnh lợn con phân trắng đạt hiệu quả cao (Bùi Thị Tho, 1996) Theo Trần Quang Hùng (1995) trong thuốc lá, thuốc lào có chứa alkaloid thực vật – nicotin và nornicotin trừ được ngoại ký sinh trùng và côn

trùng hại rau, cây công nghiệp Theo Lê Thị Ngọc Diệp (1999) cây Astiso (Cynara Scolymus L) chứa hoạt chất có tác dụng chống viêm, lợi tiểu, thông mật, bổ gan

Nghiên cứu tác dụng phòng trị bệnh lợn con phân trắng của các cây tỏi, tô

mộc, hành, hẹ và hoàng đằng Đặc biệt, tác giả còn cho thấy vi khuẩn E.coli kháng

lại kháng sinh thực vật của tỏi, hẹ lại chậm hơn rất nhiều so với các thuốc hoá học trị liệu khác: tetracyclin, neomycin… Riêng mảng sử dụng các cây dược liệu: lá thuốc lào, thuốc lá, hạt na, vỏ rễ xoan, hạt cau, củ bách bộ, dây thuốc cá, hạt củ đậu… dùng để trị nội, ngoại ký sinh trùng thú y cũng đã thu được những kết quả nhất định (Nguyễn Văn Tý, 2002)

Kết quả nghiên cứu của Bùi Thị Tho và Nguyễn Thành Trung (2011), khi sử dụng dịch chiết cây Xuân hoa trong điều trị lợn con bị viêm ruột tiêu chảy tỷ lệ khỏi theo các công thức khác nhau đạt từ 87,51% đến 100%, thời gian khỏi bình quân là 2,3 – 3,08 (ngày)

2.3 Cây Huyền diệp (Polyalthia longifolia var.pendula Hort.)

2.3.1 Nguồn gốc phân loại

Tên khoa học: Polyathia longifolia var Pendula Hort

Tên thông thường: Huyền diệp, Hoàng nam

Thuộc họ Na: Annonaceae

Thuộc chi Nhọc: Polyalthia

Chi Nhọc (Polyalthia) là một chi lớn trong họ Na (Annonaceae), có khoảng

150 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Phi, châu Á và miền bắc nước Úc, số lớn các loài tập trung ở Đông Nam Á Ở việt Nam có 27 loài, phân bố khắp các vùng

2.3.2 Mô tả thực vật

Cây gỗ nhỡ, cao 5 - 15 m, phân cành sớm từ gốc, dài, cong rũ xuống, tán hẹp dạng thấp, che kín hết thân, xanh quanh năm Lá đơn mọc cách, trên cành gãy khúc, dạng thuôn dài hẹp, đầu nhọn, gốc tù, dài 8 - 20 cm, rộng 2 - 4 cm, màu xanh nhẵn

cả hai mặt, mép lá nhăn nheo Gân bên không rõ Cuống lá dài 0,5 – 0,8 cm

Hình 2.1 Cây và các bộ phận của cây Huyền diệp

Ra hoa từ tháng hai đến tháng tư Hoa đơn, hoa hình ngôi sao, màu vàng chanh, cuống ngắn và mảnh Nhị đực nhiều Bầu có nhiều lá noãn

Hình thành quả vào tháng bảy, quả có hình trứng hoặc bầu dục dài 2 cm màu đen Quả mọc thành chùm, mỗi chùm từ 10 – 20 quả Ban đầu xanh, sau chuyển màu tím hoặc đen khi chín

2.3.3 Thành phần hóa học

Từ dịch chiết methanol của cây Huyền diệp đã phân lập được một haliman diterpen mới, 3β,5β,16α - trihydroxyhalima - 13(14) - en - 15,16 - olit, và oxoprotoberberine alkaloid, (-) - 8 - oxopolyathiain trong đó có một số hợp chất có

hoạt tính kháng một số dòng ung thư

Dịch chiết n-hexan của vỏ cây Huyền diệp đã phân lập được 9 hợp chất clerodan và ent - haliman diterpen mới là: 16 - hydroxycleroda - 4(18), 13 - dien - 16,15 - olit; axit 16 - oxocleroda - 4(18), 13E - dien - 15 - oic; cleroda - 4(18), - 13 - dien - 16,15 - olit; 16 - hydroxyl - ent - Halima - 5(10),13 - dien - 16,15 - olit; axit

16 - oxo - ent - Halima - 5(10), 13E - dien - 15 - oic; ent - Halima - 1(10),13E - dien

- 16,15 - olit; axit 16 - oxo - ent - halima - 5(10),13E - dien - 15 - oic; ent - Halima - 5(10),13 - dien - 16,15 - olit và ent - Halima - 5(10),13E - dien - 16,15 - olit cùng với 5 clerodan diterpen đã biết

Từ cây Huyền diệp, Chen C Y và cộng sự (2000) đã phân lập được 1 hợp chất A haliman diterpen mới 3β, 5β, 16α - trihydroxyhaliman - 13(14) - en - 15,16 - olide, và oxoprotoberberin alkaloid, (-) - 8 - oxopolyalthiain, cùng với 20 hợp chất

đã biết, 16α - hydroxycleroda - 3,13 - dien - 15,16 - olit; axit 16 - hydroxycleroda - 3,13 - dien - 15 - oic; axit cleroda - 3,13E - dien - 15 - oic; axit 3,12E - lolavadien -

15 - oic - 16 - al; (4→2)- abeo - 16 (R và S)- 2,13Z - kolavadien - 15,16 - olit - 3 - al; axit labd - 13E - en - 8 - ol - 15 - oic; (-)- stepholidin, 1 - aza - 4 - methyl - 2 - oxo - 1,2 - dihydro - 9,10 - anthracenedion; 5 - hydroxyl - 6 - methoxyonychin; 6 - hydroxyl - 7 - methoxyonychin; liriodenin; oxoxylopin; (-) - anonain; (-) - asimilobin; (-) - norboldin; (+) - norboldin; (-) - norpallidin; axit ρ - hydroxybenzoic; β - sitosterol và stigmasterol

Một clerodan diterpenoit là 16 - hydroxycleroda - 13 - en - 15,16 – olit - 3 -

on được phân lập từ vỏ cây Huyền diệp cùng với 23 hợp chất đã biết và các hợp chất phytosteroit

Phân lập theo định hướng hoạt tính sinh học của dịch chiết methanol lá cây Huyền diệp cho thấy hoạt tính kháng 13 dòng Gram dương và 9 dòng Gram

âm, hợp chất (3S, 4R) - 3,4,5 - rihydroxylpentanoic acid - 1,4 - lacton tạo ra hoạt tính trên

Phân lập theo nghiên cứu định hướng hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây Huyền diệp cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh và người ta đã phân lập 3 hợp chất mới alkaloid pendulamin A, pendulamin B, và pendulin cùng với stigmasterol

3 - O - β - D - glucosid, allantoin và isoursulin

2.3.4 Tổng quan các nghiên cứu về tác dụng kháng vi sinh vật của cây Huyền diệp

Polyalthia longifolia đã được sử dụng trong các hệ thống truyền thống của y học để điều trị sốt, bệnh ngoài da, bệnh nhân tiểu đường và cao huyết áp, kích thích

hô hấp và đặc trị làm hạ cơn sốt Các bộ phận của cây Huyền diệp (Polyalthia longifolia) được sử dụng để điều trị sốt, bệnh lậu, hạ huyết áp, đái đường và rong kinh, và đã được biết đến để được sử dụng như một loại thảo dược khá thông dụng

ở Ấn Độ (Nair et al., 2004; Jain et al., 2009)

Tại Ấn Độ, hạt của cây này đã được sử dụng để giải nhiệt (Raghunathan và Mitra, 1982) Chiết xuất vỏ thân cây và các alkaloid tách từ dich chiết cây

Polyalthia longifolia đã được chứng minh có hoạt động kháng khuẩn và kháng nấm

tốt (Hasan et al, 1988) Dịch chiết nước của cây gây kích thích sự hồi tràng và tử

cung cô lập, gây ức chế cơ tim, làm giảm huyết áp và giảm tần số hô hấp ở động vật thí nghiệm (Achari và Lal, 1992) Các chất chiết xuất dầu thô của những hạt của cây này cũng cho thấy hoạt động kháng khuẩn đáng kể (Sayeed và cộng sự, 1995) Vỏ cây cũng được sử dụng như một loại thuốc giải nhiệt khá thông dụng ở huyện Balasore của bang Orissa Vỏ thân cây được nghiền thành bột và trộn với bơ để điều trị bệnh lậu vùng Genitalial Ấn Độ Vỏ cây còn được sử dụng để điều trị bệnh viêm

tử cung (Rosakutty, 2000) Nước sắc của lá và vỏ cây được sử dụng như trị cảm lạnh và ho khan Chất chiết xuất từ vỏ thân cây Huyền diệp còn được sử dụng để chữa bệnh loét miệng (Raghunathan, Mitra, 2002) Nghiên cứu gần đây còn cho

thấy trên cuống lá, rễ, vỏ rễ đã cho thấy tiềm năng kháng khuẩn cao và hoạt động hạ

huyết áp đáng kể của cây Huyền diệp (Polyalthia longifolia) (Faizi et al, 2005)

Theo nghiên cứu của Thenmozhi và Sivaraj (2010) trên vi khuẩn gây bệnh,

dịch chiết lá cây Huyền diệp trong dung môi chloroform có tác dụng diệt khuẩn in vitro tốt, đạt độ mẫn cảm cao theo tiêu chuẩn CLSI, đường kính vòng vô khuẩn ≥

20 mm Đường kính vòng vô khuẩn lần lượt đối với E coli là 24 mm, đối với vi khuẩn Salmonella spp là 21mm

Kết quả nghiên cứu của Anzana et al (2013) đối với E coli, dịch chiết của lá

cây Huyền diệp ở nồng độ 125 mg/ml trong 03 loại dung môi methanol, chloroform

và hexane đều có khả năng diệt khuẩn in vitro tốt, đều đạt độ mẫn cảm cao theo tiêu

chuẩn của CLSI với đường kính vòng vô khuẩn ≥ 20 mm Đường kính vòng vô

khuẩn của dịch chiết đối với vi khuẩn E coli biến đổi không nhiều từ 24,16mm

(dung môi chloroform) đến 27,6mm (với dung môi là hexane)

Theo nghiên cứu của Tripta và Kanika (2011) dịch chiết cây Huyền diệp

trong 06 loại dung môi có tác dụng diệt khuẩn in vitro đối với vi khuẩn nhưng

đường kính vòng vô khuẩn biến đổi mạnh Khi sử dụng dung môi là chloroform

đường kính vòng vô khuẩn đạt 23,0 mm với Salmonella spp và chỉ đạt 20 mm đối với E coli nhưng vẫn đạt độ mẫn cảm cao

Theo những kết quả nghiên cứu trên, khả năng ứng dụng kháng sinh thảo dược nói chung và cây Huyền diệp nói riêng để phòng và điều trị bệnh trong Thú y

là có cơ sở khoa học và rất có tiềm năng

2.4 Bệnh viêm ruột tiêu chảy trên chó

Bệnh viêm ruột tiêu chảy là bệnh phổ biến ở chó, bệnh xảy ra quanh năm nhưng thường thấy nhiều vào mùa Xuân và mùa Hạ khi thời tiết ấm áp và độ ẩm tăng cao Qua theo dõi dịch bệnh của chó khu vực Hà Nội, thấy khoảng 80% số chó

bị chết là do mắc bệnh dạ dày và ruột cấp tính (Nguyễn Văn Thành, 2012) Có rất nhiều nguyên nhân gây ra bệnh viêm ruột tiêu chảy trên chó ngoài các nguyên nhân

do các bệnh truyền nhiễm như Carê, viêm ruột tiêu chảy do Parvovius một trong

những nguyên nhân gây bệnh chính là vi khuẩn E coli và Salmonella spp (Nguyễn

Tuyết Thu, 2008; Nguyễn Văn Thanh và Nguyễn Tuyết Thu, 2008)

2.4.1 Định nghĩa bệnh viêm ruột tiêu chảy

Tiêu chảy là một thuật ngữ diễn tả biểu hiện lâm sàng hội chứng bệnh lý đặc thù của bệnh đường tiêu hoá Bệnh viêm ruột tiêu chảy phổ biến ở các loài gia súc đặc biệt là gia súc non Bệnh có quanh năm, nhưng thường xảy ra vào mùa Xuân, mùa Hạ khi thời tiết nóng và ẩm ướt Fairbrother (1992) đã nhận xét, tiêu chảy là một bệnh gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi trên thế giới Bệnh tiêu chảy là hiện tượng ỉa nhanh, nhiều lần, trong phân có nhiều nước do ruột tăng cường co bóp (Tạ Thị Vịnh, 1991) Theo David McClugage (2005), ỉa chảy theo nghĩa hẹp là ỉa phân lẫn nước Song trong thực tế định nghĩa này rộng hơn, bao gồm phân nhão hơn bình thường, có khi phân lẫn rất nhiều nước, phân rất lỏng, phân có màu sắc khác thường

Bệnh viêm ruột tiêu chảy xảy ra ở nhiều loài trong đó có chó con (David MacClugage, 2005) Chó non dưới 6 tháng tuổi khi mắc bệnh sẽ chết với tỷ lệ rất cao (60-70%) Đặc trưng của chó mắc bệnh trong tuần đầu tiên là tỷ lệ chết rất cao Chó thường bị suy sụp nhanh, yếu, giảm nhiệt độ, mất nước và chất điện giải gây

triệu chứng thần kinh rồi chết E coli cũng có thể qua hàng rào biểu mô ruột từ 48 -

72 giờ sau khi sinh Ngay sau đó, các tế bào biểu mô ruột cũng ngừng hấp thu Glubulin miễn dịch (Fairbrother JM, 1992)

2.4.2 Nguyên nhân gây bệnh viêm ruột tiêu chảy

Nguyên nhân của ỉa chảy rất phức tạp, đã có rất nhiều tác giả dày công nghiên cứu nguyên nhân của hội chứng tiêu chảy Tuy nhiên tiêu chảy là một hiện tượng bệnh lý, có liên quan đến rất nhiều yếu tố, có yếu tố là nguyên nhân tiên phát,

có yếu tố là nguyên nhân thứ phát Vì vậy, việc xác định đâu là nguyên nhân gây tiêu chảy chỉ mang tính chất tương đối Song dù bất cứ nguyên nhân nào gây tiêu chảy cũng dẫn đến hậu quả là gây viêm nhiễm, tổn thương thực thể đường tiêu hoá

và cuối cùng là một quá trình nhiễm trùng

Theo Trịnh Văn Thịnh (1964), Vũ Văn Ngữ (1979), do một tác nhân nào đó, trạng thái cân bằng của khu hệ vi sinh vật đường ruột bị phá vỡ, tất cả hoặc chỉ một loài nào đó sinh sản lên quá nhiều sẽ gây ra hiện tượng loạn khuẩn Nguyễn Vĩnh

Phước và cộng sự (1970) cho biết: khi sức đề kháng của cơ thể giảm sút, vi khuẩn gây thối là nguồn gây bệnh đường ruột

Các nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tiêu chảy ở chó bao gồm nguyên nhân do

vi khuẩn, nguyên nhân do virus, do ký sinh trùng hay đơn giản do thời tiết khí hậu, chế độ chăm sóc nuôi dưỡng Chiocco D và cộng sự (1990), Đoàn Băng Tâm (1987), cho biết: mầm bệnh trong tự nhiên xâm nhập vào cơ thể động vật chủ yếu thông qua thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn

Nguyên nhân do điều kiện ngoại cảnh: Điều kiện khí hậu thay đổi đột ngột,

quá nóng, quá lạnh, mưa gió, ẩm ướt… kết hợp với chuồng trại không hợp vệ sinh Niconxki V.V (1986), Hồ Văn Nam và cộng sự (1997) cho biết: khi gia súc bị lạnh

ẩm ướt kéo dài sẽ làm giảm phản ứng miễn dịch, giảm tác dụng thực bào do đó gia súc dễ bị vi khuẩn sẵn có trong đường ruột có cơ hội bội nhiễm, tăng cường độc lực gây bệnh

Nguyên nhân do chế độ chăm sóc nuôi dưỡng: Thức ăn có chất lượng kém,

ôi thiu, khó tiêu hoá là nguyên nhân gây tiêu chảy ở gia súc Thức ăn thiếu các chất khoáng, Vitamin cần thiết cho cơ thể gia súc, đồng thời phương thức cho ăn không phù hợp sẽ làm giảm sức đề kháng của cơ thể gia súc và tạo cơ hội cho các vi khuẩn gây ra hội chứng tiêu chảy (Laval A, 1997)

Nguyên nhân stress: Trong đời sống hàng ngày có các tác nhân ngoại cảnh tác động, gia súc cũng xuất hiện tiêu chảy hàng loạt, mà trước đó không hề có dấu

hiệu này Có nhiều tác giả cho đó là hậu quả tất yếu của Stress Hệ thống tiêu hoá (dạ dày và ruột) mẫn cảm đặc biệt với Stress (Phạm Khắc Hiếu, 1998) Stress gây

nên hiện tượng chán ăn, nôn mửa, tăng nhu động ruột, có khi tiêu chảy, đau bụng

Nguyên nhân ký sinh trùng: Theo Phạm Văn Khuê, Phan Lục (1996) các loại ký sinh trùng đường ruột gây tổn thương niêm mạc ruột cũng là một nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy Các loài kí sinh trùng thường gặp ở chó: sán dây gồm có

Teania kydatiggena, Teania fisiformis, Dipilidium canium…; các loài giun đũa

Toxocara canis … Đặc biệt là giun móc Ancylostoma canium có những móc nhọn

bằng kitin cắm vào ruột non phần tá tràng, không tràng để hút máu gây tổn thương, làm xuất huyết ruột tạo điều kiện cho các vi sinh vật xâm nhập gây viêm ruột tiêu

chảy Các đơn bào kí sinh như: Amip Entaoeba hystotitica gây bệnh lị, trùng roi Giardia intestinalis

Nguyên nhân nấm mốc: Độc tố nấm mốc rất đa dạng và phong phú, nhưng

chúng đều là sản phẩm của sự chuyển hoá thứ cấp trong quá trình phát triển của một loài, mỗi chủng nấm mốc nhất định (Butler E., Crisan E.V 1977) Bản chất của độc tố nấm mốc là polypeptide, các hợp chất quinol, các hợp chất có nhân piron Trong các

loại độc tố nấm mốc thì Aflatoxin là loại độc tố được quan tâm nhiều nhất hiện nay

Nấm mốc và độc tố do chúng sản sinh ra đã gây thiệt hại đáng kể cho chăn nuôi và ảnh hưởng đến sức khoẻ của con người, những độc tố nấm mốc có hại cho

con người và gia súc là Aflatoxin, Ochratoxin, Sterigmato cystin gây độc và gây ung thư gan, nhóm gây độc đường tiêu hoá là các độc tố Trichothecens, T2toxin Diacetocyscirpenol, Nivalenol

Độc tố nấm mốc với hàm lượng cao có thể gây chết hàng loạt gia súc, với

biểu hiện là nhiễm độc đường tiêu hoá, gây tiêu chảy dữ dội, mà thường người ta không nghĩ đến nguyên nhân này, nên mọi phác đồ điều trị bằng kháng sinh đều không hiệu quả Ngoài việc gây tiêu chảy cho gia súc, độc tố nấm mốc còn gây độc trực tiếp cho người từ thực phẩm bị nhiễm nấm mốc hoặc gián tiếp từ độc tố tồn dư

trong thực phẩm

Nguyên nhân do virus: Theo Trần Thanh Phong (1996) gây tiêu chảy ở chó thường gặp ở các bệnh do virus như bệnh Carré do virus Carré thuộc họ Paramyxoviridae, giống Morbilivirus Bệnh xảy ra chủ yếu ở chó từ 2 đến 4 tháng tuổi, đặc biệt nhiều nhất ở chó 3 đến 4 tháng tuổi Bệnh viêm ruột ở chó do Coronavirus Hai loại virus này gây tiêu chảy cấp tính, phân nhiều nước, chó sốt cao nhanh chết Bệnh Parvo do virus thuộc họ Parvoviridae, giống Parvovirus; bệnh gây chết nhiều ở chó non; chó lớn tỷ lệ chết thấp nhưng là nguồn trữ virus gây bệnh với đặc trưng của bệnh là sốt nhẹ kéo dài, tiêu chảy có máu hồng và cả máu tươi

Nguyên nhân do vi khuẩn: Một trong số những bệnh phổ biến và gây nhiều

thiệt hại cho chăn nuôi chó là viêm ruột tiêu chảy do vi khuẩn; Bệnh xảy ra ở mọi

Trong lĩnh vực vi sinh vật, có nhiều nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy, tuy nhiên bất cứ nguyên nhân nào dẫn đến tiêu chảy, tác nhân phổ biến nhất vẫn là vi khuẩn, hoặc với vai trò kế phát, hoặc nguyên phát (Nguyễn Bá Hiên, 2001) Ở điều

kiện bình thường có thể phát hiện Salmonella trong đường ruột của nhiều loài gia

súc, gia cầm; khi sức đề kháng của động vật bị giảm sút, vi khuẩn xâm nhập vào nội tạng và gây bệnh (Nguyễn Như Thanh và cộng sự., 2001)

Trong đường ruột của động vật có rất nhiều vi khuẩn, chúng được gọi là “vi khuẩn chí đường ruột” Chúng tồn tại ở một trạng thái cân bằng với nhau và với cơ thể vật chủ Do một nguyên nhân nào đó dẫn đến trạng thái cân bằng của khu hệ vi sinh vật bị phá vỡ, tất cả hoặc chỉ có một loại nào đó sản sinh lên quá nhiều, gây hiện tượng loạn khuẩn (Vũ Văn Ngữ và cộng sự., 1979) Loạn khuẩn là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến bệnh ở đường tiêu hoá, đặc biệt là gây tiêu chảy

Bệnh viêm ruột tiêu chảy ở chó diễn ra theo 2 quá trình, đầu tiên là rối loạn tiêu hoá, sau đó là quá trình nhiễm trùng Giai đoạn đầu, thường do các yếu tố bất lợi như gặp lạnh đột ngột, phẩm chất thức ăn kém, các stress có hại: nóng, lạnh, ẩm… làm cơ năng tiêu hoá ở đường ruột bị rối loạn, thức ăn không được tiêu hoá sẽ lên men, phân giải các chất hữu cơ sinh ra chất độc như Indol, Scatol, H2S… Các sản phẩm độc này làm cho pH trong đường ruột thay đổi gây trở ngại về tiêu hoá và hấp thu trong đường ruột (Hồ Văn Nam và cộng sự., 1997; Sử An Ninh, 1993; Đào Trọng Đạt và cộng sự., 1996; Phạm Khắc Hiếu, 1998 Những chất độc này tác động lên niêm mạc ruột gây xung huyết, tăng nhu động ruột gây tiêu chảy Giai đoạn tiếp theo, trong điều kiện rối loạn tiêu hoá, những vi khuẩn trong đường ruột gặp điều kiện thuận lợi, sinh sôi nảy nở Chúng phát triển nhanh về số lượng làm phá vỡ trạng thái cân bằng của khu hệ vi sinh vật đường ruột, các vi khuẩn có lợi giảm đi, thay vào đó là vi khuẩn có hại Các vi khuẩn này sẽ tăng cường độc lực, sản sinh độc tố tác động vào niêm mạc ruột gây tình trạng bệnh lý trầm trọng thêm

Cho đến nay, các nhà khoa học ở nhiều nước đã xác nhận ngoài các nguyên nhân do các bệnh truyền nhiễm như Carê, viêm ruột tiêu chảy do Parvovius một

trong những nguyên nhân gây bệnh chính là vi khuẩn E coli và Salmonella spp

(Manager, Janos mocsy dẫn theo Đào Trọng Đạt, 1997; Nguyễn Tuyết Thu, 2008; Nguyễn Văn Thanh và Nguyễn Tuyết Thu, 2008)

2.4.3 Một số nghiên cứu về vi khuẩn gây hội chứng tiêu chảy trên chó

Cơ chế gây bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi khuẩn

Các vi sinh vật gây bệnh không giống hệ vi khuẩn cư trú thường xuyên trong đường ruột, thường do một nguyên nhân nào đó các vi khuẩn phát triển nhanh chóng cả về số lượng và độc lực Một số loại vi khuẩn có khả năng xâm nhập vào lớp tế bào biểu mô, ở đây chúng phát triển nhanh về số lượng kích thích các tế bào gây viêm, dịch rỉ viêm tiết ra đi vào khoang ruột làm tăng áp lực kích thích gây tiêu chảy Phần lớn là do các vi khuẩn độc lực tăng lên mạnh, chúng tiết ra các loại độc tố Khi các độc tố được tiết ra, nó gây kích thích các AMP vòng nội bào, chất này làm tăng tiết Cl- và giảm hấp thu Na+, áp lực thẩm thấu thu hút nước vào trong xoang ruột tạo ra áp lực lớn trong ống tiêu hoá kích thích gây tiêu chảy Hậu quả là một lượng nước lớn cùng với các chất điện giải mất đi theo phân (Craige E Green, 1984)

Vi khuẩn E Coli, đây là nhóm vi khuẩn rất phong phú sống hoại sinh ở khu

vực ruột già trong đường tiêu hoá của chó và tất cả những động vật máu nóng Trong đó, nhiều chủng gây dung huyết và gây bệnh đường tiêu hoá Bệnh ở chó

thường do những E.coli có kháng nguyên O và K chiếm ưu thế Các chủng E.coli

sản sinh độc tố Shiga-toxin, loại độc tố này thường phân lập được ở lợn mắc bệnh phù đầu (Beutin, 1999 - trích dẫn theo David Mc Clugage, D.V.A.,C.V.A 2005)

Theo Galton và cộng sự (1952), ở chó đã tìm thấy các chủng Salmonella enteritidis ; S paratyphy A, B; S typhimuriusm Nhóm vi khuẩn này có nhiều

serotype khác nhau Chúng là tác nhân gây bệnh cho hầu hết các loài động vật có vú

kể cả con người Chó có thể nhiễm khuẩn do uống phải nước bẩn hoặc thức ăn bị nhiễm vi khuẩn (thức ăn sống không qua chế biến)

Khi chó ăn uống phải thức ăn và nước uống nhiễm khuẩn, vi khuẩn sẽ phát triển trong niêm mạc đường tiêu hoá gây ra bệnh viêm dạ dày và ruột cấp Bệnh lây nhiễm trực tiếp từ chó bệnh sang chó khoẻ qua đường tiêu hoá Chó khoẻ ăn, uống phải vi khuẩn gây bệnh từ thức ăn và phân của chó ốm thải ra sẽ mắc bệnh; chó bệnh thể hiện các triệu chứng điển hình: vài ngày đầu chó ăn ít hoặc bỏ ăn, sốt

Salmonella, chó sốt cao 400C – 41,50C kèm theo các cơn run rẩy; sau đó nôn mửa liên tục, uống nước cũng nôn, đồng thời ỉa chảy dữ dội, phân lúc đầu táo sau lỏng

có màu vàng xám, có lẫn niêm mạc của dạ dày và ruột lầy nhầy, có mùi rất tanh Do nôn mửa và tiêu chảy liên tục, chó bị mất nước nhanh nếu không điều trị kịp thời sẽ chết sau một vài ngày (Phạm Sỹ Lăng và cộng sự., 1993)

Theo nghiên cứu của Lloyd và cộng sự (1996), khi kiểm tra kháng sinh đồ trên 2296 chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu bệnh phẩm chó, cho thấy tỷ lệ kháng với kháng sinh tăng mạnh theo thời gian cụ thể với penicillin tăng từ 69% năm 1980 lên 89% năm 1996 Theo nghiên cứu của Normand và cộng sự năm 2000 tại Vương

quốc Anh cũng thấy xu hướng tăng lên đáng kẻ của vi khuẩn E coli kháng thuốc

với kháng sinh amoxiclav và streptomycin

Tại Pháp, một nghiên cứu được tiến hành tại Trường đại học Thú y Quốc gia

tại Nantes cho thấy tỷ lệ vi khuẩn kháng đa kháng (> 3 thuốc) chủng S intermedius

tăng từ 11% trong giai đoạn 1986-1987 đến 28% trong giai đoạn 1995-1996 (Pellerin et al., 1998) Tương tự như vậy, cũng phát hiện thấy sự tăng sức đề kháng với penicillin, neomycin, sulphonamide, co-trimoxazole và erythromycin của vi

khuẩn S Intermedius phân lập từ những con chó ở Thụy Sỹ (Wissing et al., 2001)

Chương trình giám sát quốc gia về kháng kháng sinh ở động vật tại Thụy Điển, đã công bố tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh ở vi khuẩn S intermedius và E Coli

phân lập ở chó bệnh tăng lên nhanh từ năm 1992 đến năm 2002 Cụ thể vi khuẩn S intermedius phân lập kháng macrolide, lincosamide và tetracycline tăng từ 18% lên

30%, vi khuẩn E coli phân lập được kháng với ampicillin, streptomycin,

tetracycline và sulphonamide / trimethoprim tăng từ 11 lên 24% (SVARM 2002, 2003)

Sự xuất hiện của đa kháng của vi khuẩn S Typhimurium (DT104) ở chó và

mèo đã được công bố ở Anh (Wall et al., 1996; Low et al., 1996), ở Đức (Frech et al., 2003),và tại Mỹ (Centers for Disease Control and Prevention, 2001) Các chủng này thường kháng với ít nhất năm loại kháng sinh, bao gồm ampicillin, chloramphenicol, streptomycin, sulphonamide và tetracycline Một nghiên cứu trên diện rộng trên 6589 chó tiêu chảy ở Hà Lan cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn

Salmonella trong 69% chó bệnh Trong đó 53% kháng cefalexin, 37% kháng tetracycline, 14% kháng amoxicillin, 6% kháng Sulfonamit và trimethoprim, 4%

kháng enrofloxacin (Duijkeren, Houwers, 2002) Chủng vi khuẩn S Typhimurium

DT104 đa kháng (với đặc điểm kiểu hình penta-resistance) tiềm năng là nguồn gây bệnh cho động vật khác và người

Theo nghiên cứu của Zhao và cộng sự năm 2003 Salmonella enterica serotype Newport isolates đã kháng lại ít nhất 9 loại kháng sinh (bao gồm

cả cephalosporins) gây bệnh trên cả động vật và người ở Mỹ

Kết quả nghiên cứu của Sanchez và cộng sự năm 2002 bệnh viện Thú y Đại học Georgia đã phân lập được chủng vi khuẩn E.coli từ chó đã kháng 12 loại thuốc

kháng sinh Vi khuẩn E.coli kháng chủ yếu với các nhóm cephalosporins,

β-lactams, tetracycline, spectinomycin, sulfonamides, chloramphenicol và gentamicin

Trong phân chó bị tiêu chảy 02 loại vi khuẩn là E Coli và Salmonella spp

có sự tăng mạnh về số lượng so với phân chó không bị bệnh Vi khuẩn phân lập được từ phân chó bị mắc bệnh có độ mẫn cảm không cao với các loại kháng sinh thông dụng (Lê Hồng Vinh, 2006; Nguyễn Thị Tuyết Thu, 2008)

Nghiên cứu của Nguyễn Văn Thành (2012) cũng cho có kết quả tương tự, khi chó bị tiêu chảy thì các loại vi khuẩn đường ruột tăng mạnh về số lượng Đáng

chú ý ở đây là sự thay đổi của Salmonella Số lượng Salmonella trong 1g phân của

chó bị bệnh tăng gấp 31,82 lần so với bình thường Mức độ mẫn cảm của tập đoàn

vi khuẩn có trong phân chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy với thuốc kháng sinh là không cao Trong 17 loại kháng sinh thí nghiệm chỉ có 4 loại thuốc là Cephaclor, tiếp tới là Neomycin, Norfloxacin và Cephalexin là có tỷ lệ vi khuẩn mẫn cảm từ trên 85,00% trở lên và đường kính vòng vô khuẩn đạt trên 23mm

PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm bộ môn Ngoại Sản Khoa thú y,

Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật Khoa CNSH, Trung tâm Nghiên cứu Chó nghiệp vụ Khoa thú y, Học Viện Nông nghiệpViệt Nam

Địa điểm thu mẫu: vườn dược liệu Khoa thú y – Học Viện Nông

nghiệpViệt Nam

Thời gian: từ 08/2013 đến 9/2014

3.2 Đối tượng nghiên cứu

3.2.1 Lá cây Huyền diệp

Mẫu lá cây Huyền diệp được thu hái từ tháng 08/2013

Mẫu lá đã được PGS.TS Bùi Thị Tho giảng viên của Bộ môn Nội - Chẩn - Dược - Độc chất, Khoa thú y, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam giám định

Thu hái lá bánh tẻ ở những cây trên 5 năm tuổi cách mặt đất lớn hơn 1,5 m

Lá có hình mác dài, nhọn đầu, mặt lá trơn bóng, mặt trên đậm hơn mặt dưới và không bị sâu Thu lá sạch vào những ngày khô ráo, khoảng từ 7 – 10 giờ sáng

Lá tươi thu hái về được rửa dưới vòi nước sạch (2-3 lần) rồi rửa với nước cất,

lá dược liệu được được sấy khô ở 400C

Lá khô được nghiền thành bột mịn (<0,5mm) Bột lá đựng trong túi nilon bảo quản trong bình hút ẩm

3.2.2 Vi khuẩn nghiên cứu

+ Vi khuẩn E coli và Salmonella spp phân lập từ phân chó bị viêm ruột tiêu

chảy được cung cấp từ phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam (LAS – NN54; ISO 17025:2005)

+ Vi khuẩn E coli Top 10 chứa plasmid pJET 1.2/blunt có gen kháng ampicillin của hãng Fermetas (E coli Top 10 pJET 1.2/blunt) và vi khuẩn E coli

Top 10 chứa plasmid pPS1 có gen kháng kanamycin của Cornell University (E coli Top 10 pPS1), được bảo quản trong tủ -800C, do Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật, Học viện Nông nghiệp Việt Nam cung cấp

3.2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm

Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị sử dụng trong quá trình thí nghiệm gồm có:

- Buồng cấy vô trùng, tủ sấy, tủ ấm, nồi hấp khử trùng, lò nung, bếp điện, bếp cách thủy, cân phân tích, máy nghiền, máy cô quay chân không

- Các dụng cụ thủy tinh dùng trong quá trình thí nghiệm gồm có: Bình tam

giác 100ml, 250ml, cốc thủy tinh loại 100ml, loại 250ml, pipet, đũa thủy tinh, lọ đựng mẫu, giá thí nghiệm, bình đựng mức 10ml, 100ml…

- Các dụng cụ khác: Giấy lọc, vải màn, phễu lọc

Hóa chất

Các dung môi chiết xuất: Ethyl acetate, chlorofom, nước cất, ethanol, ether dầu Kháng sinh: Bột ampicillin và streptomycin sulfat nguyên chất; Giấy tẩm kháng sinh thông dụng như: Ampicillin, penicillin, streptomycin do công ty TNHH Nam Khoa cung cấp

Dung môi pha chất tan: Dimethyl sulfoxide (DMSO)

Các hóa chất định tính xác định một số nhóm hợp chất trong dịch chiết lá cây Huyền diệp

Bảng 3.1 Thành phân môi trường LB (Luria Bertani) lỏng

+ Môi trường Luria–Bertani (LB) dạng lỏng, được hấp tiệt trùng trong các

bình tam giác

+ Môi trường LB rắn, được hấp tiệt trùng để nguội tới 400- 500C, đổ vào đĩa petri có đường kính 10 cm, với độ dày là 4 ± 0,2 mm

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Kiểm tra kháng sinh đồ của 02 chủng vi khuẩn Salmonella spp, E coli

được cung cấp với 14 kháng sinh thông dụng trong thú y Nhằm xác định tính mẫn cảm và tính kháng thuốc của 02 chủng vi khuẩn nói trên

- Chọn dung môi thích hợp để tách chiết các hoạt chất từ lá Huyền diệp bằng phương pháp ngâm trong dung môi và cô quay chân không So sánh hiệu suất tách chiết của các dung môi

- Định tính xác định một số nhóm hoạt chất hòa tan trong các dịch chiết lá cây Huyền diệp

- Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của các dịch chiết đối với vi khuẩn thử nghiệm (E coli, Salmonella spp.)

- Đánh giá khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết trên vi khuẩn E coli

có chứa plasmid mang gen kháng kháng sinh

- Đánh giá khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết lá Huyền diệp khi

pha loãng

- Sử dụng dịch chiết lá Huyền diệp điều trị thử nghiệm trên chó bị bệnh tiêu chảy

3.4 Phương pháp nghiên cứu

+ Phương pháp thu dịch chiết lá cây Huyền diệp: Bột lá huyền diệp được

chiết với các dung môi bằng phương pháp ngâm chiết ở nhiệt độ phòng với cùng một tỷ lệ (20g bột lá khô/200ml dung môi), mỗi ngày được lắc đảo 2 lần Sau 72 giờ thu dịch chiết lọc qua vải màn và giấy lọc Whatman No.1 Thu dịch chiết đem cô quay hút chân không để loại bỏ hoàn toàn dung môi Tới khi khối lượng của bình cô quay không đổi đem cân để tính hiệu suất tách chiết của các dung môi Cao cô toàn phần đã loại bỏ hết dung môi bảo quản trong tủ mát 40C để thử hoạt tính và khả năng diệt khuẩn

+ Phương pháp định tính xác định một số nhóm hợp chất có trong lá Huyền diệp:

Định tính saponin trong dược liệu bằng cách quan sát hiện tượng tạo bọt: Bột dược liệu (0,1g) được cho vào ống nghiệm, rồi thêm 5ml nước Lắc mạnh trong

5 phút Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì

sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin

Định tính flavonoid

● Phản ứng với kiềm: Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc Hơ khô rồi để lên

miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút, sẽ thấy màu vàng của vết dịch chiết được

tăng lên Nhỏ một giọt khác làm chứng

● Phản ứng với FeCl 3 : Dịch chiết (1ml) được cho vào ống nghiệm Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% Nếu xuất hiện kết tủa xanh đen thì kết luận có flavonoid

Định tính tanin

● Tác dụng với dung dịch FeCl 3 5%: Dịch chiết (2ml) được cho vào ống nghiệm rồi thêm 2 giọt FeCl3 5% Nếu xuất hiện màu hoặc kết tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt thì kết luận có tanin trong dịch chiết

● Tác dụng với dung dịch gelatin 1%: Dịch chiết (2ml) được cho vào ống

nghiệm chứa 5ml gelatin 1% Nếu xuất hiện tủa bông trắng thì kết luận có tanin

Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung

● Tác dụng với thuốc thử Mayer: Dịch chiết (5ml) cho vào ống nghiệm

rồi nhỏ vào từ từ thuốc thử Mayer vào, nếu có alkaloid sẽ cho tủa màu từ trắng đến vàng

● Tác dụng với thuốc thử Bouchardat: Dịch chiết (5ml) cho vào ống nghiệm rồi nhỏ từ từ thuốc thử Bouchardat vào nếu có alkaloid sẽ cho tủa nâu đến đỏ nâu

● Tác dụng với thuốc thử Dragendorff: Dịch chiết (5ml) cho vào ống nghiệm rồi nhỏ vào từ từ thuốc thử Dragendorff vào nếu có alkaloid sẽ cho tủa vàng cam

đến đỏ

Định tính carotenoid: Thêm vào dịch chiết (5ml) vài giọt H2SO4 đậm đặc Dung dịch có màu xanh dương → Có carotenoid

định chất béo, sấy nhẹ cho hết dung môi, hết mùi tinh dầu (nếu có) Chỗ nhỏ để lại vết mờ → Có chất béo

Định tính phytosterol: Dịch chiết (2ml) được cho vào ống nghiệm Nhỏ hỗn

hợp dung dịch axit anhydric acetic + H2SO4 Nếu màu xanh nhạt xuất hiện là dương tính phytosterol

Định tính polyphenol: Cao khô (0,5g) được cho vào ống nghiệm, thêm 2ml

nước cất và hòa tan đều Nhỏ vào mỗi ống 1ml FeCl3 2%, lắc đều Dung dịch

chuyển sang màu xanh đen chứng tỏ có polyphenol

Định tính đường khử: Cao khô (0,5g) được cho vào ống nghiệm, thêm 2ml

nước cất và hòa tan đều Nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Fehling vào ống, nếu có kết tủa đỏ

gạch chứng tỏ có đường khử

Định tính chất nhầy: Dịch chiết (2ml) được cho vào ống nghiệm rồi thêm 2 giọt chì acetat 10% nếu xuất hiện kết tủa bông thì kết luận có chất nhầy

+ Phương pháp pha dịch chiết nồng độ 100mg/ml: Lấy 1g cao cô toàn phần

pha với 10ml Dimethyl sulfoxide (DMSO), dùng đũa thủy tinh khuấy tan hoàn toàn

ta được dung dịch có nồng độ 100mg/ml

+ Nuôi cấy vi khuẩn E coli, Salmonella spp trên môi trường rắn và lỏng: Vi

khuẩn được cấy vạch trong môi trường LB đặc, trên đĩa petri ủ 370C/24 giờ, chọn khuẩn lạc đơn điển hình Khuẩn lạc đơn được nuôi cấy trong bình tam giác với môi trường LB lỏng, ủ ở 370C, với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 12 - 14h; thu dịch khuẩn (mật độ vi khuẩn phải đạt 108 tế bào/ml là đạt chuẩn)

+ Xác định mật độ vi khuẩn: Mật độ vi khuẩn sau khi nuôi cấy trong môi

trường LB lỏng được xác định theo phương pháp đo mật độ quang ở λ= 600ɳm

+ Kiểm tra tính mẫm cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch sử dụng giấy tẩm kháng sinh: Bằng phương pháp

kháng sinh đồ khuếch tán trên đĩa thạch và đánh giá kết quả theo tiêu chuẩn CLSI

2010 (Bảng 3.3)

Bảng 3.3 Bảng tiêu chuẩn đánh giá khả năng mẫn cảm và kháng thuốc

của vi khuẩn [tiêu chuẩn CLSI 2010]

Giới hạn đường kính vùng ức chế (mm)

Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng Khi mật độ vi khuẩn đạt

108 tế bào/ml, lắc đều bình chứa vi khuẩn, dùng pipetman hút 100µl canh khuẩn nhỏ vào giữa đĩa thạch, dùng que thủy tinh tráng đều cho đến khi mặt thạch khô Sau 15 phút đục lỗ trên mặt thạch với đường kính 6mm/lỗ, đục cách nhau khoảng 30mm Mỗi lỗ thạch, nhỏ 100µl dịch chiết, đặt đĩa vào tủ ấm ở 370C/24 giờ đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn, rồi tính số bình quân

+ Phương pháp pha loãng các nồng động cao: Chuẩn bị sẵn 10 ống nghiệm

sạch, vô trùng, cho vào mỗi ống 5 ml DMSO, đánh số thứ tự từ 1 đến 10 Ống nghiệm 1, được cho thêm 5ml dung dịch cao lỏng nồng độ 100mg/ml

Trộn đều dịch chiết trong ống nghiệm 1, sau đó hút 5 ml chuyển sang ống nghiệm 2, trộn đều; chuyển tiếp 5 ml từ ống nghiệm 2 sang ống nghiệm 3, trộn đều;… đến ống nghiệm thứ 10, trộn đều và bỏ đi 5 ml

Hình 3.1 Hệ nồng độ pha loãng cao đặc để xác định nồng độ tối thiểu tác

dụngtrên vi khuẩn thử nghiệm

+ Phương pháp điều trị thử nghiệm:

Lô 1 (15 chó) được điều trị bằng thuốc kháng sinh gentamycin theo phác đồ I (Gentamycin 5 mg/kg thể trọng, cho uống ngày 2 lần; Primerance 0,1%: 2 ml tiêm dưới da, ngày 1 lần; Vitamin B1 2,5% 5ml/con/ngày, Vitamin B12 0,05% 3ml/con/ngày, tiêm bắp; Dung dịch sinh lý mặn/ngọt đẳng trương 15ml/kgP/ngày truyền chậm tĩnh mạch, ngày truyền 1 lần;Hộ lý chăm sóc để chó nơi yên tĩnh, khô ráo, thoáng mát, sạch sẽ Cho chó nghỉ ngơi, không cho chó ăn thức ăn tanh, kiêng

mỡ, cho ăn cháo loãng tới khi khỏi bệnh)

Lô 2 được điều trị theo phác đồ II, bằng dịch chiết lá cây Huyền diệp trong dung môi chloroform với liều lượng 50mg/kg thể trọng, các thuốc bổ trợ, thời gian điều trị, chế độ hộ lý chăm sóc nuôi dưỡng giống như phác đồ I

Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ khỏi (phân chó thành khuôn, các chỉ tiêu lâm sàng (thân nhiệt, tần số hô hấp và tần số tim đập) trở lại bình thường) và thời gian điều trị

+ Phương pháp xử lý số liệu: Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và được

lặp lại 3 lần Số liệu thu được xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Excel 2007

Để thực hiện các nội dung của đề tài, chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo sơ

đồ (Hình 3.2)

Hình 3.2 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm

Định tính một

số nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học trong các dịch chiết

Đánh giá khả năng diệt khuẩn

in vitro của dịch chiết trên vi

khuẩn E coli có

chứa plasmid mang gen kháng kháng sinh

Đánh giá khả năng diệt khuẩn

dịch chiết lá Huyền diệp khi pha loãng

Ngâm trong Chlorofom

Ngâm trong Ether dầu

Ngâm trong

Ethanol

Ngâm trong nước Kiểm tra KSĐ của vi khuẩn thử nghiệm với 14 kháng sinh thông dụng

Sử dụng dịch chiết lá Huyền diệp điều trị thử nghiệm trên chó bị bệnh tiêu chảy