ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.Phương pháp nghiên cứu
+ Phương pháp thu dịch chiết lá cây Huyền diệp: Bột lá huyền diệp được chiết với các dung môi bằng phương pháp ngâm chiết ở nhiệt độ phòng với cùng một tỷ lệ (20g bột lá khô/200ml dung môi), mỗi ngày được lắc đảo 2 lần. Sau 72 giờ thu dịch chiết lọc qua vải màn và giấy lọc Whatman No.1. Thu dịch chiết đem cô quay hút chân không để loại bỏ hoàn toàn dung môi. Tới khi khối lượng của bình cô quay không đổi đem cân để tính hiệu suất tách chiết của các dung môi. Cao cô toàn phần đã loại bỏ hết dung môi bảo quản trong tủ mát 40C để thử hoạt tính và khả năng diệt khuẩn.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23 + Phương pháp định tính xác định một số nhóm hợp chất có trong lá Huyền diệp:
Định tính saponin trong dược liệu bằng cách quan sát hiện tượng tạo bọt: Bột dược liệu (0,1g) được cho vào ống nghiệm, rồi thêm 5ml nước. Lắc mạnh trong 5 phút. Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt. Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin.
Định tính flavonoid
● Phản ứng với kiềm: Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút, sẽ thấy màu vàng của vết dịch chiết được tăng lên. Nhỏ một giọt khác làm chứng.
● Phản ứng với FeCl3: Dịch chiết (1ml) được cho vào ống nghiệm. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%. Nếu xuất hiện kết tủa xanh đen thì kết luận có flavonoid.
Định tính tanin
● Tác dụng với dung dịch FeCl3 5%: Dịch chiết (2ml) được cho vào ống nghiệm rồi thêm 2 giọt FeCl3 5%. Nếu xuất hiện màu hoặc kết tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt thì kết luận có tanin trong dịch chiết.
● Tác dụng với dung dịch gelatin 1%: Dịch chiết (2ml) được cho vào ống nghiệm chứa 5ml gelatin 1%. Nếu xuất hiện tủa bông trắng thì kết luận có tanin.
Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung
● Tác dụng với thuốc thử Mayer: Dịch chiết (5ml) cho vào ống nghiệm rồi nhỏ vào từ từ thuốc thử Mayer vào, nếu có alkaloid sẽ cho tủa màu từ trắng đến vàng.
● Tác dụng với thuốc thử Bouchardat: Dịch chiết (5ml) cho vào ống nghiệm rồi nhỏ từ từ thuốc thử Bouchardat vào nếu có alkaloid sẽ cho tủa nâu đến đỏ nâu.
● Tác dụng với thuốc thử Dragendorff: Dịch chiết (5ml) cho vào ống nghiệm rồi nhỏ vào từ từ thuốc thử Dragendorff vào nếu có alkaloid sẽ cho tủa vàng cam đến đỏ.
Định tính carotenoid: Thêm vào dịch chiết (5ml) vài giọt H2SO4 đậm đặc. Dung dịch có màu xanh dương → Có carotenoid.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24 định chất béo, sấy nhẹ cho hết dung môi, hết mùi tinh dầu (nếu có). Chỗ nhỏđể lại vết mờ→ Có chất béo.
Định tính phytosterol: Dịch chiết (2ml) được cho vào ống nghiệm. Nhỏ hỗn hợp dung dịch axit anhydric acetic + H2SO4. Nếu màu xanh nhạt xuất hiện là dương tính phytosterol.
Định tính polyphenol: Cao khô (0,5g) được cho vào ống nghiệm, thêm 2ml nước cất và hòa tan đều. Nhỏ vào mỗi ống 1ml FeCl3 2%, lắc đều. Dung dịch chuyển sang màu xanh đen chứng tỏ có polyphenol.
Định tính đường khử: Cao khô (0,5g) được cho vào ống nghiệm, thêm 2ml nước cất và hòa tan đều. Nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Fehling vào ống, nếu có kết tủa đỏ gạch chứng tỏ có đường khử.
Định tính chất nhầy: Dịch chiết (2ml) được cho vào ống nghiệm rồi thêm 2 giọt chì acetat 10% nếu xuất hiện kết tủa bông thì kết luận có chất nhầy.
+ Phương pháp pha dịch chiết nồng độ 100mg/ml: Lấy 1g cao cô toàn phần pha với 10ml Dimethyl sulfoxide (DMSO), dùng đũa thủy tinh khuấy tan hoàn toàn ta được dung dịch có nồng độ 100mg/ml.
+ Nuôi cấy vi khuẩn E. coli, Salmonella spp. trên môi trường rắn và lỏng: Vi
khuẩn được cấy vạch trong môi trường LB đặc, trên đĩa petri ủ 370C/24 giờ, chọn khuẩn lạc đơn điển hình. Khuẩn lạc đơn được nuôi cấy trong bình tam giác với môi trường LB lỏng, ủ ở 370C, với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 12 - 14h; thu dịch khuẩn (mật độ vi khuẩn phải đạt 108 tế bào/ml là đạt chuẩn).
+ Xác định mật độ vi khuẩn: Mật độ vi khuẩn sau khi nuôi cấy trong môi trường LB lỏng được xác định theo phương pháp đo mật độ quang ởλ= 600ɳm.
+ Kiểm tra tính mẫm cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch sử dụng giấy tẩm kháng sinh: Bằng phương pháp kháng sinh đồ khuếch tán trên đĩa thạch và đánh giá kết quả theo tiêu chuẩn CLSI 2010 (Bảng 3.3).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25
Bảng 3.3. Bảng tiêu chuẩn đánh giá khả năng mẫn cảm và kháng thuốc của vi khuẩn [tiêu chuẩn CLSI 2010]
STT Kháng sinh Hàm lượng Giới hạn đường kính vùng ức chế (mm) S I R 1 Penicillin (Pn) 10 µg ≥ 17 14-16 ≤ 13 2 Ampicillin (Am) 10 µg ≥ 17 14-16 ≤ 13 3 Amoxicillin (Ax) 10 µg ≥ 15 12-14 ≤ 11 4 Neomycin (Ne) 30 µg ≥ 16 12-15 ≤ 13 5 Gentamicin (Ge) 10 µg ≥ 15 13–14 ≤ 12 6 Amikacin (Ak) 30 µg ≥ 17 15–16 ≤ 14 7 Kanamycin (Kn) 30 µg ≥ 18 14–17 ≤ 13 8 Streptomycin (Sm) 10 µg ≥ 15 12–14 ≤ 11 9 Tetracycline (Te) 30 µg ≥ 15 12–14 ≤ 11 10 Doxycycline (Dx) 30 µg ≥ 14 11–13 ≤ 10 11 Norfloxacin (Nr) 10 µg ≥ 17 13–16 ≤ 12 12 Ofloxacin (Of) 5 µg ≥ 16 13–15 ≤ 12 13 Colistin (Co) 10 µg ≥ 11 - ≤ 10 14 Trimethoprim – Sulfamethoxazole (Bt) 1,25/23,75 µg ≥ 16 11–15 ≤ 10
Chú thích: S (Susceptible): Mẫn cảm cao; I (Intermediate): Trung gian; R (Resistant): Kháng.
+ Kiểm tra tác dụng diệt khuẩn của các dịch chiết bằng phương pháp kháng sinh đồ khuếch tán trên đĩa thạch của Kirby-Bauer.
Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Khi mật độ vi khuẩn đạt 108 tế bào/ml, lắc đều bình chứa vi khuẩn, dùng pipetman hút 100µl canh khuẩn nhỏ vào giữa đĩa thạch, dùng que thủy tinh tráng đều cho đến khi mặt thạch khô. Sau 15 phút đục lỗ trên mặt thạch với đường kính 6mm/lỗ, đục cách nhau khoảng 30mm. Mỗi lỗ thạch, nhỏ 100µl dịch chiết, đặt đĩa vào tủ ấm ở 370C/24 giờ đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn, rồi tính số bình quân.
+ Phương pháp pha loãng các nồng động cao: Chuẩn bị sẵn 10 ống nghiệm sạch, vô trùng, cho vào mỗi ống 5 ml DMSO, đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Ống nghiệm 1, được cho thêm 5ml dung dịch cao lỏng nồng độ 100mg/ml. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26 Trộn đều dịch chiết trong ống nghiệm 1, sau đó hút 5 ml chuyển sang ống nghiệm 2, trộn đều; chuyển tiếp 5 ml từ ống nghiệm 2 sang ống nghiệm 3, trộn đều;… đến ống nghiệm thứ 10, trộn đều và bỏđi 5 ml.
Hình 3.1. Hệ nồng độ pha loãng cao đặc để xác định nồng độ tối thiểu tác dụngtrên vi khuẩn thử nghiệm
+ Phương pháp điều trị thử nghiệm:
Lô 1 (15 chó) được điều trị bằng thuốc kháng sinh gentamycin theo phác đồ I (Gentamycin 5 mg/kg thể trọng, cho uống ngày 2 lần; Primerance 0,1%: 2 ml tiêm dưới da, ngày 1 lần; Vitamin B1 2,5% 5ml/con/ngày, Vitamin B12 0,05% 3ml/con/ngày, tiêm bắp; Dung dịch sinh lý mặn/ngọt đẳng trương 15ml/kgP/ngày truyền chậm tĩnh mạch, ngày truyền 1 lần;Hộ lý chăm sóc để chó nơi yên tĩnh, khô ráo, thoáng mát, sạch sẽ. Cho chó nghỉ ngơi, không cho chó ăn thức ăn tanh, kiêng mỡ, cho ăn cháo loãng tới khi khỏi bệnh).
Lô 2 được điều trị theo phác đồ II, bằng dịch chiết lá cây Huyền diệp trong dung môi chloroform với liều lượng 50mg/kg thể trọng, các thuốc bổ trợ, thời gian điều trị, chếđộ hộ lý chăm sóc nuôi dưỡng giống như phác đồ I.
Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ khỏi (phân chó thành khuôn, các chỉ tiêu lâm sàng (thân nhiệt, tần số hô hấp và tần số tim đập) trở lại bình thường) và thời gian điều trị
+ Phương pháp xử lý số liệu: Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần. Số liệu thu được xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Excel 2007.
Để thực hiện các nội dung của đề tài, chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ (Hình 3.2).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27 Hình 3.2. Sơđồ tiến hành thí nghiệm Định tính một số nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học trong các dịch chiết Đánh giá khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết trên vi khuẩn E. coli có chứa plasmid mang gen kháng kháng sinh Đánh giá khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết lá Huyền diệp khi pha loãng Đánh giá hiệu suất chiết xuất lá Huyền diệp của các dung môi. Thu dịch chiết. Lọc dịch chiết.
Cô quay tới khối lượng không đổi.
Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết đối với vi khuẩn thử nghiệm
Thu lá Huyền diệp, xử lý, nghiền
Bột lá huyền diệp (<0,5mm) Ngâm trong Ethyl acetate Ngâm trong Chlorofom Ngâm trong Ether dầu Ngâm trong Ethanol Ngâm trong nước Kiểm tra KSĐ của vi khuẩn thử nghiệm với 14 kháng sinh thông dụng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
PHẦN IV