- Các dụng cụ thủy tinh dùng trong quá trình thí nghiệm gồm có: bình tam
2.3. Phương pháp nghiên cứu
+ Thu dịch chiết lá, thân, rễ cây Mò hoa trắng: Bột lá, thân, rễ cây Mò hoa
trắng được chiết với ethanol 70%, bột thân cây Mò hoa trắng còn được chiết bằng các dung môi khác nhau (ethanol 35%, ethanol 70%, axit acetic 5% và aceton 70%) bằng phương pháp ngâm chiết ở nhiệt độ phòng với cùng một tỷ lệ (20g bột khô/200ml dung môi), mỗi ngày được lắc đảo 2 lần. Sau 72 giờ thu dịch chiết lọc
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22
qua vải màn và giấy lọc Whatman No.1. Thu dịch chiết đem cô quay hút chân không để loại bỏ hoàn toàn dung môi, tới khi khối lượng của bình cô quay không đổi. Cao cô toàn phần đã loại bỏ hết dung môi bảo quản ở 40C. Lấy 1g cao cô toàn phần pha với 10ml Dimethyl sulfoxide (DMSO), dùng đũa thủy tinh khuấy tan hoàn toàn ta được dung dịch có nồng độ 100mg/ml.
+ Nuôi cấy vi khuẩn E. coli, Salmonella spp. trên môi trường rắn và lỏng
Vi khuẩn được cấy vạch trong môi trường LB đặc, trên đĩa petri ủ 370C/24 giờ, chọn khuẩn lạc đơn điển hình. Khuẩn lạc đơn được nuôi cấy trong bình tam giác với môi trường LB lỏng, ủ ở 370C, với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 12 - 14h; thu dịch khuẩn (mật độ vi khuẩn phải đạt 108 tế bào/ml là đạt chuẩn).
+ Xác định mật độ vi khuẩn
Mật độ vi khuẩn sau khi nuôi cấy trong môi trường LB lỏng được xác định theo phương pháp đo mật độ quang ở λ= 600ɳm.
Mật độ vi khuẩn được xác định theo công thức:
[Số tế bào/ml] = OD600x(Hệ số chuyển đổi)x(Hệ số pha loãng) Trong đó: OD600 giá trị đo được ở bước sóng: λ=600 nm Hệ số chuyển đổi được mặc định là: 5x108
+Kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn thí nghiệm bằng phương pháp kháng sinh đồ khuyếch tán trên đĩa thạch và đánh giá kết quả theo tiêu chuẩn CLSI 2010 (Bảng 3.3).
+ Kiểm tra tác dụng diệt khuẩn của các dịch chiết bằng phương pháp kháng sinh đồ khuyếch tán trên đĩa thạch của Kirby-Bauer.
Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Khi mật độ vi khuẩn đạt 108 tế bào/ml, lắc đều bình chứa vi khuẩn, dùng pipetman hút 100µl canh khuẩn nhỏ vào giữa đĩa thạch, dùng que thủy tinh tráng đều cho đến khi mặt thạch khô. Sau 15 phút đục lỗ trên mặt thạch với đường kính 6mm/lỗ, đục cách nhau khoảng 30mm. Mỗi lỗ thạch, nhỏ 100µl dịch chiết, đặt đĩa vào tủ ấm ở 370C/24 giờ đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn, rồi tính số bình quân.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23
Bảng 2.3. Bảng tiêu chuẩn đánh giá khả năng mẫn cảm và kháng thuốc của vi khuẩn [tiêu chuẩn CLSI 2010]
STT Kháng sinh Hàm lượng Giới hạn đường kính vùng ức chế (mm) S I R 1 Penicillin (Pn) 10 µg ≥ 17 14-16 ≤ 13 2 Ampicillin (Am) 10 µg ≥ 17 14-16 ≤ 13 3 Amoxicillin (Ax) 10 µg ≥ 15 12-14 ≤ 11 4 Neomycin (Ne) 30 µg ≥ 16 12-15 ≤ 13 5 Gentamicin (Ge) 10 µg ≥ 15 13–14 ≤ 12 6 Amikacin (Ak) 30 µg ≥ 17 15–16 ≤ 14 7 Kanamycin (Kn) 30 µg ≥ 18 14–17 ≤ 13 8 Streptomycin (Sm) 10 µg ≥ 15 12–14 ≤ 11 9 Tetracycline (Te) 30 µg ≥ 15 12–14 ≤ 11 10 Doxycycline (Dx) 30 µg ≥ 14 11–13 ≤ 10 11 Norfloxacin (Nr) 10 µg ≥ 17 13–16 ≤ 12 12 Ofloxacin (Of) 5 µg ≥ 16 13–15 ≤ 12 13 Colistin (Co) 10 µg ≥ 11 - ≤ 10 14 Trimethoprim – Sulfamethoxazole (Bt) 1,25/23,75 µg ≥ 16 11–15 ≤ 10
Chú thích: S (Susceptible): Mẫn cảm cao; I (Intermediate): Trung gian; R (Resistant): Kháng.
+ Pha loãng các nồng động cao: Chuẩn bị sẵn 10 ống nghiệm sạch, vô trùng, cho vào mỗi ống 5 ml DMSO, đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Ống nghiệm 1, được cho thêm 5ml dung dịch cao lỏng nồng độ 100mg/ml.
Trộn đều dịch chiết trong ống nghiệm 1, sau đó hút 5 ml chuyển sang ống nghiệm 2, trộn đều; chuyển tiếp 5 ml từ ống nghiệm 2 sang ống nghiệm 3, trộn đều;… đến ống nghiệm thứ 10, trộn đều và bỏ đi 5 ml.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24
Hình 2.1. Hệ nồng độ pha loãng cao đặc để xác định nồng độ tối thiểu tác dụng trên vi khuẩn thử nghiệm
+ Phương pháp điều trị thử nghiệm
Lô 1 (30 lợn con) được điều trị bằng thuốc kháng sinh gentamycin theo phác đồ (phác đồ I): gentamycin 5 mg/kg thể trọng, cho uống ngày 2 lần. Vitamin B1 2,5% 5ml/con/ngày tiêm bắp. Hộ lý chăm sóc để chuồng trại khô ráo, thoáng mát, sạch sẽ, cung cấp đủ nước sạch, không cho lợn mẹ ăn thức ăn chứa chất tanh cho tới khi lợn con khỏi bệnh).
Lô 2 (30 lợn con) được điều trị theo phác đồ (phác đồ II): bằng dịch chiết thân cây Mò hoa trắng sử dụng dung môi ethanol 35% với liều lượng 25mg/kg thể trọng, các thuốc bổ trợ, thời gian điều trị, chế độ hộ lý chăm sóc nuôi dưỡng giống như phác đồ I. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ khỏi (phân lợn thành khuôn, các chỉ tiêu lâm sàng (thân nhiệt, tần số hô hấp và tần số tim đập) trở lại bình thường) và thời gian điều trị.