kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong các PĐ từ dịch chiết cây Đương quy .... Mô hình chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ cây Đương quy Angelica sinensisOliv Diels ..
Trang 1LOÀI ĐƯƠNG QUY
(Angelica sinensis (Oliv) Diels)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành : Hóa Sinh học
Người hướng dẫn khoa học
TS TRẦN THỊ PHƯƠNG LIÊN
Trang 2LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn Trường đại học sư phạm Hà Nội II, Trung tâm chuyển giao công nghệ - Trường đại học sư phạm Hà Nội II đã giúp đỡ tôi để tôi có thể hoàn thành luận văn này
Tôi cũng xin giành lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS Trần Thị Phương Liên, giảng viên khoa Sinh - KTNN Trường đại học sư phạm
Hà Nội II đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu, các phương pháp nghiên cứu khoa học để tôi hoàn thành khóa luận này
Cuối cùng xin gửi lời tri ân đến những người thân trong gia đình, bạn bè
đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này
Mặc dù đã rất cố gắng nhưng do thời gian có hạn, khóa luận vẫn không tránh khỏi những thiếu xót Tôi rất mong được sự đóng góp của quý thầy cô
và các bạn để khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn
Tôi xin thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2014
Lê Thị Đương
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Để đảm bảo tính trung thực của khóa luận tôi xin cam đoan:
Khóa luận tốt nghiệp NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA
SINH CỦA DỊCH CHIẾT TỪ LOÀI ĐƯƠNG QUY (Angelica sinensis (Oliv) Diels) là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự
hướng dẫn của TS Trần Thị Phương Liên
Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực, nội dung khóa luận không trùng lặp với các đề tài khác
Hà Nội, tháng 05 năm 2014
Sinh viên
Lê Thị Đương
Trang 5DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1 Bảng các phản ứng định tính đặc trưng 14 Bảng 3.2 khối lượng mẫu thu được khi chiết qua các phân đoạn
và hiệu suất 19 Bảng 3.3 kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong các PĐ từ dịch chiết cây Đương quy 20 Bảng 3.4 Kết quả đường chuẩn gallic 23 Bảng 3.5 Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số các PĐ dịch chiết 24
Trang 6DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Cây Đương quy (Angelica sinensis (Oliv) Diels) 12
Hình 3.1 Mô hình chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ cây Đương
quy (Angelica sinensis(Oliv) Diels) 18
Hình 3.2 Sắc ký đồ các phân đoạn 22 Hình 3.3 Đồ thị chuẩn acid gallic……… 23
Trang 7MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Hợp chất thứ sinh 3
1.1.1 Các hợp chất phenolic 3
1.1.2 Alkaloid thực vật 4
1.1.3 Tanin thực vật 5
1.1.4 Steroid 6
1.1.5 Glycosid trợ tim 7
1.1.6 Coumarin 8
1.1.7 Terpenoid 8
1.1.8 Saponin 9
1.2 Tìm hiểu về cây Đương quy( Angelica sinensis (Oliv) Diel) 9
1.2.1 Đặc điểm thực vật học 9
1.2.2 Phân bố, sinh thái 10
1.2.3 Thành phần hóa học 11
1.2.4 Tác dụng của cây Đương quy ( Angelica sinensis (Oliv) Diel 11
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
2 1 Đối tượng nghiên cứu 12
2.2 Phương pháp nghiên cứu 12
2.2.1 Phương pháp hóa lý: 12
2.2.2 Phương pháp hóa sinh: 15
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17
3.1 Quy trình tách các phân đoạn dịch chiết từ cây Đương quy (Angelica sinensis (Oliv) Diels) 17
3.2 Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên 19
3.3 Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết cây Đương quy bằng sắc ký lớp mỏng 21
3.4 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin – Ciocalteau 3.4.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic 3.4.2 Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số 24
KẾT LUẬN 25
KIẾN NGHỊ 26
Trang 8TÀI LIỆU THAM KHẢO 27
Trang 9MỞ ĐẦU
1 Lý do chọn đề tài:
Sự phát triển của xã hội theo từng ngày và từng giờ, đi kèm với nó là cuộc sống của con người ngày càng được nâng cao, y học cũng phát triển không ngừng để đáp ứng nhu cầu của con người Sự phát triển của y học hiện đại cho ta thấy được hàng ngàn loại bệnh, mà những bệnh này không hề đơn giản và khó có phương pháp hay loại thuốc chữa trị hiệu quả như AIDS, ung thư, tim mạch, béo phì,…, hoặc chưa có thuốc điều trị đặc hiệu hay có lý do khác nữa là giá thành khá cao nếu như không muốn nói là đắt
Cũng vì những lý do này, WHO khuyến cáo nghiên cứu phát triển các loại thuốc có nguồn gốc thảo dược, với ưu điểm là nguồn dược liệu có sẵn, dễ
sử dụng, giá thành rẻ, ít tác dụng phụ, dễ được cộng đồng công nhận, đặc biệt
là ở các nước kém phát triển và đang phát triển
Thực tế có nhiều loại thảo dược có nguồn gốc thiên nhiên, quen thuộc với người dân có khả năng chữa nhiều loại bệnh như Mướp đắng, Thổ Phục Linh, Bạch truật,… không chỉ dừng lại ở những nghiên cứu sàng lọc tác dụng của các hoạt chất trên động vật dùng làm thí nghiệm, nhiều nghiên cứu đã đi vào tách chiết các hợp chất chữa nhiều bệnh
Đương quy tên khoa học Angelica sinensis (Oliv) Diels, Thuộc họ Hoa
tán apraceae (Umbelliferaea) Rễ chứa tinh dầu 0,2% Tinh dầu gồm có các thành phần chủ yếu sau: Ligustilide, n-butyliden phthalide, o-valerophenon carboxylic acid, n.butyl- phtalide, bergapten, sesquiterpen, dodecanol, tetradecanol, safrol, p-cymen, carvacrol, cadinen, vitamin B12 0,25-0,40%, acid folinic, boitin, coumarin
Đương quy là loài cây của Trung Quốc phát triển ở vùng cao 3000m, nơi khí hậu ẩm mát Việt Nam nhập trồng vào đầu những năm 60 hiện nay phát triển trồng ở Sapa (Lào Cai), Ngọc Lĩnh (Kontum), Buôn Mê Thuột (Đắc Lắc) và Đà Lạt (Lâm Đồng)
Trang 102000-Ở nước ta, cây Đương quy được sử dụng nhiều trong đông y làm thuốc chữa bệnh Tuy nhiên, việc nghiên cứu đặc tính hóa sinh, y dược của các hoạt chất thiên nhiên từ cây này chưa được nghiên cứu một cách bài bản Chính vì
vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu một số đặc tính hóa sinh của dịch chiết từ loài Đương quy (Angelica sinensis (Oliv) Diels)”
2 Mục tiêu:
Nghiên cứu một số đặc tính hóa sinh của dịch chiết từ loài Đương quy
(Angelica sinensis (Oliv) Diels)
3.Nội dung nghiên cứu:
- Cung cấp một số thông tin về dịch chiết cây Đương quy (Angelica sinensis (Oliv) Diels)
- Định tính, định lượng một số hợp chất có trong dịch chiết cây Đương
quy (Angelica sinensis (Oliv) Diels)
Trang 11CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Hợp chất thứ sinh
Ở thực vật, ngoài protein, saccarit, lipid, vitamin, còn có những chất khác có vai trò quan trọng trong trao đổi chất của cây được gọi là các chất thực vật thứ sinh Căn cứ vào tính chất hóa học, các hợp chất thực vật thứ sinh được chia thành một số nhóm chính như: Nhóm phenolic, nhóm terpen và nhóm alkaloid [1],[11]
Các chất này đa dạng về cấu trúc, kích thước và được tìm thấy ở nhiều loài thực vật
1.1.1 Các hợp chất phenolic
Hợp chất phenolic là nhóm các chất khác nhau rất phổ biến trong thực vật Đặc điểm chung của chúng là trong phân tử có vòng thơm (benzene) mang một, hai hay ba nhóm hydroxyl (-OH) gắn trực tiếp vào vòng benzene Dựa vào thành phần và cấu trúc người ta chia hợp chất phenolic thành 3 nhóm nhỏ [12]
Nhóm hợp chất phenolic đơn giản: Trong phân tử chỉ có một vòng
benzene và một vài nhóm hydroxyl Tùy thuộc vào số lượng nhóm OH mà chúng được gọi là các monophenol (phenol), diphenol (pyrocatechin, hydroquynone), triphenol (pyrogalol, oxyhydroquynol…)
Nhóm hợp chất phenolic phức tạp: Trong thành phần cấu trúc phân tử của
chúng ngoài vòng thơm benzene (C6) chúng còn có dị vòng, mạch nhánh Đại diện nhóm này có acid cyamic, acid ceramic
Nhóm hợp chất phenolic đa vòng: Là nhóm đa dạng nhất trong các hợp
chất phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc trùng hợp của các đơn phân Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng Nhóm này có flavonoid, tanin và coumarin
Trang 12Hợp chất phenolic có hầu hết trong các bộ phận của cây, chúng được hình thành từ những sản phẩm của quá trình đường phân và chu trình pentose qua
cynamic acid hay theo con đường acetate malonate qua Acetyl-CoA [12]
Hợp chất phenolic có tính kháng khuẩn, chúng có tác dụng quan trọng trong quá trình liền sẹo ở các vết thương cơ học của thực vật, chúng có tác dụng đẩy mạnh quá trình tái sinh, chống bức xạ, gốc tự do, tác nhân gây đột biến và chất chống oxi hóa
1.1.2 Alkaloid thực vật
Alkaloid là hợp chất chứa nito, đa số có nhân dị vòng và có tính kiềm, thường gặp ở thực vật và động vật và thực vật Đa số các Alkaloid thành phần chứa oxy ở thể rắn, không có oxy thường ở thể lỏng dễ bay hơi Alkaloid thường không màu, không mùi và vị đắng Một số Alkaloid có màu vàng như Berberin, palmitin Các Alkaloid ở dạng base thường không tan trong nước Alkaloid có tinh kiềm yếu, do các mạch chứa cacbon quyết định Chúng phản ứng với một số thuốc thử đặc trưng như: Bouchardat (kết tủa nâu sẫm), Vans-Mayer (kết tủa vàng)
O H
O H
Trang 13Alkaloid được sử dụng nhiều trong công nghiệp dược, có rất nhiều thuốc chữa bệnh được sử dụng trong y học là các alkaloid tự nhiên hoặc nhân tạo, ví
dụ như: atrophin, morphin, cocain, [8]
1.1.3 Tanin thực vật
Là một hợp chất làm se bề mặt có mặt trong cấu trúc tế bào thực vật Chúng có thể là một dạng poly phenolic đóng vai trò là hợp chất liên kết và kết tủa protein cũng như các hợp chất hữu cơ khác bao gồm cả axit amin và alkaloid Đồng thời góp phần quy định sự tăng trưởng ở thực vật Tương tự như vậy, sự phá hủy hoặc sửa đổi của các tanin thực vật đóng vai trò quan trọng trong sự chín của trái cây
Tanin được tìm thấy trong các loài thực vật, ở các bộ phận như lá, chồi, hạt, rễ, và các mô gốc Trong các tế bào gốc tanin được tìm thấy trong các giai đoạn tăng trưởng của cây, như phloem và xylem thứ cấp, lớp giữa vỏ và lớp biểu bì Tanin có thể giúp điều chỉnh sự phát triển của các mô
Các polyphenol có nhiều nhất là tanin cô đặc, được tìm thấy trong hầu như tất cả các cơ quan thực vật, chiếm 50% trọng lượng khô của lá
Tanin có trọng lượng phân tử khác nhau, từ 500 đến hơn 3000 (axit galic este) và lên đến 20000 (proanthocyanidins)
Tanin là chất không tương thích với chất kiềm, gelatin, kim loại nặng, sắt, nước chanh, kim loại nặng, muối kim loại, chất oxy hóa mạnh và sulfat kẽm
Trang 14Gallic acid Flavone phloroglucinol
Các đơn vị cấu thành chính của Tanin
Tanin có 2 nhóm chính: tanin thuỷ phân và tanin ngưng tụ
- Tanin thuỷ phân: gồm có các tanin mà thành phần chính để tạo
polymer thường là ester của acid gallic với gốc đường, các ester không mang
đường của acid phenolcacbonic và ester của acid ellagovic với đường
- Tanin ngưng tụ: là các oligomer hay polymer của các đơn vị flavonoid (flavan 3-ol) nối với các dây nối C - C không bị cắt khi thuỷ phân như catechin, epicatechin hoặc các chất tương tự Tanin ngưng tụ có thể có từ 2 tới
50 hay hơn các đơn vị flavonoid
Tanin thường là hợp chất vô định hình hoặc tinh thể, không màu, có tính quang học, vị chát Tanin tan trong nước tạo dung dịch keo và độ hoà tan thay đổi tuỳ thuộc vào mức độ polymer hoá Chúng tan tốt trong ethanol, acetone
1.1.4 Steroid
Steroid là một hợp chất hữu cơ có chứa một sự sắp xếp đặc trưng của 4 vòng cycloalkane được nối với nhau như cholesterol, hormon sinh dục estradiol và testosterone
Lõi của steroid bao gồm 20 nguyên tử cacbon liên kết với nhau mang hình thức của 4 vòng hợp nhất: 3 vòng cyclohexan và một vòng cyclopentan Các steroid khác nhau đối với từng nhóm chức năng gắn liền với cốt lõi 4 vòng và oxi hóa của các vòng
Trang 15Steroid là các hợp chất chất béo hữu cơ hòa tan có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp, có công thức từ 17 nguyên tử cacbon sắp xếp thành 4 vòng và bao gồm cả các sterol và axit mật, thượng thận, và kích thích tố giới tính Một
số steroid có nguồn gốc thiên nhiên như: hợp chất digitalis, và các tiền chất của một số loại vitamine nhất định Steroid rất đa dạng và phong phú, bao gồm các hình thức của một số loại vitamine D, digitalis, sterol (ví dụ : cholesterol) và các axit mật Các sterol là các dạng đặc biệt của các steroid, với một nhóm hydroxyl tại vị trí-3 và một khung lấy từ cholestane Hàng trăm steroid riêng biệt được tìm thấy ở thực vật, động vật và nấm Tất cả các steroid được sản xuất ở các tế bào từ các sterol lanosterol (động vật và nấm) hoặc từ cycloartenol (thực vật) Cả lanosterol và cycloartenol lấy từ cyclization của triterpenesqualene
1.1.5 Glycosid trợ tim
Glycosid trợ tim là một nhóm glycosid có cấu trúc steroid, có tác dụng đặc hiệu đối với bệnh tim nhưng với liều cao chúng là các chất gây độc Trong cây, chúng tồn tại ở dạng glycosid hoà tan trong các dịch tế bào Dưới tác dụng của enzym hay acid loãng, các glycosid bị thuỷ phân tạo thành các genin và các ose
Là glycosid nên chúng tan nhiều trong nước và cồn loãng, ít tan trong các dung môi không phân cực như ete, dầu, benzen
Tác dụng của glycosid trợ tim là làm tăng sức co bóp của cơ tim, cả ở người lành lẫn người bệnh; làm tăng trương lực cơ tim, làm ngắn chiều dài của các sợi cơ tim đã bị căng, giãn do vậy làm tăng trương lực cơ tim, giảm thể tích
Trang 16và kích thước tim; làm chậm nhịp tim, do vừa có tác dụng trên dây thần kinh phế
vị, vừa làm giảm tính tự động của nút xoang; làm giảm dẫn truyền trong nhĩ, đặc biệt nút nhĩ thất; làm giảm tính kích thích của cơ tâm nhĩ, nhưng trái lại, làm tăng tính kích thích của cơ tâm thất; gây lợi tiểu nhẹ do giảm tái hấp thu natri ở ống lượn gần
1.1.6 Coumarin
Coumarin là nhóm hợp chất tự nhiên, được xem là dẫn xuất lacton của acid octo-hydroxy xinamic Đến nay đã xác định được khoảng 600 chất và coumarin tồn tại trong cây chủ yếu dưới dạng tự do Ví dụ như:
Coumarin được dùng để làm thuốc chống đông máu, coumarin có tác dụng làm giãn động mạch vành và mạch ngoại vi, đồng thời có tác dụng chống co thắt Một số chất có tác dụng ức chế sinh trưởng thực vật, tác dụng kháng khuẩn, diệt nấm, chống viêm…
1.1.7 Terpenoid
Terpenoid là nhóm chất hữu cơ thiên nhiên không no có công thức chung
là (izo-C5H8)n (n>=2) Ngoài các hydrocacbon không no, các dẫn xuất của chúng như ancol, andehyd, ceton, cacboxylic acid cũng được gọi là tecpen Tuỳ theo số nguyên tử cacbon trong mạch hydrocacbon, người ta phân chúng thành các nhóm: monoterpen, secpuiterpen, diterpen, triterpen, tetraterpen, polyterpen Trong đó monoterpen là quan trọng nhất trong terpenoid Nó có cấu trúc mạch hở, mạch vòng
Trang 17Các terpenoid có chứa nhiều trong thực vật như secpuiterpen, diterpen và triterpen có chứa trong tinh dầu, nhựa của thực vật bậc cao, polyterpen là thành phần chính của các cao su tự nhiên Chính vì do dặc điểm cấu tạo của chúng nên các terpenoid có tác dụng làm thông mạch và làm tăng độ đàn hồi của cơ tim và thành mạch
1.1.8 Saponin
Saponin được dùng để chỉ nhóm glycosid có đặc tính chung là khi hoà tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo bọt Dưới tác dụng của các enzym thực vật, vi khuẩn, hoặc acid loãng, saponin bị thuỷ phân thành genin (gọi là sapogenin) và phần glucid
Phần glucid gồm các ose phổ biến là D-glucose, D-galactose, L-mannose
và L-arabinose Phần sapogenin gồm hai nhóm lớn là saponin triterpen và saponin steroid Trong đó, saponin steroid phân bố tập trung ở cây Một lá mầm còn saponin triterpen phân bố rộng nhưng tập trung chủ yếu ở cây Hai lá mầm
Về mặt hoạt tính sinh học, saponin cung cấp nhiều loại thuốc quan trọng với một
số tác dụng chính như sau: tác dụng bổ, tăng cường sinh lực (saponin có trong họ nhân sâm); tác dụng long đờm, dịu ho (có trong cam thảo, viễn chí); giảm đau nhức xương (có trong ngưu tất, cỏ xước), hạ cholesterol trong máu
1.2 Tìm hiểu về cây Đương quy (Angelica sinensis (Oliv) Diel)
1.2.1 Đặc điểm thực vật học
Đương quy còn được gọi là Tần quy, Can quy tên khoa học Angelica sinensis (Oliv) Diels, thuộc chi Angelica - bạch chỉ, họ Hoa tán apraceae (Umbelliferaea)
Rễ rất phát triển Thân hình trụ, có rãnh dọc màu tím Rễ dài 10 - 20 cm, gồm nhiều nhánh, thường phân biệt 3 phần: Phần đầu gọi là quy đầu, phần giữa gọi là quy thân, phần dưới gọi là quy vĩ Mặt ngoài màu nâu nhạt, có nhiều nếp nhăn dọc Mặt cắt ngang màu vàng ngà, có vân tròn Mùi thơm đặc biệt Vị ngọt, cay và hơi đắng.[5], [9]
Trang 18Thân: thân thảo sống lâu năm, cây cao khoảng 40 – 60cm, khi ra hoa thân cây cao 1m, thân có màu tím
Lá: lá thuộc loại lá kép, có răng cưa không có lông Cuống lá phát triển thành bẹ bao bọc lấy thân
Hoa: hoa thuộc loại hoa tán, tán kép gồm từ 12 – 40 hoa, hoa có màu trắng nở tập trung vào tháng 7 – 8
Quả: quả bẻ đôi hình dẹt, có vân màu trắng, màu vàng hay màu vàng đất Đương quy là một cây thuốc bắc Bộ phận được dùng là phần rễ - phát
triển tạo thành củ, vị ngọt cay, mùi thơm, tính ấm
1.2.2 Phân bố, sinh thái
Cây Đương quy có nguồn gốc từ Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản Hiện nay ta vẫn phải nhập của Trung Quốc và Triều Tiên, ta đã nhiều lần trồng thí nghiệm nhưng mới thành công ở Sapa- Lào Cai với diện nhỏ, mới đây nhất Đương quy được trồng thành công ở Hà Nội, Lai Châu, do lợi dụng thời tiết lạnh, tuy nhiên chất lượng có khác và chưa phổ biến trồng rộng rãi
Việt Nam đã 3 lần nhập giống Đương quy của Trung Quốc (khoảng giữa năm 60); Triều Tiên (1978) và gần đây là của Nhật Bản (1996) Giống Đương quy nhập từ Trung Quốc hiện không còn, hai giống còn lại vẫn đang được trồng ở các tỉnh Hà Giang, Lào Cai, xung quanh Hà Nội.[2],[9]
Cây ưa khí hậu ẩm mát, đến mùa đông toàn bộ phần mặt trên đất tàn lụi, phần củ dưới mặt đất chiu đựng được băng tuyết và mọc lại vào mùa xuân năm sau
Đương quy trồng ở Việt Nam thường cũng phải lựa chọn thời vụ, sao cho mùa gieo hạt và sinh trưởng của cây trùng với thời gian có nhiệt độ thấp trong năm Cây trồng ở vùng đồng bằng ra hoa quả sớm hơn ở vùng núi cao (trên 1500m), nhưng hạt giống này không được dùng để sản xuất dược liệu
Đó là những đặc điểm về mặt sinh học cần lưu ý khi lựa chọn vùng trồng Đương quy thích hợp ở Việt Nam