Nghiên cứu một số đặc tính hoá sinh của dịch chiết từ loài tục đoạn (dipsacus japonicus miq )

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ******************** QUÁCH THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA SINH CỦA DỊCH CHIẾT TỪ LOÀI TỤC ĐOẠN (Dipsacus japonicus Miq.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa sinh học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. TRẦN THỊ PHƢƠNG LIÊN HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Trần Thị Phƣơng Liên ngƣời đã hƣớng dẫn tận tình động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô phòng thí nghiêm Hoá sinh – Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn các cán bộ Trung tâm chuyển giao công nghệ - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ƣơng đã tạo điều kiện tốt nhất giúp tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, những ngƣời luôn động viên, quan tâm, giúp đỡ và là chỗ dựa tinh thần lớn nhất giúp tôi đạt đƣợc kết quả tốt khi thực hiện khoá luận này. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên thực hiện Quách Thị Quỳnh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong khoá luận là do tôi thực hiên và không trùng lặp với bất cứ tác giả nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những nội dung đƣợc đề cập trong bản khoá luận này. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên thực hiện Quách Thị Quỳnh KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT EtOH Ethanol EtOAC Ethylacetate FDA Food and Drug Administration CHCl 3 Chloroform PCO Procyanidolic oligomer MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Lí do chọn đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Cây Tục đoạn (Dipsacus japonicus Miq.) 3 1.1.1. Phân bố, sinh thái 3 1.1.2. Thành phần hoá học 4 1.1.3. Công dụng và liều dùng 4 1.2. Hợp chất thứ cấp trong thực vật 5 1.2.1. Alkaloid 5 1.2.1.1. Khái niệm 5 1.2.1.2. Cấu tạo 6 1.2.1.3. Phân loại 6 1.2.1.4. Tính chất của alkaloid 7 1.2.1.5. Tác dụng sinh học của alkaloid 8 1.2.2. Hợp chất tannin 8 1.2.2.1. Khái niệm 8 1.2.2.2. Cấu trúc hoá học 9 1.2.2.3. Phân loại 10 1.2.2.4. Tính chất của tannin 11 1.2.2.5. Ứng dụng của tannin 11 1.2.3. Glycoside 12 1.2.3.1. Khái niệm 12 1.2.3.2. Phân loại 13 1.2.3.3. Tính chất 13 1.2.3.4. Tác dụng sinh học 13 1.2.4. Flavonoid thực vật 14 1.2.4.1. Định nghĩa 14 1.2.4.2. Cấu trúc hoá học 14 1.2.4.3. Tính chất 15 1.2.4.4. Phân loại 15 1.2.4.5. Tác dụng sinh học 15 1.3. Những nghiên cứu về hợp chất thứ sinh trên thế giới 16 1.4. Vài nét về tình hình nghiên cứu các hợp chất thứ cấp ở Việt Nam 19 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 20 2.1.1. Mẫu thực vật 20 2.1.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 20 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.2.1. Tách chiết các phân đoạn dịch chiết từ cây Tục đoạn 21 2.2.2. Định tính một số nhóm chất thiên nhiên từ cây Tục đoạn 22 2.2.2.1. Định tính flavonoid 22 2.2.2.2. Định tính tannin 22 2.2.2.3. Định tính alkaloid 22 2.2.2.4. Định tính glycoside 23 2.2.2.5. Định tính polyphenol khác 23 2.2.3. Định lƣợng polyphenol tổng số theo phƣơng pháp Folin – Ciocalteau 23 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.2. Kết quả định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết cây Tục đoạn 26 3.3. Hàm lƣợng polyphenol tổng số trong cao dịch chiết các phân đoạn 28 3.3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn galic 28 3.3.2. Định lƣợng polyphenol tổng số theo phƣơng pháp Folin- Ciocalteau 29 KẾT LUẬN 30 KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu tạo hoá học của tannin 9 Hình 1.2. Tannin thuỷ phân 10 Hình 1.3. Cấu tạo của gallocatechine 11 Hình 1.4. Cấu tạo của Catechine 11 Bảng 1.1. Một số nhóm Flavonoid quen thuộc trong cuộc sống hàng ngày 14 Hình 1.5. Flavan (2- pheny chroman) 15 Hình 3.1. Quy trình chiết xuất các chất tự nhiên từ cây Tục đoạn 25 Bảng 3.1. Khối lƣợng mẫu thu đƣợc khi chiết qua các phân đoạn. 26 Bảng 3.2. Kết quả đinh tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết cây Tục đoạn. 27 Bảng 3.3. Kết quả đƣờng chuẩn galic 28 Hình 3.3. Đồ thị đƣờng chuẩn acid galic 28 Bảng 3.4. Kết quả hàm lƣợng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết 29 1 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Việt Nam là nƣớc nằm trong khu vực nhiệt đới ẩm gió mùa có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự phát triển của thực vật. Sự phong phú và đa dạng của hệ thực vật nƣớc ta là một kho tàng vô giá về nguồn hợp chất tự nhiên và nguồn nguyên liệu phục vụ cho ngành Y học. Dân tộc Việt Nam có truyền thống sử dụng các loài thảo mộc làm thuốc chữa bệnh. Những năm gần đây xu hƣớng tìm kiếm một số hoạt chất có nguồn gốc từ thảo mộc làm thuốc chữa bệnh ngày một tăng thu hút rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Trên thế giới, từ rất lâu ngƣời ta đã nghiên cứu những đặc tính của những chất có hoạt tính sinh học chiết xuất từ thực vật để phục vụ cho lợi ích của con ngƣời, quá trình này phát triển từ những năm 1950. Có khoảng 30.000 hợp chất đƣợc chiết xuất từ thực vật có hoạt tính và có giá trị đối với đời sống. Những hợp chất này bao gồm: phenolic, alkaloid, flavonoid… Và trong những năm gần đây, các công trình nghiên cứu về các hợp chất có nguồn gốc thực vật vẫn không ngừng phát triển và bƣớc đầu đạt đƣợc những thành quả đáng kể. Theo thống kê, thảm thực vật ở Việt Nam có trên 12000 loài thực vật trong đó có khoảng hơn 3200 loài đƣợc sử dụng làm thuốc trong Y học dân gian. Từ xƣa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức quan trọng trong việc chăm sóc sức khoẻ con ngƣời. Ngày nay, những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học đƣợc phân lập từ thực vật đã đƣợc ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp và phục vụ sức khoẻ con ngƣời. Chúng đƣợc sử dụng làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp thực phẩm và mĩ phẩm, thuốc bảo vệ thực vật và đặc biệt là sản xuất thuốc 2 chữa bệnh. Mặc dù công nghệ tổng hợp hoá dƣợc ngày nay đã phát triển mạnh mẽ tạo ra các biệt dƣợc khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh nhờ đó giảm tỉ lệ tử vong rất nhiều, song những đóng góp của thảo dƣợc cũng không vì thế mà mất đi chỗ đứng trong Y học. Nó vẫn tiếp tục đƣợc dùng nhƣ là nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp những chất đầu cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm những dƣợc phẩm mới cho việc điều trị các bệnh thông thƣờng và bệnh nan y. Các số liệu gần đây cho thấy rằng, có khoảng 60% dƣợc phẩm dùng trong chữa bệnh hiện nay hoặc đang thử cận lâm sàng có nguồn gốc tự nhiên. Trong thế giới thực vật muôn màu, nhiều loài đã đƣợc sử dụng. Trong đó, Tục đoạn (Dipsacus japonicus Miq.) là một loài thảo dƣợc có tác dụng chữa rất nhiều bệnh khác nhau: đau lƣng, thấp khớp, động thai, đau bụng và đặc biệt là có tác dụng đáng kể lên việc chữa trị bệnh đái tháo đƣờng. Nó là nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền, ít tác dụng phụ. Hƣớng nghiên cứu về đặc tính của loài Tục đoạn vẫn chƣa đƣợc quan tâm nhiều. Vì vậy, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính hoá sinh của dịch chiết từ loài Tục đoạn (Dipsacus japonicus Miq.)”. 2. Mục đích nghiên cứu Mục đích nghiên cứu nhằm góp phần hiểu biết thêm về đặc tính sinh lý, hóa sinh và khả năng chữa bệnh của dịch chiết từ loài Tục đoạn, tạo cơ sở cho những hƣớng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm các phƣơng thuốc mới cũng nhƣ tìm hiểu tác dụng của các loại thảo dƣợc sẵn có trong tự nhiên. 3. Nội dung nghiên cứu - Định tính, định lƣợng và tách một số phân đoạn chứa hoạt chất thiên nhiên từ loài Tục đoạn. - Nghiên cứu đặc tính hóa sinh của các phân đoạn dịch chiết từ loài Tục đoạn [...]... xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học vẫn là một con đƣờng đầy tiềm năng chƣa đƣợc khai phá hết của nền công nghệ tách chiết từ các hợp chất thứ sinh từ thực vật ở Việt Nam [10] 19 CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1 Mẫu thực vật Cây Tục đoạn (Dipsacus japonicus Miq ) phơi khô Hình 2.1 Hình thái cây Tục đoạn (Dipsacus japonicus Miq. ) Bộ phận dùng: Toàn thân... dung dịch chuẩn + 1.58ml nƣớc + 100µl thuốc thử Folin - Ciocalteau + 300µl dung dịch Na2CO3 Cách đo với dịch nghiên cứu: Tiến hành nhƣ trên nhƣng thay 0.02ml (20µl) dung dịch chuẩn bằng dịch nghiên cứu đƣợc pha loãng thích hợp sao cho số đo nằm trong đƣờng chuẩn 24 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Quy trình tách các phân đoạn dịch chiết từ cây Tục đoạn Để khảo sát thành phần hoá học của cây Tục đoạn. .. các dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo 3.2 Kết quả định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết cây Tục đoạn Để xác định thành phần hợp chất tự nhiên có trong các phân đoạn của cây Tục đoạn đã cô thành cao (cao cồn, n-hexan, ethyaxetat) Chúng tôi tiến hành định tính một số hợp chất tự nhiên thông qua các phản ứng hóa học và thuốc... hợp HgCl2 + KI trong nƣớc) - Thuốc thử Dragendoff (hỗn hợp Bi(NO 3)3 và KI trong nƣớc) - Vanilin/H2SO4  Thiết bị nghiên cứu: - Máy đo OD Các thiết bị đều đảm bảo tiêu chuẩn về độ chính xác và an toàn 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Tách chiết các phân đoạn dịch chiết từ cây Tục đoạn Cây Tục đoạn đƣợc sấy khô ở nhiệt độ 40 - 450C, cắt nhỏ Ngâm với ethanol 96% ở nhiệt độ phòng từ 2 - 4 tuần Sau đó lọc... cao phân đoạn ethanol Sau khi thu đƣợc cao phân đoạn ethanol, tiếp tục ngâm mẫu vật trong các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan  ethyaxetat Các dịch chiết đƣợc cô lại ở nhiệt độ 450C (sấy khô bằng bóng đèn điện tròn) hoặc dùng quạt làm bay hơi để thu đƣợc cao phân đoạn 21 2.2.2 Định tính một số nhóm chất thiên nhiên từ cây Tục đoạn Để khảo sát sơ bộ thành phần hoá học trong cây Tục đoạn, chúng... cam đến đỏ [1] 2.2.2.4 Định tính glycoside Phản ứng Keller - Killian: Chuẩn bị các dung dịch thuốc thử gồm dung dịch A: 0.5ml dung dịch FeCl3 5% trong 50ml acetic acid 10% Dung dịch B: 0.5ml dung dịch FeCl3 5% trong 50ml sunfuric acid đặc Cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 1ml dung dịch A vào lắc cho tan hết rồi nghiêng ống nghiệm cho từ từ dung dịch B vào Phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện vòng nâu... cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu  Các dung môi để ngâm mẫu: - Ethanol - N-hexan - Ethylacetate  Các dụng cụ dùng trong quá trình nghiên cứu: 20 - Cân phân tích - Bóng đèn, quạt điện - Bình đựng dịch chiết - Ống nghiệm, pipet, đũa thuỷ tinh  Hoá chất: - Acetate chì - Acid clohidric (HCl) - Acid sunfuric (H2SO 4) - Gelatin/NaCl - Muối sắt (III) clorua (FeCl 3) - Dung dịch natri cacbonat (NaCO 3) -... sau Tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt 3 Ở Việt Nam, Tục đoạn phân bố chủ yếu ở các tỉnh Hà Giang (huyện Quản Bạ, Yên Minh, Đồng Văn, Mèo Vạc); Lai Châu (Phong Thổ, Sìn H ); Điện Biên (Tủa Chùa); Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát); Yên Bái (Mù Cang Chải) Năm 1978, Viện Dƣợc liệu đƣa giống từ Sa Pa trồng ở Trại dƣợc liệu Trà My (Quảng Nam), nay có một quần thể nhỏ đã trở nên hoang dại hóa Trên thế giới Tục đoạn có... lƣợng mẫu thu đƣợc khi lần lƣợt chiết qua các dung môi đƣợc trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1 Khối lượng mẫu thu được khi chiết qua các phân đoạn Tục đoạn Mẫu Mẫu thu đƣợc Mẫu ban đầu Hiệu suất chiết Các PĐ (g) (g) rút ( %) EtOH 180 3000 6 n-Hexan 34.8 3000 1.16 Ethyacetate 15.25 3000 0.51 Từ phƣơng pháp chiết rút đƣợc trình bày ở hình 3.1, chúng tôi đã thu đƣợc một số cao phân đoạn tan trong các dung môi hữu...CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tục đoạn (Dipsacus japonicus Miq. ) Tục đoạn tên khoa học là Dipsacus japonicus Miq thuộc họ Tục đoạn Dipsacaceae, bộ Tục đoạn Dipsacales [6] Cây thảo, cao 1.5 - 2m, có rễ mập, phân nhánh ít thân có cạnh và gai thƣa Lá mọc đối, không cuống, có bẹ, hình mác, dài . Hƣớng nghiên cứu về đặc tính của loài Tục đoạn vẫn chƣa đƣợc quan tâm nhiều. Vì vậy, chúng tôi chọn đề tài: Nghiên cứu một số đặc tính hoá sinh của dịch chiết từ loài Tục đoạn (Dipsacus japonicus. tách một số phân đoạn chứa hoạt chất thiên nhiên từ loài Tục đoạn. - Nghiên cứu đặc tính hóa sinh của các phân đoạn dịch chiết từ loài Tục đoạn 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tục đoạn. HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ******************** QUÁCH THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA SINH CỦA DỊCH CHIẾT TỪ LOÀI TỤC ĐOẠN (Dipsacus japonicus Miq. ) KHÓA LUẬN