3. Nội dung nghiên cứu
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Mẫu thực vật
Cây Tục đoạn (Dipsacus japonicus Miq. ) phơi khô
Hình 2.1 Hình thái cây Tục đoạn (Dipsacus japonicus Miq.)
Bộ phận dùng: Toàn thân
Thời gian thu mẫu: Tháng 9- 2013 Địa điểm thu mẫu: Sìn Hồ - Lai Châu
2.1.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu
Các dung môi để ngâm mẫu: - Ethanol
- N-hexan - Ethylacetate
21 - Cân phân tích
- Bóng đèn, quạt điện - Bình đựng dịch chiết
- Ống nghiệm, pipet, đũa thuỷ tinh Hoá chất:
- Acetate chì
- Acid clohidric (HCl) - Acid sunfuric (H2SO4)
- Gelatin/NaCl
- Muối sắt (III) clorua (FeCl3)
- Dung dịch natri cacbonat (NaCO3)
- Thuốc thử Vans – Mayer (Hỗn hợp HgCl2 + KI trong nƣớc) - Thuốc thử Dragendoff (hỗn hợp Bi(NO3)3 và KI trong nƣớc) - Vanilin/H2SO4
Thiết bị nghiên cứu: - Máy đo OD
Các thiết bị đều đảm bảo tiêu chuẩn về độ chính xác và an toàn.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết các phân đoạn dịch chiết từ cây Tục đoạn
Cây Tục đoạn đƣợc sấy khô ở nhiệt độ 40 - 450
C, cắt nhỏ. Ngâm với ethanol 96% ở nhiệt độ phòng từ 2 - 4 tuần. Sau đó lọc bằng giấy lọc và cất loại dung môi thu đƣợc cao phân đoạn ethanol. Sau khi thu đƣợc cao phân đoạn ethanol, tiếp tục ngâm mẫu vật trong các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan ethyaxetat.
Các dịch chiết đƣợc cô lại ở nhiệt độ 450C (sấy khô bằng bóng đèn điện tròn) hoặc dùng quạt làm bay hơi để thu đƣợc cao phân đoạn.
22
2.2.2. Định tính một số nhóm chất thiên nhiên từ cây Tục đoạn
Để khảo sát sơ bộ thành phần hoá học trong cây Tục đoạn, chúng tôi tiến hành thực hiện một số thí nghiệm định tính với thuốc thử. Mẫu thử đƣợc pha trong EtOH và chia vào các ống nghiệm.
2.2.2.1. Định tính flavonoid
- Phản ứng Shinoda: Chuẩn bị ống nghiệm có chứa mẫu phản ứng, thêm một ít bột Mg, nhỏ thêm vài giọt acid clohidric (HCl) đặc sau đó đun sôi trên nồi cách thuỷ trong vài phút. Phản ứng này cho kết quả dƣơng tính khi dung dịch xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam.
-Phản ứng với acid sunfuric (H2SO4) cho flavonoid phản ứngvới sunfuric acid đặc sẽ cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron [1].
-Phản ứng định tính catechin: Nhỏ dung dịch mẫu lên giấy lọc, thêm dung dịch vanilin trong HCl đặc. Nếu kết quả cho màu đỏ son là phản ứng dƣơng tính.
2.2.2.2. Định tính tannin
- Phản ứng với vanilin: Thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H2SO4. Phản ứng dƣơng tính khi dung dịch có màu đỏ đậm.
-Phản ứng với gelatin/NaCl: Thêm vài giọt thuốc thử gelatin/NaCl vào ống nghiệm. Phản ứng dƣơng tính khi trong dung dịch xuất hiện vẩn đục [1].
-Phản ứng với acetat chì: Thêm vài giọt dung dịch acetat chì 10% vào ống nghiệm. Phản ứng dƣơng tính khi trong dung dịch xuất hiện kết tủa.
2.2.2.3. Định tính alkaloid
Mẫu thử đƣợc pha trong dung dịch acetic acid 2%.
Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và I2 trong dung dịch acid HCl): Alkaloid cho kết tủa màu nâu sẫm khi phản ứng với thuốc thử Bouchardat.
23
Phản ứng với thuốc thử Vans - Mayer ( hỗn hợp HgCl2 và KI trong H2O): Alkaloid phản ứng với thuốc thử Vans - Mayer cho kết tủa màu trắng ánh vàng [1].
Phản ứng với thuốc thử Dragendoff ( hỗn hợp Bi(NO3)3 và KI trong dung dịch acetic acid): Alkaloid phản ứng với thuốc thử Dragendoff cho dung dịch màu vàng da cam đến đỏ [1].
2.2.2.4. Định tính glycoside
Phản ứng Keller - Killian: Chuẩn bị các dung dịch thuốc thử gồm dung dịch A: 0.5ml dung dịch FeCl3 5% trong 50ml acetic acid 10%. Dung dịch B: 0.5ml dung dịch FeCl3 5% trong 50ml sunfuric acid đặc. Cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 1ml dung dịch A vào lắc cho tan hết rồi nghiêng ống nghiệm cho từ từ dung dịch B vào. Phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa hai lớp chất lỏng [1].
2.2.2.5. Định tính polyphenol khác
- Phản ứng với dung dịch kiềm: Các polyphenol khi phản ứng với dung dịch kiềm cho kết quả màu vàng.
- Phản ứng với FeCl3: Thêm dung dịch FeCl3 trong HCl 0.5N vào ống nghiệm đựng dung dịch mẫu. Phản ứng dƣơng tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen [1].
2.2.3. Định lƣợng polyphenol tổng số theo phƣơng pháp Folin – Ciocalteau
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol với thuốc
thử Folin – Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam. Đo độ hấp phụ của dung dịch sau phản ứng ở bƣớc sóng 765nm. Hàm lƣợng polyphenol tổng số đƣợc tính theo mg acid galic chuẩn.
Hoá chất:
Dung dịch acid galic: 0.5g acid galic + 10ml EtOH 96% + 90ml H2O cất hai lần
24 Dung dịch NaCO3 20%
Thuốc thử Folin – Ciocalteau
Phương pháp: Xây dựng đƣờng chuẩn acid galic ở các nồng độ 50,
100, 150, 250, 500mg/l.
Chuẩn bị cóng định lƣợng, cho vào mỗi cóng 20µl mẫu hoặc dung dịch chuẩn + 1.58ml nƣớc + 100µl thuốc thử Folin - Ciocalteau + 300µl dung dịch Na2CO3.
Cách đo với dịch nghiên cứu: Tiến hành nhƣ trên nhƣng thay 0.02ml (20µl) dung dịch chuẩn bằng dịch nghiên cứu đƣợc pha loãng thích hợp sao cho số đo nằm trong đƣờng chuẩn.
25
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Quy trình tách các phân đoạn dịch chiết từ cây Tục đoạn
Để khảo sát thành phần hoá học của cây Tục đoạn chúng tôi sử dụng ethanol 96% chiết rút thu đƣợc cao ethanol. Sau đó ngâm mẫu vào các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, ethylacetat [7]. Các dịch chiết tƣơng ứng đƣợc cất loại dung môi thu đƣợc các phân đoạn dịch chiết n-hexan, ethylaceta. Quy trình chiết rút đƣợc mô tả ở hình 3.1.
Ngâm với ethanol 96%, lọc, cất loại dung môi (chiết
3lần) Cây Tục đoạn khô
Cao ethanol
Bã sau khi chiết bằng n-hexan Cao n-hexan
Bã sau khi chiết bằng ethylacetate Cao ethylacetate
Bã sau khi chiết bằng ethanol
Chiết bằng n-hexan
Chiết ethylacetate
26
Từ 3kg cây Tục đoạn phơi khô đƣợc ngâm kiệt 3 lần trong ethanol 96%, loại dung môi thu đƣợc tổng khối lƣợng mẫu cao cồn tổng số là 180g. Sau đó tiếp tục ngâm mẫu qua các dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau. Khối lƣợng mẫu thu đƣợc khi lần lƣợt chiết qua các dung môi đƣợc trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Khối lượng mẫu thu được khi chiết qua các phân đoạn.
Mẫu
Các PĐ
Tục đoạn Mẫu thu đƣợc
(g)
Mẫu ban đầu (g)
Hiệu suất chiết rút (%)
EtOH 180 3000 6
n-Hexan 34.8 3000 1.16
Ethyacetate 15.25 3000 0.51
Từ phƣơng pháp chiết rút đƣợc trình bày ở hình 3.1, chúng tôi đã thu đƣợc một số cao phân đoạn tan trong các dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Kết quả định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết cây Tục đoạn đoạn dịch chiết cây Tục đoạn
Để xác định thành phần hợp chất tự nhiên có trong các phân đoạn của cây Tục đoạn đã cô thành cao (cao cồn, n-hexan, ethyaxetat). Chúng tôi tiến hành định tính một số hợp chất tự nhiên thông qua các phản ứng hóa học và thuốc thử tƣơng ứng. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.2
27
Bảng 3.2. Kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết cây Tục đoạn.
Nhóm chất Phản ứng đặc trƣng
Phân đoạn
EtOH N-hexan Ethylaxetate
Flavonoid NaOH 10% + + ++ H2SO4 - + + Shinoda + - + Diazo + ++ +++ Tanin Vanilin + - - FeCl3/HCl ++ + + Gelatin + ++ + Alkaloid Dragendoff ++ + ++ Mayer ++ ++ + Bouchardat + ++ +
Glycoside Keller - Kilaian - + ++
Saponin Tạo bọt + + ++ +
Chú thích: (+): phản ứng dƣơng tính (-): phản ứng âm tính
Từ kết quả của bảng trên, cho thấy các thành phần của cây Tục đoạn gồm: Flavonoid, tannin, alkaloid, glycoside và saponin. Tất cả các cao phân đoạn trên đều chứa toàn bộ các thành phần này, tuy nhiên hàm lƣợng của chúng ở từng cao phân đoạn lại có sự khác nhau. Căn cứ vào mức độ phản ứng cho thấy cao phân đoạn ethanol phản ứng với các thuốc thử nhận biết flavonoid, tannin, alkaloid, saponin mạnh hơn so với phản ứng nhận biết glycoside đồng thời mạnh hơn phản ứng của các cao phân đoạn khác. Nhƣ vậy, cao phân đoạn ethanol chứa
28
hàm lƣợng các chất tự nhiên lớn và phong phú nhất. Tiếp theo là phân đoạn ethylacetate và cuối cùng là cao phân đoạn n-hexan.
3.3. Hàm lƣợng polyphenol tổng số trong cao dịch chiết các phân đoạn 3.3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn galic 3.3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn galic
Đƣờng chuẩn galic đƣợc xây dựng bằng cách chuẩn bị các dung dịch acid galic ở các nồng độ 50, 100, 150, 200, 500 mg/l, tiến hành so màu trên máy ERMA ở bƣớc sóng λ = 765nm. Kết quả đƣợc thực hiện ở bảng 3.3 và hình 3.3.
Bảng 3.3 Kết quả đường chuẩn galic
STT Acid galic (mg/l) OD 765nm 1 0 0.009 2 50 0.062 3 100 0.119 4 150 0.168 5 250 0.265 6 500 0.519
Hình 3.3. Đồ thị đường chuẩn acid galic
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 400 500 600 OD 765nm OD 765nm y = 0.001x + 0.0128
29
3.3.2. Định lƣợng polyphenol tổng số theo phƣơng pháp Folin- Ciocalteau
Dịch chiết cho phản ứng với thuốc thử Folin - Ciocalteau tạo ra sản phẩm có màu xanh lam. So trên máy ERMA ở bƣớc sóng = 765nm, dùng chất chuẩn là acid galic để định lƣợng polyphenol.
Kết quả thể hiện ở bảng 3.4
Bảng 3.4. Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết Mẫu Phân đoạn OD765nm Hàm lƣợng (mg/l) Tỉ lệ (%) EtOH 0.29 277.2 9.24 n-hexan 0.31 297.2 9.91 EtOAc 0.68 667.2 22.24
Từ bảng 3.4 cho thấy hàm lƣợng polyphenol trong phân đoạn cao EtOAc chiếm tỉ lệ cao nhất (22.24%), tiếp đó là n-hexan (9.91%) và thấp nhất là ethanol (9.24%).
Từ kết quả trên ta thấy rằng, thành phần hoá học từ dịch chiết của cây Tục đoạn chứa nhiều hợp chất có khả năng tan tốt trong cao ethylacetate. Điều này phù hợp với tính chất vật lý và sự phân cực của phân tử polyphenol, chúng tan tốt trong dung môi ít phân cực và ít tan trong dung môi phân cực.
30
KẾT LUẬN
Một số phân đoạn dịch chiết từ cây Tục đoạn chứa thành phần hợp chất thiên nhiên khá phong phú bao gồm: Flavonoid, tannin, alkaloid, glucosid và sapomin. Trong đó, cao phân đoạn ethanol và ethylacetate chứa hàm lƣợng polyphenol cao hơn cả.
31
KIẾN NGHỊ
Cần tiếp tục nghiên cứu về loài Tục đoạn cũng nhƣ các loài thảo dƣợc khác để hƣớng tới điều chế, thử nghiệm thực phẩm chức năng các đối tƣợng này để điều trị bệnh đặc biệt là bệnh béo phì và đái tháo đƣờng.
32
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1.Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y Học
2.Nguyễn Văn Đàn, Ngô Ngọc Khuyến (1999), Hợp chất thiên nhiên dùng làm thuốc, Nxb Y học Hà Nội.
3.Phạm Thanh Kỳ (1998), Bài giảng dược liệu, tập II, Nxb Đại học Dƣợc Hà Nội.
4.Nguyễn Thị Thu Lan (2007), Bài giảng hoá học các hợp chất thiên nhiên, Khoa hoá, Đại học Khoa học, Đại học Huế.
5.Nguyễn Hoàng Lộc, Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực
vật, Viện Tài nguyên Môi trƣờng và Công nghệ sinh học, Đại học Huế.
6.Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam (tái bản có bổ
sung), Nxb khoa học kĩ thuật.
7.Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập chất hữu cơ, Đại học Quốc Gia TP HCM.
8. TS. Đỗ Thị Tuyên, Bài giảng công nghệ tách chiết các hợp chất thứ sinh,
Viện Công Nghệ Sinh học Việt Nam.
9. Nguyễn Minh Thảo (1998), Hoá học các hợp chất dị vòng, NXB Giáo Dục.
10.Oanh Vũ (2009), “Nuôi cấy tế bào để sản xuất các hợp chất thứ cấp”,Tạp
chí Stinfo, trang 12 – 14.
Tài liệu tiếng anh
11.Cragg G.M., Schepartz S.A., Suffuess M., Grever M.R. (1993), The taxol
supply crisis. New NCI policies for handling the large - scale production of novel natural product anticancer and anti - HIV agents, Journal of
33
12. Fett - Neto A.G., Stewart J.M., Nicholson S.A., Pennington J.J., and Dicosmo F. (1994), Improved taxol yield by aromatic carboxylic acid and amino acid feeding to cell cultures of T. cuspidata. Biotechnology
Bioengineering: 967-971.
13. Harborne, J. B. and F. A. Tomas-Barberan (eds.) (1991). Ecological
Chemistry and Biochemistry of the Plant Terpernoids. Oxford Univ.
Press, Oxford.
14.Rao SR (2000) Biotechnological production of phyto-pharmaceuticals.
Journal of Biochemistry Molecular Biology Biophysics: 73-102
15. Slichenmyer W.J., Von Horf D.D. (1991) Taxol: a new and effective
anticancer drug. Anti-Cancer Drug: 519-530
16. Srinivasan V., Pestchanker L., Hirasuma MT., Taticek R.A., and Shuler M.L. (1995) Taxol production in bioreactor; kinetics of biomass accumulation, nutrient uptake, and taxol production by cell suspensions of Taxus baccata. Biotechnol Bioeng: 666 - 676.
17. Wani M.C., Taylor H.L., Wall M.E., Coggon P., and McPhail A.T., (1971) Plant antitumor agents VI. The isolation and structure of taxol, a
novel antileukemic and antitumor agents from Taxus brevifolia. Journal of American Chemical Society: 2325-2327
18. Yamada Y., and Sato F. (1981) Production of berberine in cultured cells
of Coptis japonica. Phytochemistry: 545-547.
19. Zheng H.Z., Dong Z.H., and She J. (1977) Longdan. In. Modern Study of
traditional Chinese Medicine 2: 1398-1408. Beijing Xue Yuan Press, Bijing, China.