1.6.1.1. Phân loại E. coli [2]
Vi khuẩn E. coli thuộc:
Vực Bacteria. Ngành Proteobacteria. Bộ Enbacteriales. Họ Enterobacteriaceae. Tộc Escherichiae. Chi Escherichia. Loài E. coli.
Hình 1.3.Vi khuẩn E.coli 1.6.1.2. Đặc điểm hình thái của E. coli[11]
E. coli là một trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 2 x 0,6µm
đến 3 x 0,6µm. Trong cơ thể động vật, chúng có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Có khi thấy trong môi trường nuôi cấy có những trực khuẩn dài từ 4µm đến 8µm, những loại này thường gặp trong canh khuẩn già. Phần
lớn E. coli di động do có lông ở xung quanh thân nhưng có một số thấy không di
động. Vi khuẩn không hình thành nha bào, có thể có giáp mô. Vi khuẩn E. coli bắt màu gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu.
1.6.1.3. Tính chất nuôi cấy
Vi khuẩn E. coli dễ dàng phát triển ở môi trường nuôi cấy thông thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp nên người ta đã chọn chúng để nghiên cứu về sinh vật học.
E. coli là trực khuẩn gram âm hiếu khí tùy ý, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ
5 – 400C, nhiệt độ thích hợp nhất là 370C pH thích hợp nhất là 7,2 – 7,4 phát triển được ở pH từ 5,5 – 8.
Môi trường thạch thường: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt bóng láng, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2 -3 mm. Nếu nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra.
Môi trường nước thịt: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C vi khuẩn E. coli phát triển rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màng màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có mùi thối.
Môi trường MacConkey: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, khuẩn lạc có màu cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường.
Môi trường EMB (Eosin Methyl Blue): sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc màu tím đen có ánh kim.
1.6.1.4. Khả năng gây bệnh của E.coli
Vi khuẩn E. coli có thể gây ra bệnh viêm dạ dày, ruột hay gặp ở trẻ em E.
coli có thể gây nhiễm trùng đường tiết niệu, đường gan, mật. Nhiễm trùng vết thương,
vết bỏng, viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa, viêm xoang, viêm màng não mũ ở trẻ sơ sinh, nhiễm khuẩn huyết.
1.6.2. Staphylococcus aureus [11]
1.6.2.1. Phân loại Staphylcoccus aureus
Vực Bacteria. Giới Eubacteria. Ngành Firmicutes. Lớp Bacilli.
Bộ Bacillales.
Họ Staphylococcaceae. Chi Staphylococcus. Loài S.aureus.
Hình 1.4.Vi khuẩn S.aureus 1.6.2.2. Đặc điểm hình thái của S.aureus [10] [13]
Staphilococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, Gram dương (+),
hình cầu, tụ thành chùm, đôi khi từng tế bào đơn hay từng đôi. Trong tự nhiên,
Staphilococcus aureus thường được tìm thấy trên da, mũi, tóc hay lông của các loài
động vật máu nóng.
Hầu hết các dòng Staphilococcus aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trường có nhiệt độ trên 150C, nhiều nhất khi tăng trưởng ở 35 – 370C.
1.6.2.3. Tính chất nuôi cấy
Vi khuẩn S.aureus có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ rất rộng từ 7 – 480C, với nhiệt độ cực thuận là 30 – 450C, khoảng pH 4,2 – 9,3, với pH cực thuận là 7 -7,5 và trong môi trường chứa trên 15% NaCl. Tụ cầu bền vững khi có nồng độ đường cao, nhưng bị ức chế bởi nồng độ 60%, nồng độ từ 33 - 55%, tụ cầu vẫn phát triển, trong khi các vi khuẩn khác như Shigella và Salmonella bị ức chế. Ngoài ra, chúng còn có khả năng bám dính tốt trên nhiều loại tế bào và máy móc thiết bị giúp gia tăng tính kháng của tụ cầu với sự sấy khô và lọc thấm. Chính nhờ những đặc điểm trên giúp S. aureus có sự phân bố rộng, chủ yếu được phân lập từ da, màng nhày, tóc
và mũi của người và động vật máu nóng. S. aureus được cho là vi khuẩn khá mạnh có thể sống tốt bên ngoài kí chủ. Vi khuẩn này còn có mặt trong không khí, bụi và trong nước dù chúng thiếu tính di động và rất nhạy với thuốc kháng sinh và chất diệt khuẩn. Tuy nhiên, S. aureus cũng khá nhạy với nhiệt độ, bị diệt ở 600C từ 2-50 phút tùy từng loại thực phẩm và là vi sinh vật cạnh tranh yếu, dễ bị các vi sinh vật khác ức chế.
1.6.2.4. Khả năng gây bệnh của S.aureus
Khi ăn phải thực phẩm có chứa các độc tố này, sau 4 - 6 giờ người bị ngộ độc có các triệu chứng tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 - 8 giờ. Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như jambon, kem tổng hợp, nước súp (ít khi được xử lý ở nhiệt độ cao trên 400C) và các loại thủy sản, thực phẩm đóng hộp thường hay nhiễm loại vi sinh vật này. Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trình chế biến.
Vi khuẩn S.aureus là tác nhân gây nhiều bệnh nhiễm trùng như: mụn nhọt,
chốc lở, viêm da, viêm phổi, viêm não, viêm tủy xương, viêm cơ tim, viêm màng trong tim, viêm màng ngoài tim, đường tiết niệu, hệ thần kinh trung ương, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết thương hậu phẫu.
Người tiêu dùng bị ngộ độc thực phẩm là do ăn uống trúng độc tố ruột của
S.aureus cư trú trong đường ruột chiếm ưu thế về số lượng. S.aureus có thể bị nhiễm
từ người chế biến sẽ sinh sôi trong thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng thích hợp. Khả năng trúng độc phụ thuộc vào số lượng độc tố, loại độc tố, khả năng kháng của cơ thể.
1.6.3. Salmonella [11]
Hình 1.5. Vi khuẩn Salmonella
Salmonella là trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn có kích thước khoảng
0,4 – 0,6 x 1- 3 µm, không hình thành giáp mô và nha bào, có lông và di động được. Vi khuẩngram âm (-), lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indole, không phân giảiure, không có khả năng tách nhóm amin từ tryptophan hầu hết các chủng đều sinh H2S.
1.6.3.2. Tính chất nuôi cấy
Salmonella là vi khuẩn hiếu khí tùyý nhưng phát triển tốt trong điều kiện hiếu
khí, chúng có thể sốngở nhiệt độ từ 5,2 – 46,20C và pH từ 3,7 – 9,5, nhưng phát triển tốt nhấtở 370C và pH 6,8 – 7,2. Salmonella dễ phát triển trên các môi trường dinh
dưỡng thông thường khi nuôi cấy trong khoảng 24 giờ, nhưng trên môi trường thạch BSA (Bismuth Sulfite Agar) thì phải nuôi cấy trong 48 giờ.
Trên môi trường canh sau khi nuôi cấy 5 – 6 giờ thì làmđục nhẹ môi trường, sau 18 giờ làmđục đều, nếu nuôi cấy lâu hơn 24 giờ thì môi trường có lắng cặn.
Trên môi trường thạch thường vi khuẩn có khuẩn lạc dạng S tròn, lồi, trơn láng, bờ đều, thường không màu hay màu trắng xám. Đôi khi tạo khuẩn lạc dạng R, kích thước khuẩn lạc thường trong khoảng 2 – 4 mm.
Trên môi trường thạch MacConkey vi khuẩnSalmonella mọc thành những khuẩn lạc tròn, đường kính 2 - 3 mm, trong suốt, không màu, sáng, nhẵn bóng, hơi lồiở giữa.
Trên môi trường BSA (Bismuth Sulfite Agar) Salmonella cho khuẩn lạc có màuđen, thường cóánh kim bao quanh.
1.6.3.3. Khả năng gây bệnh của Salmonella
Salmonella gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện đến mức cả triệu tế bào trong
một gam thực phẩm. Các triệu chứng biểu hiện: nôn mửa, tiêu chảy. Thời gian ủ bệnh kể từ khi tiêu thụ thực phẩm cho đến khi các triệu chứng được biểu hiện là 12 - 36 giờ, triệu chứng ngộ độc kéo dài từ 2 đến 7 ngày. Các loại sản phẩm có nguy cơ nhiễm
Salmonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và các sản phẩm từ trứng, thủy
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu
- Cây Sả Chanh: mua tại chợ Vĩnh Hải – Thành phố Nha Trang.
- Ba chủng vi sinh vật: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella. Địađiểm lấy chủng: Bộ sưu tập vi sinh vật phòng thí nghiệm Hóa sinh trườngĐại học Nha Trang.
Địa điểm nghiên cứu
Các phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, phòngthí nghiệm Hóa sinh thuộc trung tâm thí nghiệm thực hànhtại trường Đại học Nha Trang.
Thời gian nghiên cứu
Từ ngày 02/02/2015 đến ngày 07/06/2015.
2.2. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu Dụng cụ Dụng cụ
Đĩa petri: dùng để cấy vi khuẩn. Que cấy vòng: cấy phân lập vi khuẩn.
Que cấy trang: dùng để trang đều vi khuẩn trên bề mặt thạch. Ống nghiệm: pha loãng vi khuẩn.
Đèn cồn: khử trùng que cấy.
Pipet man: hút mẫu với thể tích nhỏ (10-100µl). Cốc thủy tinh 100 ml, 250 ml.
Giá ống nghiệm. Phễu lọc: lọc mẫu.
Bình tam giác: dùng để chiết mẫu. Ốngđong 100ml.
Hóa chất
- Dung môi: + Ethanol 99,50. + Ethanol 700.
+ Aceton 99,5%. + Nước.
Địa chỉ mua: cửa hàng hóa chất và dụng cụ thí nghiệm Hoàng Trang, 42 Hoàng Hoa Thám - Lộc Thọ - thành phố Nha Trang.
- Môi trường cấy vi khuẩn: Nutrient agar (NA).
Địa chỉ cung cấp: Phòng thí nghiệm Hóa sinh trườngĐại học Nha Trang.
Thiết bị nghiên cứu
- Tủ sấy dụng cụ: + Xuất xứở Đức.
+ Thang nhiệt độ: 5oC – 300oC.
+ Thời gian cài đặt: 0 – 99,59 giờ và hoạt động liên tục. - Nồi hấp vô trùng:
+ Xuất xứĐài Loan. + Dung tích: 50 lít.
+ Nhiệt độ thích hợp: 121 – 132oC. + Thang áp suất: 0 – 2.1kg/cm2. - Box cấy:
+ Xuất xứ Tây Ban Nha.
+ Độ chiếu sáng : 800 Lux trong buồng làm việc. + Độ ồn khi hoạt động : < 55 dB.
+ Màng lọc HEPA H14 – DOP – Class 10 với độ lọc hữu hiệu 99.999% cho các tiểu phân có kích thước > 0.3µm.
+ Lưu lượng khí thổi 1000 m3/h theo phương thẳng đứng. + Kích thước bên trong tủ : 1230 x 700 x 670 mm.
+ Kích thước bên ngoài tủ : 1230 x 1290 x 845 mm. + Trọng lượng : 140 kg.
- Máy cô quay chân không: + Xuất sứ Thụy sĩ.
+ Có thể tự động chưng với bộ điều khiển chân không V – 850. + Điện thế: 230V.
+ Công suất: 120W. + Tần số: 50/ 60Hz. + Vận tốc: 20 – 280rpm.
2.3. Nội dung nghiên cứu
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Sả.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Sả.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu
- Phương pháp thu mẫu: Sả được đặt mua từng ngày tại một hàng rau cố định ở chợ Vĩnh Hải – thành phố Nha Trang, Sả đảm bảo cùng độ tươi, cùng kích thước, được thu hoạch và mua vào buổi sáng mỗi ngày.
- Phương pháp xử lý mẫu: Sả mua về được cắt bỏ bớt lớp vỏ bên ngoài, lấy một đoạn khoảng 5 – 7 cm tính từ gốc lên thân, sau đó đem đi rửa sạch, để ráo nước, thái mỏng, rồi đem xay. Thao tác phải được tiến hành nhanh, Sả sau khi xay nhỏ được cho vào bình có nắp đậy kín để các thành phần hóa học trong Sả không bị oxy hóa. Sử dụng phương pháp dùng dung môi ngâm chiết để tách chiết tinh dầu Sả. Nguyên liệu được ngâm trong dung môi với một tỉ lệ xác định và ở một nhiệt độ, thời gian xác định.
2.4.2. Bố trí thí nghiệm
2.4.2.1. Lập sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Nguyên liệu Xử lý Xay Cân (7g) Chiết Dung môi Nồng độ dung môi Tỉ lệ NL/DM Nhiệt độ Thời gian Lọc
Cô quay chân không
Xác định khả năng kháng khuẩn: - Cấy vi khuẩn.
- Đo đường kính vòng tan
Thuyết minh quy trình:
- Nguyên liệu: chọn Sả tươi, không bị dập nát, sâu bọ.
- Xử lý: tiến hành loại bỏ bớt các bẹ già bên ngoài, chỉ lấy phần thân Sả (tính từ gốc lên thân khoảng 5 – 7 cm).
+ Rửa sạch: loại bỏ bớt lớp phấn, cát bụi trên thân Sả. + Để ráo: để thân Sả khô khoảng 5 phút.
+ Thái mỏng: sau khi ráo nước, tiến hành thái mỏng Sả để giúp quá trình xay được thuận lợi.
- Xay: cho Sả đã cắt khúc vào cối xay, tiến hành xay cho Sả nhỏ. - Cân: tiến hành cân mẫu, mỗi mẫu 7 g.
- Chiết: ta tiến hành chiết các mẫu Sả đã cân với các thông số đã chọn. - Lọc: sau khi chiết xong tiến hành lọc mẫu thu dịch chiết.
- Cô quay chân không: tiến hành lấy dịch chiết đem cô quay chân không để đuổi dung môi, cô quay đến khi thể tích dịch chiết trong bình cầu còn 10 ml.
- Xác định hoạt tính kháng khuẩn: tiến hành dùng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch đểxác định khả năng kháng khuẩn của dịch chiết. sau khi cấy xong đem ủ cácđĩa trong tủấm với nhiệt độ 370C thời gian 24 giờ. Sau 24 giờ tiến hànhđọc kết quả, đo đường kính vòng tan.
- Chọn thông số chiết: dựa vào kết quả xác định khả năng kháng khuẩn ta lựa chọn được thông số chiếtthích hợp để dịch chiết có khả năng kháng khuẩn tốt nhất.
2.4.2.2. Thí nghiệm 1: khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Sả
D.Ganjewala đã dùng dung môi nước nóng và ethanol để chiết tinh dàu Sả Chanh, và lấy đó là cơ sở khoa học để chọn dung môi chiết cho đề tài.
Hình 2.2.Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ Sả Chanh
Nguyên liệu xử lý xay Cân (7g) chiết Tỉ lệ NL/DM: 1/10 Nhiệt độ thường Thời gian: 4 giờ
Nước Ethanol 70% Aceton 70%
Lọc
Cô quay chân không
Xác định khả năng kháng khuẩn
Cách tiến hành:
Thân Sảđược đem đi xay nhỏ, tiến hành chiết với 3 loại dung môi khác nhau gồm nước nóng, ethanol 70%, aceton 70%. Tỷlệ nguyên liệu/dung môi cố định là 1/10 tương ứng 7g Sảchiết với 70ml dung môi, chiết ở nhiệt độ phòng, thời gian chiết là 4 giờ. Sau đó ta tiến hành đem lọc để loại phần bã thu lấy dịch chiết, đem dịch chiết đi cô quay chân không và tiến hànhxác định khả năng kháng khuẩn. Dựa vào kết quả xác định khả năng kháng khuẩn ta lựa chọn được dung môi thích hợp để dịch chiết có khả năng kháng khuẩn tốt nhất.
2.4.2.3. Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Sả khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Sả
Việc bố trí thí nghiệm này nhằm tìm ra được nồng độ dung môi thích hợp nhất để chiết tinh dầu Sả Chanh, thu được dịch chiết có khả năng kháng khuẩn tốt nhất.
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ Sả Chanh
Nguyên liệu Xử lý Xay Cân (7g) Chiết Dung môi: TN1. Tỉ lệ NL/DM: 1/10 Nhiệt độ thường Thời gian: 4 giờ
60% 70% 80% 90%
Lọc
Cô quay chân không
Xác định khả năng kháng khuẩn
Cách tiến hành:
Cho vào 4 lọ thủy tinh mỗi lọ 7 g Sả, cho 70 ml dung môi đã được xác định tại thí nghiệm 1 vào tương ứngvới tỷ lệ NL/DM = 1/10, nồng độ dung môi lần lượt cho vào 4 lọ là 60%, 70%, 80%, 90%, rồi đậy nắp lọ vào cho kín. Sau đó ta tiến hành chiết ở nhiệt độ phòng.
Sau 4 giờ ta tiến hành lọc lấy dịch chiết. sau đó lấy dịch chiết đi cô quay chân không và tiến hànhxác định khả năng kháng khuẩn.
Dựa vào kết quả xác định khả năng kháng khuẩn, ta lựa chọn nồng độ dung môi thích hợp để dịch chiết có khả năng kháng khuẩn cao nhất.
2.4.2.4. Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Sả đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Sả
Việc bố trí thí nghiệm này nhằm tìm ra được tỉ lệ nguyên liệu/dung môi thích