1.5.1. Nghiên cứu trong nước
Từ lâu cây Sả đã được biết đến như một loại gia vị trong ngành thực phẩm, nó làm tăng hương vị cho món ăn, giúp món ăn hài hòa và hấp dẫn hơn. Bên cạnh đó, cây Sả được ông cha ta xem như là cây thuốc quý dùng để chữa các bệnh truyền nhiễm, các bệnh về đường tiêu hóa như đau bụng, tiêu chảy...
Tuy nhiên, dịch chiết từ cây Sả thì hầu như ít được quan tâm, chỉ có vài bài được công bố như:
+ Phùng Thị Ái Hữu - Đại học Đà Nẵng đã nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học tinh dầu cây Sả Chanh ở quận Cẩm Lệ Đà Nẵng [6].
+ Nguyễn Quốc Châu Thanh - Đại học Cần Thơ đã khảo sát cácđiều kiện tốiưu khi ly trích tinh dầu Sả Chanh bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước, đồng thời phân tích thành phần hóa học của tinh dầu bằng máy sắc ký ghép khối phổ(GC – MS). Kết quả cho thấy thời gian ly trích tinh dầu thân Sả Chanh là 240 phút và lá Sả Chanh là 150 phút, thể tích nước cất là 500 ml, nhiệt độ là 1500C. Thành phần chính của tinh dầu là cis–citral và trans-citral. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng tinh dầu Sả Chanh có khả năng chốngoxy hóa vàức chế khả năng phát triển của một số loạivi khuẩn, vi nấm là khá tốt [3].
- Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội cũng đã nghiên cứu về lợi ích của cây Sả Chanh, nhưng khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ Sả vẫn là vấn đề đang được nghiên cứu.
1.5.2. Nghiên cứu ngoài nước
Trên thế giới, hoạt tính kháng khuẩn của các loại tinh dầu thực vật đã được quan tâm và nghiên cứu từ rất lâu, và đã có những nghiên cứu được công bố.
+ Năm 2003, Kazuhico Nakahara và các cộng sựđã nghiên cứu về thành phần hóa học, khả năng kháng nấm của tinh dầu Sả chiết xuất từ loài SảC.nadus, Các thành phần chính của dầu là geraniol (35,7% tổng số chất dễ bay hơi), trans-citral (22,7%), cis-citral (14,2%), geranyl axetat (9,7%), citronellal (5,8%) và citronellol (4,6%). Xét nghiệm kháng nấm sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch cho thấy tinh dầu thô rõ rệt ức chế sự tăng trưởng của một số loài Aspergillus, Penicillium và Eurotium ở liều 250 mg / L trong không khí [19].
+ Năm 2008, Luiz Cláudio Almeida Barbosa và các cộng sự đã nghiên cứu về thành phần hóa học và công dụng của loài Sả C.citratus tại nước Brazil, Trong một số tiểu bang của Brazil, Sả Chanh là cây thuốc phổ biến, phạm vi sử dụng phổ biến của nó là khá rộng, chẳng hạn như: phục hồi, tiêu hóa, hiệu quả chống lại cảm lạnh, giảm đau, chống viêm ống dẫn nước tiểu, lợi tiểu, chống co thắt, ra mồ hôi và chống dị ứng. thành phần hóa học của tinh dầu C.citratus thay đổi tùy theo nguồn gốc địa lý, các hợp chất như hydrocarbon terpenes, rượu, xeton, este và chủ yếu là aldehyde, limonene một trong những hợp chất thường xuyên thấy nhất của monoterpene trong các loại tinh dầu, cũng được tìm thấy trong dầu Sả Chanh [21].
+ Năm 2009, D.Ganjewala đã nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu, các chi Cymbopogon (Poaceae) cho ra các loại dầu thiết yếu quan trọng nhất. Các loại dầu từ các loài sả được sử dụng rộng rãi để làm hương vị, mỹ phẩm, xà phòng, chất tẩy rửa, nước hoa do hương chanh điển hình của tinh dầu. Tinh dầu Sả và thành phần chất trong đó ví dụ citral, geraniol, citronellol, citronellal và piperitone, đã được biết là có ấn tượng hoạt động kháng khuẩn, kháng nấm, diệt côn trùng, thuốc chống côn trùng trong một thời gian dài. Tuy nhiên, các ý nghĩa sinh
học và dược lý của các loại tinh dầu đã được mở rộng nhanh chóng trong mười năm trước; chống viêm, chống ung thư, chống gốc tự do và hữu ích khác của tinh dầu hoạt động hiện nay đã được chứng minh [18].
+ Cũng vào năm 2009, Koffi Koba, Komla Sanda và các cộng sựđã nghiên cứu về hoạt động gây độc tế bào trong ống nghiệm từ tinh dầu của hai loại Sả
C.citratus vàC.nadus, thành phần phần trăm cho thấy các thành phần chính của các
loại tinh dầu mẫu lần lượt là geranial (45,2%), neral (32,4%) và myrcene (10,2%) cho dầu C. citratus vàcitronellal (35,5%), geraniol (27,9%) và citronellol (10,7%) cho dau
C.nardus. Trong ống nghiệm sinh trắc nghiệm khả năng gây độc trên dòng tế bào của
con người HaCattiết lộ rằng độc tính của tinh dầu từ C. citratus (IC50: 150 μL.mL- 1) cao hơn so với tinh dầu từC.nardus (IC50: 450 μL.mL-1).Những kết quả thực nghiệm đã chứng minh rằng, trong bốn thành phần chính của cả hai thử nghiệm các loại tinh dầu, neral, geranial và citronellal là có khả năng gây độc cao cho dòng tế bào HaCaT. Do đó, tác dụng gây độc tế bào của các loại dầu thiết yếu của C.citratus và C. nardus tìm thấy trong nghiên cứu này chắc chắn làdo thành phầncitral (neral và geranial) [20].
+ Năm 2014, Christopher E.Ekpenyuong và các cộng sựđã nghiên cứu về cácứng dụng của tinh dầu Sả và khả năng gây độc đến sức khỏe con người, nghiên cứu trên thành phần của tinh dầu có ghi nhận sự hiện diện của tannin, saponin, flavonoid, phenol, anthraquinon, alkaloids, Deoxysugars và các thành phần tinh dầu khác nhau trong các loại thảo dược. Chất chuyển hóa hoạt động thứ cấp của một số thành phần cũng có liên quan đến các tác dụng dược lý khác nhau của, bao gồm cả độc tính của nó. Tinh dầuC. citratuslà tương đối an toàn cho tiêu dùng ở bất kỳ liều lượng, tuy nhiên gần đây đã cóbằng chứng cho thấy trong thành phần tinh dầucó một số hợp chất cóthể có khả năng gây độc cho người tiêu dùng. C.citratusnên được sử dụng thận trọng đối với các bệnh nhân bị bệnh thận và gan, phụ nữ mang thai hoặc cho con bú, bệnh nhân dùng thuốc kháng tiểu cầu hoặc rối loạn đông máu [17].
1.6. Giới thiệu về các chủng vi sinh vật 1.6.1. Escherichia coli 1.6.1. Escherichia coli
1.6.1.1. Phân loại E. coli [2]
Vi khuẩn E. coli thuộc:
Vực Bacteria. Ngành Proteobacteria. Bộ Enbacteriales. Họ Enterobacteriaceae. Tộc Escherichiae. Chi Escherichia. Loài E. coli.
Hình 1.3.Vi khuẩn E.coli 1.6.1.2. Đặc điểm hình thái của E. coli[11]
E. coli là một trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 2 x 0,6µm
đến 3 x 0,6µm. Trong cơ thể động vật, chúng có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Có khi thấy trong môi trường nuôi cấy có những trực khuẩn dài từ 4µm đến 8µm, những loại này thường gặp trong canh khuẩn già. Phần
lớn E. coli di động do có lông ở xung quanh thân nhưng có một số thấy không di
động. Vi khuẩn không hình thành nha bào, có thể có giáp mô. Vi khuẩn E. coli bắt màu gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu.
1.6.1.3. Tính chất nuôi cấy
Vi khuẩn E. coli dễ dàng phát triển ở môi trường nuôi cấy thông thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp nên người ta đã chọn chúng để nghiên cứu về sinh vật học.
E. coli là trực khuẩn gram âm hiếu khí tùy ý, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ
5 – 400C, nhiệt độ thích hợp nhất là 370C pH thích hợp nhất là 7,2 – 7,4 phát triển được ở pH từ 5,5 – 8.
Môi trường thạch thường: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt bóng láng, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2 -3 mm. Nếu nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra.
Môi trường nước thịt: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C vi khuẩn E. coli phát triển rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màng màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có mùi thối.
Môi trường MacConkey: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, khuẩn lạc có màu cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường.
Môi trường EMB (Eosin Methyl Blue): sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc màu tím đen có ánh kim.
1.6.1.4. Khả năng gây bệnh của E.coli
Vi khuẩn E. coli có thể gây ra bệnh viêm dạ dày, ruột hay gặp ở trẻ em E.
coli có thể gây nhiễm trùng đường tiết niệu, đường gan, mật. Nhiễm trùng vết thương,
vết bỏng, viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa, viêm xoang, viêm màng não mũ ở trẻ sơ sinh, nhiễm khuẩn huyết.
1.6.2. Staphylococcus aureus [11]
1.6.2.1. Phân loại Staphylcoccus aureus
Vực Bacteria. Giới Eubacteria. Ngành Firmicutes. Lớp Bacilli.
Bộ Bacillales.
Họ Staphylococcaceae. Chi Staphylococcus. Loài S.aureus.
Hình 1.4.Vi khuẩn S.aureus 1.6.2.2. Đặc điểm hình thái của S.aureus [10] [13]
Staphilococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, Gram dương (+),
hình cầu, tụ thành chùm, đôi khi từng tế bào đơn hay từng đôi. Trong tự nhiên,
Staphilococcus aureus thường được tìm thấy trên da, mũi, tóc hay lông của các loài
động vật máu nóng.
Hầu hết các dòng Staphilococcus aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trường có nhiệt độ trên 150C, nhiều nhất khi tăng trưởng ở 35 – 370C.
1.6.2.3. Tính chất nuôi cấy
Vi khuẩn S.aureus có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ rất rộng từ 7 – 480C, với nhiệt độ cực thuận là 30 – 450C, khoảng pH 4,2 – 9,3, với pH cực thuận là 7 -7,5 và trong môi trường chứa trên 15% NaCl. Tụ cầu bền vững khi có nồng độ đường cao, nhưng bị ức chế bởi nồng độ 60%, nồng độ từ 33 - 55%, tụ cầu vẫn phát triển, trong khi các vi khuẩn khác như Shigella và Salmonella bị ức chế. Ngoài ra, chúng còn có khả năng bám dính tốt trên nhiều loại tế bào và máy móc thiết bị giúp gia tăng tính kháng của tụ cầu với sự sấy khô và lọc thấm. Chính nhờ những đặc điểm trên giúp S. aureus có sự phân bố rộng, chủ yếu được phân lập từ da, màng nhày, tóc
và mũi của người và động vật máu nóng. S. aureus được cho là vi khuẩn khá mạnh có thể sống tốt bên ngoài kí chủ. Vi khuẩn này còn có mặt trong không khí, bụi và trong nước dù chúng thiếu tính di động và rất nhạy với thuốc kháng sinh và chất diệt khuẩn. Tuy nhiên, S. aureus cũng khá nhạy với nhiệt độ, bị diệt ở 600C từ 2-50 phút tùy từng loại thực phẩm và là vi sinh vật cạnh tranh yếu, dễ bị các vi sinh vật khác ức chế.
1.6.2.4. Khả năng gây bệnh của S.aureus
Khi ăn phải thực phẩm có chứa các độc tố này, sau 4 - 6 giờ người bị ngộ độc có các triệu chứng tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 - 8 giờ. Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như jambon, kem tổng hợp, nước súp (ít khi được xử lý ở nhiệt độ cao trên 400C) và các loại thủy sản, thực phẩm đóng hộp thường hay nhiễm loại vi sinh vật này. Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trình chế biến.
Vi khuẩn S.aureus là tác nhân gây nhiều bệnh nhiễm trùng như: mụn nhọt,
chốc lở, viêm da, viêm phổi, viêm não, viêm tủy xương, viêm cơ tim, viêm màng trong tim, viêm màng ngoài tim, đường tiết niệu, hệ thần kinh trung ương, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết thương hậu phẫu.
Người tiêu dùng bị ngộ độc thực phẩm là do ăn uống trúng độc tố ruột của
S.aureus cư trú trong đường ruột chiếm ưu thế về số lượng. S.aureus có thể bị nhiễm
từ người chế biến sẽ sinh sôi trong thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng thích hợp. Khả năng trúng độc phụ thuộc vào số lượng độc tố, loại độc tố, khả năng kháng của cơ thể.
1.6.3. Salmonella [11]
Hình 1.5. Vi khuẩn Salmonella
Salmonella là trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn có kích thước khoảng
0,4 – 0,6 x 1- 3 µm, không hình thành giáp mô và nha bào, có lông và di động được. Vi khuẩngram âm (-), lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indole, không phân giảiure, không có khả năng tách nhóm amin từ tryptophan hầu hết các chủng đều sinh H2S.
1.6.3.2. Tính chất nuôi cấy
Salmonella là vi khuẩn hiếu khí tùyý nhưng phát triển tốt trong điều kiện hiếu
khí, chúng có thể sốngở nhiệt độ từ 5,2 – 46,20C và pH từ 3,7 – 9,5, nhưng phát triển tốt nhấtở 370C và pH 6,8 – 7,2. Salmonella dễ phát triển trên các môi trường dinh
dưỡng thông thường khi nuôi cấy trong khoảng 24 giờ, nhưng trên môi trường thạch BSA (Bismuth Sulfite Agar) thì phải nuôi cấy trong 48 giờ.
Trên môi trường canh sau khi nuôi cấy 5 – 6 giờ thì làmđục nhẹ môi trường, sau 18 giờ làmđục đều, nếu nuôi cấy lâu hơn 24 giờ thì môi trường có lắng cặn.
Trên môi trường thạch thường vi khuẩn có khuẩn lạc dạng S tròn, lồi, trơn láng, bờ đều, thường không màu hay màu trắng xám. Đôi khi tạo khuẩn lạc dạng R, kích thước khuẩn lạc thường trong khoảng 2 – 4 mm.
Trên môi trường thạch MacConkey vi khuẩnSalmonella mọc thành những khuẩn lạc tròn, đường kính 2 - 3 mm, trong suốt, không màu, sáng, nhẵn bóng, hơi lồiở giữa.
Trên môi trường BSA (Bismuth Sulfite Agar) Salmonella cho khuẩn lạc có màuđen, thường cóánh kim bao quanh.
1.6.3.3. Khả năng gây bệnh của Salmonella
Salmonella gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện đến mức cả triệu tế bào trong
một gam thực phẩm. Các triệu chứng biểu hiện: nôn mửa, tiêu chảy. Thời gian ủ bệnh kể từ khi tiêu thụ thực phẩm cho đến khi các triệu chứng được biểu hiện là 12 - 36 giờ, triệu chứng ngộ độc kéo dài từ 2 đến 7 ngày. Các loại sản phẩm có nguy cơ nhiễm
Salmonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và các sản phẩm từ trứng, thủy
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu
- Cây Sả Chanh: mua tại chợ Vĩnh Hải – Thành phố Nha Trang.
- Ba chủng vi sinh vật: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella. Địađiểm lấy chủng: Bộ sưu tập vi sinh vật phòng thí nghiệm Hóa sinh trườngĐại học Nha Trang.
Địa điểm nghiên cứu
Các phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, phòngthí nghiệm Hóa sinh thuộc trung tâm thí nghiệm thực hànhtại trường Đại học Nha Trang.
Thời gian nghiên cứu
Từ ngày 02/02/2015 đến ngày 07/06/2015.
2.2. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu Dụng cụ Dụng cụ
Đĩa petri: dùng để cấy vi khuẩn. Que cấy vòng: cấy phân lập vi khuẩn.
Que cấy trang: dùng để trang đều vi khuẩn trên bề mặt thạch. Ống nghiệm: pha loãng vi khuẩn.
Đèn cồn: khử trùng que cấy.
Pipet man: hút mẫu với thể tích nhỏ (10-100µl). Cốc thủy tinh 100 ml, 250 ml.
Giá ống nghiệm. Phễu lọc: lọc mẫu.
Bình tam giác: dùng để chiết mẫu. Ốngđong 100ml.
Hóa chất
- Dung môi: + Ethanol 99,50. + Ethanol 700.
+ Aceton 99,5%. + Nước.
Địa chỉ mua: cửa hàng hóa chất và dụng cụ thí nghiệm Hoàng Trang, 42 Hoàng Hoa Thám - Lộc Thọ - thành phố Nha Trang.
- Môi trường cấy vi khuẩn: Nutrient agar (NA).
Địa chỉ cung cấp: Phòng thí nghiệm Hóa sinh trườngĐại học Nha Trang.
Thiết bị nghiên cứu
- Tủ sấy dụng cụ: + Xuất xứở Đức.
+ Thang nhiệt độ: 5oC – 300oC.
+ Thời gian cài đặt: 0 – 99,59 giờ và hoạt động liên tục. - Nồi hấp vô trùng:
+ Xuất xứĐài Loan. + Dung tích: 50 lít.
+ Nhiệt độ thích hợp: 121 – 132oC. + Thang áp suất: 0 – 2.1kg/cm2. - Box cấy:
+ Xuất xứ Tây Ban Nha.
+ Độ chiếu sáng : 800 Lux trong buồng làm việc. + Độ ồn khi hoạt động : < 55 dB.
+ Màng lọc HEPA H14 – DOP – Class 10 với độ lọc hữu hiệu 99.999% cho các tiểu phân có kích thước > 0.3µm.
+ Lưu lượng khí thổi 1000 m3/h theo phương thẳng đứng. + Kích thước bên trong tủ : 1230 x 700 x 670 mm.
+ Kích thước bên ngoài tủ : 1230 x 1290 x 845 mm. + Trọng lượng : 140 kg.
- Máy cô quay chân không: + Xuất sứ Thụy sĩ.
+ Có thể tự động chưng với bộ điều khiển chân không V – 850. + Điện thế: 230V.
+ Công suất: 120W. + Tần số: 50/ 60Hz. + Vận tốc: 20 – 280rpm.
2.3. Nội dung nghiên cứu
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Sả.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chiết đến hoạt tính kháng