Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp (CS1b) và ứng dụng trong bảo quản nông sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM SINH AFLATOXIN CỦA BACILLUS (CS1b) VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN NÔNG SẢN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực MSSV: 1211100227 : Trịnh Thị Cẩm Tú Lớp: 12DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2016 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi Các số liệu , kết nêu đồ án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực đồ án cảm ơn thơng tin trích dẫn Đồ án rõ nguồn gốc Học viên thực đồ án Trịnh Thị Cẩm Tú i Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi để em học tập hồn thành tốt khóa học 2012 – 2016 Em xin cảm ơn thầy Khoa CƠNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MƠI TRƯỜNG tận tình dạy truyền đạt cho em kiến thức quan trọng tạo tảng kiến thức vững để hoàn thành tốt Đồ án sau ứng dụng vào công việc thực tiễn Em xin cảm ơn thầy phụ trách phòng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, Khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MƠI TRƯỜNG, Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện tốt giúp cho em thực hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hồi Hương tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình thực để em hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp Và em gửi lời cảm ơn đến bạn khóa tận tình hỗ trợ, giúp đỡ, động viên khích lệ tinh thần , trải qua khó khăn suốt trình thực Đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, gia đình ln bên cạnh, cỗ vũ động viên tinh thần, tạo điều kiện để hồn thành tốt Đồ án tốt nghiệp TP HCM, Ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thục Trịnh Thị Cẩm Tú ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG .vii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH ẢNH viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các nấm gây hại hạt 1.1.1 Tình trạng nhiễm nấm gây hại hạt ngũ cốc 1.1.2 Tình trạng nhiễm nấm trước thu hoạch 1.1.3 Tình trạng nhiễm nấm sau thu hoạch 1.1.4 Độc tố nấm 1.2 Các phương pháp kháng nấm gây bệnh cho nông sản 11 1.2.1 Kháng nấm phương pháp hóa học 11 1.2.2 Kháng nấm phương pháp sinh học: 12 1.3 Một số vi sinh vật điển hình có khả đối kháng nấm gây bệnh nông sản 15 1.3.1 Nấm Trichoderma spp 15 1.3.2 Lactobacillus spp 17 1.3.3 Bacillus subtilis spp 19 1.4 Cơ chế kháng nấm vi khuẩn 21 1.4.1 Cấu tạo thành tế bào số nấm gây hại nông sản 21 1.4.2 Cơ chế tác động số enzyme ngoại bào 23 1.4.3 Cơ chế kháng nấm số hợp chất 25 1.4.4 Một số phương pháp thu enzyme hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy vi khuẩn 26 Đồ án tốt nghiệp 1.5 Một số nghiên cứu ứng dụng màng bao bảo quản hạt 30 1.6 Một số nghiên cứu nước ứng dụng hợp chất thứ cấp Bacillus spp 31 1.7 Một số nghiên cứu nước ứng dụng hợp chất thứ cấp Bacillus spp 32 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 33 2.2 Vật liệu – thiết bị - hóa chất 33 2.2.1 Vật liệu 33 2.2.2 Thiết bị dụng cụ 33 2.2.3 Môi trường - Hóa chất 34 2.3 Phương pháp nghiên cứu 35 2.3.1 Mục đích 35 2.3.2 Mục tiêu 35 2.3.3 Nội dung 35 2.4 Bố trí thí nghiêm phương pháp 36 2.4.1 Khảo sát khả đối kháng nấm 36 2.4.2 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất VK có hoạt tính kháng nấm bảo quản hạt 47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 Sản xuất sinh khối nấm Aspergillus sp CĐP1 làm cảm ứng hợp chất kháng nấm cho vi khuẩn Bacillus sp CS1b 50 3.2 Xác định thời gian nuôi cấy để khả đối kháng nấm CĐP1 cực đại 51 3.2.1 Dịch nuôi cấy sau ly tâm 51 3.2.2 Dịch nuôi cấy sau ly tâm xử lý nhiệt 53 3.2.3 So sánh khả đối kháng dịch nuôi cấy sau ly tâm với nấm CĐP1 dịch nuôi cấy CS1b thời gian nuôi cấy điều kiện xử lý nhiệt 53 3.3 Khảo sát khả đối kháng nấm protein kết tủa từ dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b sau ly tâm 55 3.3.1 Quy trình thu hồi protein kết tủa có hoạt tính sinh học 55 Đồ án tốt nghiệp 3.3.2 Định tính enzyme protease, chitinase, ��- glucanase protein kết tủa 56 3.3.3Khảo sát khả đối protein kết tủa với CĐb1 59 3.4 Khảo sát khả đối kháng cao ethyl acetate với CĐb1 60 3.4.1 Quá trình thu cao EA 60 Đồ án tốt nghiệp 3.4.2 Khảo sát ức chế cao EA với nấm CĐP1 61 3.5 Khảo sát thành phần hóa học sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn Bacillus sp CS1b có hoat tính kháng nấm 64 3.6 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất VK có hoạt tính kháng nấm bảo quản hạt 66 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76 4.1 Kết luận 76 4.2 Kiến nghị 76 TÀI LIỆU KHAM KHẢO VÀ PHỤ LỤC 78 TÀI LIỆU KHAM KHẢO 78 PHỤ LỤC Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC VIẾT TẮT AFPA: Aspergillus flavus and parasiticus agar EA: ethyl acetate NA: Nutrient agar NB: Nutrient broth MT: Môi trường PDA: Potato dextrose agar HPLC: High pressure liquid chromatography TLC: Thin layer chromatography UV: Ultraviolet VK: vi khuẩn Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Ảnh hưởng aflatoxin có mặt thức ăn đến biểu bệnh lý vật nuôi Bảng 1.2: Các phương pháp khử nhiễm aflatoxin đường sinh học 13 Bảng 1.3: Các thành phần thành tế bào số nấm 22 Bảng 1.4: Cơ chế tác động mộ số hợp chất thứ cấp 26 Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm tạo màng bao hạt đậu phộng 47 Bảng 3.1: Tỷ lệ đối kháng (%) dịch nuôi cấy VK CS1b với nấm CĐP1 53 Bảng 3.2: Đường kính phân giải enzyme protein kết tủa ethanol .56 Bảng 3.3: Khả đối kháng với CĐP1 protein kết tủa ethanol 58 Bảng 3.4: Tỷ lệ đối kháng (%) theo nồng độ cao ethyl acetate với nấm CĐP1……………………………………………………………………………….63 Bảng 3.5: Định tính số chất có dịch sau ly tâm, protein kết tủa cao ethyl acetate 63 Bảng 3.6: Khả ức chế nấm mốc vi khuẩn phát triển hạt đậu phộng bao màng chitosan sản phẩm trao đổi chất CS1b 66 Bảng 3.7:Kết ứng dụng hợp chất thứ cấp bảo quản đậu phộng……………… 71 vii Đồ án tốt nghiệp trình, chuẩn bị sinh khối nấm CĐP1 trích ly dịch ni cấy sau ly tâm VK CS1b Hình 3.12: Sơ đồ chuẩn bị sinh khối nấm CĐP1 74 Đồ án tốt nghiệp Sinh khối CĐP1 1% Môi trường NB1(hấp khử trùng 121 C, 15phút) Làm nguội (30 C) Cấy giống CS1b (1%) Ni cấy (150 vòng/phút 24 giờ, 30 0C) Ly tâm (4000v/p, 20 phút) Dịch sau ly tâm Trích ly với ethyl acetate Tỉ lệ 1:1 lập lại lần Na2SO4 Pha hữu nước Lọc Pha hữu DMSO % Bay 500C thu cắn Xác định khối lượng (mg) Cao EA DMSO 5% (mg/ml) 75 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Sau khảo sát khả đối kháng với nấm CĐP1 dịch sau ly tâm từ canh trường nuôi cấy VK CS1b thời gian điều kiện xử lý nhiệt thời gian 24 nuôi cấy không xử lý nhiệt cho kết đối kháng tốt 60,1 % Trong protein kết tủa từa dịch nuôi cấy sau ly tâm 24 có hoạt tính enzyme protease, chitinase khơng beta – glucanase Nhưng khả đối kháng với nấm CĐP1 chưa xác định hoạt tính enzyme có protein kết tủa hay không Khả đối kháng cao EA với nấm CĐP1 phương pháp đục lỗ thạch cho tỷ lệ gần với đối chứng DMSO %, phương pháp sử dụng cao EA đun 70 C bổ sung 10 % vào môi trường PDA cho kết cao EA thu dịch ni cấy sau 24 có khả làm màu bào tử CĐP1 rõ rệt Trong cao ethyl acetate lipid, nhiên lipid không bổ sung vào mơi trường nên sản phẩm vi khuẩn Kết khảo sát ảnh hưởng sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn lên phát triển nấm hạt đậu phộng tạo màng bao với chitosan 0,2 % cho thấy sử dụng cao ethyl acetate để ngăn nảy mầm nấm CĐP1 cấy vào đậu phộng với mật độ 102 bào tử/g ngăn nhiễm nấm mốc vi khuẩn từ ngồi mơi trường đến sau 12 ngày bảo quản 4.2 Kiến nghị Qua khảo sát thấy cao EA thực có tiềm ức chế nấm mốc in vitro in vivo Nhưng hợp chất có cao EA có khả ức chế nấm mốc chưa xác định Vì chúng tơi kiến nghị: Tiến hành phương pháp định tính HPLC/MS để xác định rõ chất có cao EA Khảo sát dung mơi trích ly khác để thu hợp chất kháng nấm tốt Ứng dụng quy trình cơng nghệ vào sản xuất cao EA vào sử dụng cao EA để bảo quản nông sản TÀI LIỆU KHAM KHẢO VÀ PHỤ LỤC TÀI LIỆU KHAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Dương Thanh Liêm, Bùi Huy Như Phúc, Dương Duy Đồng, (2002) Thức ăn dinh dưỡng động vật NXB nông nghiệp [2] Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp (2003) Nấm mốc độc tố aflatoxin thức ăn chăn nuôi NXB nông nghiệp [3] Đỗ Tuyết Mai Nguyễn Văn Hương (2015) “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp ứng dụng bảo quản nông sản” Luận văn tốt nghiệp Đại học Công Nghệ TP.HCM [4] Huỳnh Văn Phục (2006) Khảo sát tính đối kháng Trichoderma spp Rhizoctonia solani Kühn lúa bắp Bước đầu khảo sát Fusarium oxysporum gây bệnh thối thân bắp [5] Lê Thanh Huân (2011) Phân lập, tuyển chọn đánh giá tiềm sử dụng proboitic chủng Lactobacillus phân lập cá chim vây vàng [6] Phạm Hoàng Thái (2007) Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, khảo sát khả ức chế sản sinh aflatoxin chủng phân lập Luận án tốt nghiệp Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh [7] Bùi Thị Hồng Gấm (2009) Thu nhận tinh chế enzyme Luận án tốt nghiệp Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh [8] Nguyễn Thanh Nhật (2015) Ứng dụng chitosan sản xuất từ chitin thu hồi phương pháp lên men lactic Luận văn tốt nghiệp trường Đại học Công Nghệ TP.HCM Tài liệu tiếng anh [1] Christensen, R.B.A Hartlay, R D, and Okelley, J Toxicity va fluorescence properties of the aflatoxin, Nature (lond), 200:1101 [2] Mahmoud A Ghannoum, and Louis B Rice(1999) Antifungal Agents: Mode of Action, Mechanisms of Resistance, and Correlation of These Mechanisms with Bacterial Resistance [3] Anthony J De Lucca and Thomas J Walsh (1999) Antifungal peptides: N ovel therapeutic compounds against Emerging Pathogens [4] Muhammad Abdul Mojid Mondol, Hee Jae Shin, and Mohammad Tofazzal Islam (2013) Diversity of Secondary Metabolites from Marine Bacillus Species: Chemistry and Biological Activity [5] Ting Zhang, Zhi-Qi Shi, Liang-Bin Hu, Luo-Gen Cheng, Fei Wang (2007) Antifungal compounds from Bacillus subtilis B-FS06m inhibitingthe growth of Aspergillus flavus World J MicrobiolBiotechnol (2008) 24:783–788, DOI 10.1007/s11274-007-9533-1 [6] Md Rezuanul Islam Antifungal ctv (2012) Isolation and Identification of Compounds from Bacillus subtilis C9 Inhibiting the Growth of Plant Pathogenic Fungi [7] Mohsen Farzaneh ctv (2016) Inhibition of the Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin B1 Contamination on Pistachio Nut by Fengycin and Surfactin-Producing Bacillus subtilis UTBSP PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MƠI TRƯỜNG VÀ TÍNH CHẤT VẬT LIỆU SỬ DỤNG TRONG CÁC THÍ NGHIỆM A1 Thành phần mơi trường Potato Dextrose Agar (PDA) Môi trường PDA D – glucose 20g Agar 20g Dịch chiết khoai tây 1000ml A2 Thành phần môi trường Potato Dextrose Broth (PDB) Môi trường PDB D – glucose 20g Dịch chiết khoai tây 1000ml Lưu ý: - Dịch chiết khoai tây: 200g khoai tây thái lát, cho thêm vào 1000 ml đun sôi 30 phút, thu dịch chiết định mức lên 1000 ml Bảo quản tủ mát chưa sử dụng - Khi nuôi cấy nấm mốc, bổ sung Chloramphenicol vào thành phần môi trường với tỉ lệ 0.02% A3 Thành phần môi trường Nutrient Broth (NB) Môi trường NB Peptone 5g Meat extract 3g NaCl 5g Nước cất 1000ml A Thành phần môi trường Nutrient Broth_1 (NB1) Môi trường NB1 Peptone 2.5g Meat extract 1.5g NaCl 2.5g Nước cất 1000ml A Thành phần môi trường Casein 1% Môi trường Casein Agar 15g Casein 10g Đệm phosphate (pH=7) 1000ml A Thành phần môi trƣờng Chitin 1% Môi trường Chitin Agar 15g Chitin 10g Đệm phosphate (pH=7) 1000ml Lưu ý: - Huyền phù hóa chitin: lấy 10 g chitin hòa vào 100ml HCl đậm đặc Khuấy 10 phút Sau cho từ từ nước cất làm lạnh đến 500ml, chitin huyền phù có màu trắng sữa Để qua đêm ngăn mát tủ lạnh Huyền phù rửa cách ly tâm (4000 vòng/10 phút) nhiều lần với dung dich có pH = đến huyền phù đạt pH = Bảo quản huyền phù tủ mát A Thành phần môi trường β - glucan 1% Môi trường β – glucan Agar 25g β - glucan 10g Đệm phosphate (pH=7) 1000ml A Tình chất chitosan cơng ty Hùng Tiến Cần Thơ Độ hòa tan 1% acetic acid : (87,6 0,72) % Khối lượng phân tử : (576350 3835,34) Da Độ deacetyl hóa: (97,4 0,24) % PHỤ LỤC B: PHỤ LỤC HÌNH ẢNH Hình B.1: Kết thử nghiệm khả bảo quản nước cất, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Hình B.2: Kết thử nghiệm khả bảo quản chitoosan, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Hình B.3: Kết thử nghiệm khả bảo quản DMSO %, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Hình B.4: Kết thử nghiệm khả bảo quản Nystatin, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Hình B.5: Kết thử nghiệm khả bảo quản sinh khối CS1b NB1, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Hình B.6: Kết thử nghiệm khả bảo quản sinh khối CS1b NB, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Hình B.7: Kết thử nghiệm khả bảo quản dịch sau ly tâm, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Hình B.8: Kết thử nghiệm khả bảo quản dịch sau ly tâm xử lý 100 0C, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Hình B.9: Kết thử nghiệm khả bảo quản canh trường CS1b NB, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Hình B.10: Kết thử nghiệm khả bảo quản canh trường CS1b NB1, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày Hình B.11: Kết thử nghiệm khả bảo quản cao EA, A: ngày, B: ngày, C: ngày, D: ngày, E: 12 ngày ... việc bảo quản hạt nông sản, sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật thường áp dụng Đó lý chúng tơi chọn nghiên cứu về: “ Khảo sát khả kháng nấm sinh aflatoxin Bacillus spp (CS1b) ứng dụng bảo quản nông. .. 2.4.1 Khảo sát khả đối kháng nấm 36 2.4.2 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất VK có hoạt tính kháng nấm bảo quản hạt 47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 Sản xuất sinh. .. khuẩn CS1b đạt khả kháng nấm Aspergillus sp CĐP1 cực đại Khảo sát khả đối kháng nấm protein kết tủa từ dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b sau ly tâm Đồ án tốt nghiệp Khảo sát khả đối kháng nấm cao chiết