KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM FUSARIUM SP. CỦA MỘT CHỦNG XẠ KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM FUSARIUM SP. CỦA MỘT CHỦNG XẠ KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜKHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM FUSARIUM SP. CỦA MỘT CHỦNG XẠ KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜKHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM FUSARIUM SP. CỦA MỘT CHỦNG XẠ KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM FUSARIUM SP

CỦA MỘT CHỦNG XẠ KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ

Hoàng Thị Hồng

(Sinh viên năm 4, Khoa Sinh học)

GVHD: ThS Nguyễn Ngọc Phương

1 Mở đầu

Theo thống kê của tổ chức Nông – Lương Thế giới cho thấy các loại cây trồng trên đồng ruộng hiện nay phải chống đỡ với 100.000 loài sâu hại, 10.000 loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh khác nhau Đây quả là một lực lượng hùng hậu tấn công cây trồng, gây tổn thất đáng kể cho mùa màng Hàng năm, có khoảng 20% sản lượng lương thực thực phẩm trên thế giới bị mất trắng [6] Trước thực trạng đó, con người không ngừng tìm kiếm, nghiên cứu các biện pháp phòng, chống các tác nhân gây hại Vì vậy, ngành công nghiệp hóa học ra đời và không ngừng pháp triển Chúng ta không thể phủ nhận vai trò to lớn của thuốc trừ sâu hóa học đối với ngành nông nghiệp tuy nhiên những biện pháp hóa học cũng nảy sinh những hạn chế của nó như: hiện tượng kháng thuốc ở các tác nhân gây hại, gây ô nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái, gây nguy hại đến sức khỏe con người,…

Để khắc phục những hạn chế của biện pháp hóa học, các nhà khoa học đã bắt tay nghiên cứu và tìm ra các chế phẩm thuốc trừ sâu bệnh có nguồn gốc sinh học Chế phẩm thuốc trừ sâu bệnh có nguồn gốc sinh học có nhiều ưu việt hơn so với thuốc hóa học, cụ thể là: không gây hại cho con người, động vật, cây trồng, cho đến nay chưa phát hiện được hiện tượng lờn thuốc, nhanh chóng phân hủy, không gây ô nhiễm môi trường [9]

Xạ khuẩn là đối tượng được quan tâm vì khả năng đối kháng của chúng với vi sinh vật (VSV) kiểm định, đặc biệt là xạ khuẩn được phân lập ở rừng ngập mặn (RNM)

do hi vọng với điều kiện môi trường sống khắc nghiệt có thể cho những hợp chất sinh trưởng thứ cấp quý Để đáp ứng nhu cầu và góp phần phát triển nền Nông nghiệp Việt

Nam chúng tôi quyết định chọn đề tài “Khảo sát khả năng kháng nấm Fusarium sp

của chủng xạ khuẩn phân lập được từ rừng ngập mặn Cần Giờ” Mục đích của đề

tài là tìm ra chủng xạ khuẩn có khả năng kháng nấm Fusarium sp mạnh và khảo sát

các ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng kháng nấm của chủng xạ khuẩn tuyển chọn Đề tài được thực hiện từ tháng 10 năm 2012 đến tháng 4 năm 2013 tại phòng thí nghiệm Sinh hóa – Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh (TPHCM)

2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1 Vật liệu

Xạ khuẩn phân lập từ đất RNM huyện Cần Giờ - TPHCM

Nấm Fusarium sp nhận từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghệ Sinh học

Trường Đại học Nông Lâm TPHCM

Các loại môi trường (MT)

– MT Gause I: 1 lít nước cất; 20 g tinh bột; 20 g agar; 0,5 g MgSO4.7H2O; 1 g KNO3; 0,5 g NaCl; 0,1 g FeSO4; 0,5 g K2HPO4 [2]

– MT Gause II: 1 lít nước cất; 3 g cao thịt; 5 g peptone; 10 g glucose; 20 g agar [3]

– MT PDA: 300 g khoai tây (cắt hạt lựu); 1 lít nước cất Đậy nắp đun sôi, lọc, bổ sung nước cất cho đủ 1 lít, sau đó thêm 50 g glucose và 20 g agar tiếp tục đun sôi [8] – MT Emerson: 1 lít nước cất; 4 g peptone; 4 g cao thịt; 1 g cao nấm men; 20 g glucose; 20 g agar

– MT ISP4: 1 lít nước cất; 10 g tinh bột tan; 1 g K2HPO4; 1 g MgSO4; 1 g NaCl;

2 g CaCO3; 2 g (NH4)2SO4; 20 g agar [5]

2.2 Phương pháp

– Phương pháp phân lập mẫu (Uyenco, 1988),

– Phương pháp bảo quản và sử dụng giống [4],

– Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn [3],

– Phương pháp xác định khả năng kháng nấm [7],[10],

– Khảo sát các điều kiện lên men ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng nấm [5],

– Phương pháp xác định khối lượng khô [6]

3 Kết quả và bàn luận

3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng có hoạt tính kháng nấm Fusarium sp

Từ mẫu đất lấy tại RNM Cần Giờ, chúng tôi đã phân lập được 55 kiểu khuẩn lạc (tạm gọi là chủng) xạ khuẩn khác nhau đuợc kí hiệu từ F1 đến F55 Chúng tôi tiến hành phân xạ khuẩn thành 3 nhóm dựa trên các tiêu chí: màu sắc khuẩn lạc, màu sắc mép khuẩn lạc, hình dạng mép khuẩn lạc, sắc tố tan 55 chủng xạ khuẩn phân lập được có 11

chủng có khả năng kháng nấm Fusarium sp ,trong đó: 4 chủng có hoạt tính kháng nấm

Fusarium sp mạnh, chiếm 36,36%; số chủng có hoạt tính trung bình và yếu chiếm

63,64% Kết quả khả năng kháng nấm Fusarium sp của 11 chủng xạ khuẩn được thể

hiện ở bảng 1

Bảng 1 Hoạt tính kháng nấm Fusarium sp của các chủng xạ khuẩn phân lập

từ RNM Cần Giờ

3 F33 1,9

Chúng tôi quyết định chọn chủng xạ khuẩn F46 là chủng có hoạt tính kháng nấm mạnh nhất để tiến hành các thí nghiệm về sau

3.2 Đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn F46

– Quan sát đại thể:

Trên môi trường Gause I sau 7 ngày cấy chấm điểm xạ khuẩn tạo thành những khuẩn lạc tròn có đường kính khoảng 9 mm Mặt trên khuẩn lạc tạo thành những lỗ tổ ong nhỏ màu nâu, khuẩn ty khí sinh phát triển theo hình phóng xạ và tạo thành các vòng tròn đồng tâm bao bên ngoài Mép khuẩn lạc màu trắng, răng cưa Mặt trái khuẩn lạc phẳng, khuẩn ty cơ chất có màu trắng, chính giữa có màu vàng nhạt

Hình 1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn F46

– Quan sát vi thể:

Sau 3 ngày nuôi cấy trong đĩa petri bằng phương pháp xẻ rãnh thạch Dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X1000, khuẩn ty khí sinh có vách ngăn, cuống sinh bào tử dạng xoắn lò xo Sau 4 – 5 ngày, trên cuống sinh bào tử hình thành các bào tử hình trụ theo phương pháp phân đoạn Các bào tử này được hình thành trên suốt chiều dài của cuống sinh bào tử tạo thành chuỗi bào tử

Hình 2 Hình thái hệ sợi khuẩn ty (a) và cuống sinh bảo tử (b)

của chủng xạ khuẩn F46 (độ phóng đại x1000)

3.3 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng kháng nấm Fusarrium

sp của chủng xạ khuẩn F46

3.3.1 Lựa chọn môi trường lên men thích hợp

Môi trường đóng vai trò hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng và phát triển của VSV Một môi trường tốt thường phải là môi trường vừa thuận lợi cho sinh trưởng tốt vừa cho hiệu suất kháng sinh cao Chúng tôi tiến hành lên men chủng xạ khuẩn F46 trên 4 môi trường: Gause I, Gause II, Emerson và ISP4 Quá trình lên men được tiến hành trong bình tam giác 250 ml chứa 50 ml dịch môi trường bổ sung 2% lượng giống, lắc 160 vòng/phút ở 28 - 30oC Sau 72 giờ lên men xác định khả năng kháng nấm

Fusarium sp của chủng xạ khuẩn Kết quả thu được thể hiện ở bảng 2 và hình 3

Bảng 2 Hoạt tính kháng nấm Fusarium sp của chủng xạ khuẩn F46

trên các môi trường lên men khác nhau

STT Môi trường Hoạt tính kháng nấm

Fusarium sp (D – d, cm)

1 Gause I 2,0± 0,15

2 Gause II 2,1± 0,23

3 Emerson 2,6± 0,07

4 ISP4 1,8± 0,19

Số liệu ở bảng 3 và đồ thị cho thấy chủng xạ khuẩn F46 sinh trưởng và thể hiện

khả năng kháng nấm Fusarium sp trên cả 4 môi trường Tuy nhiên, thể hiện khả năng kháng nấm Fusarium sp tốt nhất trên môi trường Emerson là môi trường giàu đạm hữu

cơ điều này cho thấy chúng có khả năng phân bố rộng trong tự nhiên Môi trường Emerson có nguồn đạm đa dạng điều này chứng tỏ khả năng sinh enzyme protease đã giúp chủng xạ khuẩn F46 tận dụng được nhiều nguồn dinh dưỡng khác nhau và chủng

xạ khuẩn này cũng tham gia tích cực vào quá trình chuyển hóa vật chất của RNM Bên cạnh đó với thành phần của môi trường Emerson tương đối đơn giản so với các môi trường còn lại là một ưu thế khi tiến hành các thí nghiệm về sau

Hình 4 Hoạt tính kháng nấm Fusarium sp của chủng xạ khuẩn F46

trên môi trường lên men khác nhau

3.3.2 Xác định động thái quá trình lên men

Để có được một cái nhìn khái quát về các giai đoạn sinh trưởng, phát triển và khả

năng kháng nấm Fusarium sp của chủng xạ khuẩn F46 chúng tôi tiến hành nghiên cứu

động thái quá trình lên men của chủng này Chúng tôi tiến hành nuôi chủng xạ khuẩn F46 trong 50ml môi trường Emerson bổ sung 2% lượng giống, lắc 160 vòng/phút Sau 24h, 48h, 72h, 84h, 96h, 108h, 120h, 132h, 144h, 156h, 168h xác định các chỉ tiêu sau: + Khả năng sinh trưởng bằng phương pháp xác định trọng lượng khô tuyệt đối,

+ Khả năng kháng nấm Fusarium sp bằng phương pháp khoan lỗ thạch,

+ Sự thay đổi pH trong bình lên men

Động thái quá trình lên men của chủng xạ khuẩn F46 được thể hiện ở bảng 3 và hình 5

Bảng 3 Động thái quá trình lên men của chủng xạ khuẩn F46

STT Thời

gian

Hoạt tính kháng nấm

Fusarium sp (D-d, cm) Sinh khối (g/l) pH

4 84h 2,5 ± 0,16 2,33± 0,29 7,29± 0,12

Hình 5 Đồ thị động thái quá trình lên men của chủng xạ khuẩn F46

Chúng tôi nhận thấy tốc độ sinh trưởng của chủng xạ khuẩn F46 tăng dần sau 24 giờ nuôi cấy và sinh khối đạt cực sau 84 giờ, sau đó sinh khối giảm dần do các nguồn carbon, nitrogen trong môi trường cạn kiệt dần Chủng xạ khuẩn thể hiện khả năng

kháng nấm Fusarium sp sau 24 giờ và tang ở các mẫu thời gian sau đó Trong khoảng thời gian từ 72 giờ đến 120 giờ chủng xạ khuẩn thể hiện hoạt tính kháng nấm Fusarium

sp mạnh và mạnh nhất sau 84 giờ Sau 132 giờ hoạt tính kháng nấm giảm xuống mức trung bình và giảm nhanh sau 156 giờ Việc sinh khối và khả năng kháng nấm

Fusarium sp đạt giá trị cực đại ở cùng một thời gian thuận lợi cho quá trình thu sinh

khối để trộn vào đất khi khảo sát khả năng kháng nấm Fusarium sp của chủng xạ

khuẩn F46 trên cây trồng

a b

Hình 6 Hoạt tính kháng nấm Fusarium sp của chủng xạ khuẩn F46

sau 168 giờ (a) và sau 84 giờ (b)

4 Kết luận và kiến nghị

4.1 Kết luận

– Phân lập được 55 khuẩn lạc xạ khuẩn khác nhau và phân thành 3 nhóm

– Trong 55 khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập được có 11 khuẩn lạc có hoạt tính kháng

nấm Fusarium sp chiếm 20% Trong đó có 4 khuẩn lạc có hoạt tính kháng nấm mạnh,

6 khuẩn lạc có hoạt tính kháng nấm trung bình và 1 khuẩn lạc có hoạt tính kháng nấm yếu

– Mô tả được đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn F46

– Chủng xạ khuẩn F46 kháng nấm Fusarium sp tốt (D-d = 2,2cm > 2cm) trên môi

trường Emerson

– Chủng xạ khuẩn F46 sinh trưởng và thể hiện khả năng kháng nấm Fusarium sp

cực đại sau 84 giờ

4.2 Kiến nghị

Định danh đến loài chủng xạ khuẩn F46

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh kháng sinh

chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên, luận văn thạc sĩ, Trường Đại học

Thái Nguyên, tr 3-21

2 Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập

từ đất Quảng Nam – Đà Nẵng, luận án tiến sĩ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, tr

4-38

3 Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây

bệnh thực vật ở Việt Nam, luận án tiến sĩ, Trường Khoa học Tự nhiên, Đại học

Quốc Gia Hà Nội, tr 3-20

4 Phạm Nguyễn Đăng Khoa (2006), Sử dụng xạ khuẩn để làm chế phẩm phân giải

cellulose, khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc

gia Thành phố Hồ Chí Minh, tr 5-8

5 Nguyễn Ngọc Phương (2006), Xác định một số điều kiện hoạt động tối ưu cho các

chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải lignin và cellulose trong mạt dừa, luận văn

thạc sĩ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, tr 3-5

6 Trần Thị Thanh (2007), Công nghệ vi sinh, Nxb Giáo dục, tr 120-137

7 Nguyễn Thị Thu (2005), Nghiên cứu đặc tính sinh học và khả năng sinh kháng

sinh của các chủng Streptomyces phân lập từ rừng ngập mặn Việt Nam, khóa luận

tốt nghiệp, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, tr 1-10

8 Trần Linh Thước (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực

phẩm và mĩ phẩm, Nxb Giáo dục, tr 36-41

9 Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2009), Công nghệ Sinh học, tập 5, Công nghệ

Vi sinh và môi trường, Nxb Giáo dục, tr 105-107

10 Crawford DL, Lynch JM, Whipps JM, Ousley MA (1993), “Isolation and

characterization of actinomycete antagonists of a fungal root pathogen”, Applied

and Environmental Microbiology, 59 (3), pp.899-905