Bài viết nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện lên men lên khả năng sinh chất kháng sinh kháng nấm Fusarium Oxysporum, lựa chọn môi trường lên men và động thái lên men của hai chủng xạ khuẩn Stretomyces Cyanneogriceus HD54 và Stretomyces Hygroscopicus HD58.
29(1): 89-94 3-2007 Tạp chí Sinh học ảNH HƯởNG CủA CáC ĐIềU KIệN LÊN MEN LÊN KHả NĂNG SINH CHấT KHáNG SINH KHáNG NấM FUSARIUM OXYSPORUM CủA HAI CHủNG Xạ KHUẩN STREPTOMYCES CYANEOGRICEUS HD54 Và STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS HD58 Lê Thị Thanh Xuân Viện Công nghệ sinh học Tăng Thị Chính ViƯn C«ng nghƯ m«i tr−êng ë ViƯt Nam, mét n−íc nhiệt đới nóng ẩm, bệnh nấm gây gây thiệt hại nghiêm trọng cho mùa màng Việc sử dụng thuốc hóa học để trừ nấm thờng độc, thuốc tồn d đất, nớc nông sản ảnh hởng đến sức khỏe ngời, gây ô nhiễm môi trờng sống làm cân sinh thái Vì vậy, đấu tranh sinh học (Biocontrol) chống bệnh thực vật đ đợc Hội nghị t vấn khu vực châu - Thái Bình Dơng FAO năm 1992 khẳng định tảng Chơng trình quản lý thống bệnh dịch Một biện pháp đấu tranh sinh học sử dụng hay nhiều loại vi sinh vật để kiềm chế bƯnh ë thùc vËt sinh tõ ®Êt [4, 5, 6] Việt Nam, đ có nhiều công trình khoa học nghiên cứu ứng dụng biện pháp đấu tranh sinh häc b¶o vƯ thùc vËt [2] Trong báo này, trình bày kết nghiên cứu ảnh hởng số điều kiện lên men đến sinh trởng, phát triển khả sinh chất kháng sinh kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thèi cỉ rƠ ë thùc vËt cđa hai chđng x¹ khuẩn Streptomyces cyaneogriceus HD54 S hygroscopicus HD58 phân lập từ mẫu đất Việt Nam I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CøU Vi sinh vËt - Hai chđng x¹ khn S cyaneogriceus HD54 S hygroscopicus HD58 đợc phân lập từ mẫu đất tỉnh Hải Dơng [1] - Nấm Fusarium oxysporum Fo47, đợc nhận từ phòng Công nghệ lên men - Viện Công nghệ sinh học, loài nấm gây bệnh thối cổ rễ thực vật Môi tr−êng Grauze 1, A-4, A-4H, A-9, A-12, Czapek, Czapek-Dox Phơng pháp - Xác định hoạt tính kháng sinh [2] - Định lợng kháng sinh theo bảng xác định hoạt tÝnh sinh häc cđa c¸c chÊt kh¸ng sinh cđa Dmitrieva [3] - Xác định chất kháng sinh nội bào, ngoại bào [2]: lấy 10 ml dịch nuôi cấy để ly tâm 3000 vòng/phút 20 phút; phần sinh khối dới đợc chiết lần (mỗi lần ml) dung môi a-xê-ton 45oC 30 phút Sau đó, ly tâm để loại sinh khối trộn lần chiết thành 10 ml dung môi loại Dịch lọc đợc bổ sung loại dung môi không hoà tan nh bu-ta-nol, clo-rô-phoóc với tỷ lệ 4: lắc định kỳ; sau 24 dùng phễu chiết tách dung môi Kiểm tra hoạt tính kháng sinh dung môi chiết từ sinh khối, dung môi chiết từ dịch lọc dịch đ chiết dung môi II KếT QUả Và THảO LUậN ảnh hởng nhiệt độ lên sinh trởng, phát triển khả sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn HD54 HD58 89 Để nghiên cứu ảnh hởng nhiệt độ lên sinh trởng, phát triển khả sinh chất kháng sinh chủng HD54 HD58, sử dụng thang nhiệt độ nh sau: 20oC, 30oC, 37oC 45oC Hai chủng xạ khuẩn đợc nuôi môi trờng Gauze1 lỏng máy lắc tròn 220 vòng/phút, 300C kéo dài 120 Kết xác định sinh khối khô hoạt tính kháng sinh phơng pháp giếng thạch đợc trình bày bảng Bảng ảnh hởng nhiệt độ lên sinh trởng, phát triển khả sinh tổng hợp chất kháng sinh hai chủng xạ khuẩn HD54 HD58 25oC 30oC 37oC 45oC Sinh khối khô (mg/ml) HD54 HD58 14,54 15,23 18,4 19,0 11,20 12,45 0 §−êng kÝnh cđa vßng øc chÕ F oxysporum Fo.47 (D - d) mm HD54 HD58 15 20 22 25 13 0 KÕt qu¶ ë b¶ng cho thÊy chủng xạ khuẩn HD54 HD 58 sinh trởng phát triển tốt 30oC, 25oC 37oC chúng phát triển yếu khả sinh trởng 45oC Điều cho thấy chủng xạ khuẩn HD54 HD 58 thuéc nhãm vi sinh vËt −a Êm Ho¹t tÝnh kháng sinh chủng phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi cấy, nuôi 30oC, chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh ức chế nấm F oxysporum Fo.47 mạnh Nh vậy, nhiệt độ 30oC nhiệt độ thích hợp cho sinh trởng khả sinh chất kháng sinh ức chế nấm F oxysporum Fo.47 chủng xạ khuẩn Vì vậy, chọn nhiệt độ 30oC để nuôi cấy nghiên cứu ảnh hởng pH Thang pH đợc lựa chọn để nghiên cứu từ pH5 đến pH10 Các chủng xạ khuẩn đợc nuôi môi trờng Gauze1 lỏng máy lắc tròn 220 vòng/phút, nhiệt độ 30oC 120 Xác định thông số lên men khả sinh chất kháng sinh kháng nấm F oxysporum Fo.47 phơng pháp giếng thạch Kết đợc trình bày bảng hình Kết hình bảng cho thấy chủng xạ khuẩn HD54 HD58 sinh trởng mạnh pH = giá trị pH cao khả sinh trởng chúng yếu Tuy nhiên, chủng có khả phát triển đợc môi trờng kiềm (pH = 9) 90 25 khèi(mg/ml) kh« (mg/ml) SinhSinh khoi kho Nhiệt độ nuôi cấy 20 15 HD54 HD58 10 5 10 11 pH H×nh1 ¶nh h−ëng cđa pH tíi sù sinh tr−ëng cđa chủng HD 54 HD 58 Kết bảng cho thấy nuôi chủng xạ khuẩn môi trờng có pH khác khả sinh chất kháng sinh kháng nấm F oxysporium Fo.47 khác nhau; môi trờng pH = 7, chúng sinh chất kháng sinh ức chế nấm mạnh hoạt tính kháng nấm giảm dần pH tăng dần giảm dần Đối với chủng HD54, tăng pH ban đầu môi trờng đến hoạt tính kháng nấm không còn; chủng HD58, hoạt tính kháng nấm giảm, nhng mức cao Điều chứng tỏ chủng HD58 có khả chịu kiềm tốt chủng HD54 Từ kết nghiên cứu trên, pH ban đầu môi trờng nuôi cấy thích hợp cho sinh trởng, phát triển khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn pH = Vì vậy, chọn pH = cho nghiên cứu Bảng ảnh hởng pH lên sinh trởng khả sinh chất kháng sinh kháng F oxysporium Fo.47 chủng xạ khuẩn HD54 HD58 Sinh khèi kh« (mg/ml) HD54 HD58 7,55 6,78 16,55 15,15 19,05 19,7 15,9 12,45 11,15 10,25 6,45 4,57 pH pH Đờng kính vòng øc chÕ nÊm F oxysporium Fo.47 (D - d) mm HD54 HD58 10 13 28 32 32 35 17 30 27 0 Lựa chọn môi trờng lên men thích hợp chủng xạ khuẩn HD54 HD58 Theo kết nghiên cứu nhiều năm xạ khuẩn sinh chất kháng sinh Porter, ông đ lựa chọn môi trờng lên men để nghiên cứu khả sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn là: A-4, A-4H, A-9 A-12 [3] Từ môi trờng sở này, lựa chọn môi trờng thích hợp cho chủng xạ khuẩn HD54 HD58 Dựa vào kết nghiên cứu pH nhiệt độ chủng này, tiến hành lên men môi trờng sở để chọn môi trờng lên men thích hợp Chủng xạ khuẩn đợc hoạt hoá môi trờng thạch nghiêng nhân giống môi trờng Gause dịch thể Sau 48 nuôi máy lắc tròn, giống phát triển tốt đợc cấy truyền 5% sang môi trờng lên men bản: A-4, A-4H, A-9 A-12 Tiếp theo đó, bình lên men đợc nuôi máy lắc tròn 220 vòng/phút kéo dài 120 Kết xác định pH, lợng sinh khối hoạt tính kháng nÊm F oxysporum Fo.47 cđa chđng x¹ khn HD54 HD58 đợc trình bày bảng Bảng Khả sinh trởng hoạt tính kháng nấm chủng xạ khuẩn HD54 HD58 lên men môi trờng Môi trờng lên men A- A- 4H A- A-12 Sinh khèi kh« (mg/ml) HD54 HD58 12,23 17,592 10,83 13,304 7,35 8,43 15,56 20,32 Đờng kính vòng ức chế nấm F oxysporum Fo.47 (D - d) mm HD54 HD58 20 25 22 24 10 10 28 30 Kết trình bày bảng cho thấy chủng xạ khuẩn HD54 HD58 lên men môi trờng A-12 phát triển tốt sinh chất kháng sinh kháng nấm F oxysporum Fo.47 mạnh Vì vậy, lựa chọn môi trờng A-12 để tiếp tục nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh Động thái lên men chủng xạ khuẩn HD54 HD58 môi trờng A-12 Từ kết nghiên cứu trên, ® chän m«i tr−êng A-12, pH = ®Ĩ nu«i lắc 91 220 vòng/phút nhiệt độ 30oC để nghiên cứu động thái lên men sinh chất kháng sinh kháng nÊm F oxysporum Fo.47 cđa chđng HD54 vµ HD58 Kết đợc trình bày bảng Bảng Động thái lên men chủng xạ khuẩn HD54 HD58 môi trờng A-12 Chủng xạ khuẩn HD54 HD58 pH dịch nuôi cấy Hoạt tính kháng nấm Fo.47 Sinh khối khô (mg/ml) pH dịch nuôi cấy Hoạt tính kháng nấm Fo.47 Sinh khối khô (mg/ml) Thời gian lªn men (giê) 48 72 96 120 24 144 168 7,0 6,23 6,18 6,54 6,51 6,59 6,77 5,56 - - - 15,6 27,5 34 30,8 26 - 10,73 14,13 19,59 24,03 17,12 16,74 7,0 6,72 6,64 6,68 7,05 7,23 6,00 5,67 - - - 22,5 33 35,5 30,5 28 - 13,27 18,33 24,32 32,93 30,77 27,1 23,36 16,64 Hình Hoạt tính kháng nấm F oxysporum Fo.47 chủng HD58 trình lên men Nh đ biết, sinh trởng phát triển chủng xạ khuẩn trình lên men mang đặc tính chủng có liên quan chặt chẽ đến khả sinh tổng hợp kháng sinh chúng KÕt qu¶ ë b¶ng cho thÊy sinh khèi cđa chủng xạ khuẩn HD54 HD58 bắt đầu tăng nhanh từ thứ 24 trình lên men đạt cực đại thứ 96, sau giảm dần Điều liên quan chặt chẽ đến hình thành axit hữu môi trờng sù sinh tr−ëng cđa x¹ khn Sù sinh tr−ëng cđa xạ khuẩn đạt cực đại thứ 96 giảm dần trình lên men tiếp theo, sau 96 lên men, khuẩn ty xạ khuẩn bị phân đoạn tự phân, dẫn đến lợng sinh khối giảm Hai chủng xạ khuẩn HD54 HD58 bắt đầu 92 sinh tổng hợp chất kháng sinh kháng nấm F oxysporum Fo.47 sau 48 lên men tăng nhanh từ 72 đến 96 giờ, đạt cực đại thứ 120, sau giảm dần tiếp tục nuôi cấy Nh vậy, pha sinh chất kháng sinh xảy chậm so với pha sinh trởng chủng xạ khuẩn Trong trình lên men, pH dịch nuôi cấy giảm dần 48 đầu bắt đầu tăng dần từ 48 đến 120 giờ, sau lại giảm dần kết thúc trình lên men Tính chất kháng sinh chủng xạ khuẩn HD54 HD58 Hai chủng xạ khuẩn HD54 HD58 đợc nuôi lắc 220 vòng/phút 120 giờ, sau đem ly tâm để thu sinh khối dịch ly tâm Chúng dùng bu-ta-nol để chiết rút chất kháng sinh từ dịch ly tâm dùng a-xê-ton để chiết rút chất kháng sinh từ sinh khối xạ khuẩn Kết xác định hoạt tính kháng nấm F oxysporum Fo.47 chất kháng sinh đợc chiết rút từ dịch nuôi cấy từ sinh khối chủng xạ khuẩn đợc trình bày bảng Bảng Hoạt tính chất kháng sinh kháng nấm F oxysporum Fo.47 đợc tách chiết từ sinh khối từ dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn HD54 HD58 Chủng xạ khuẩn HD 54 HD 58 Đờng kính vòng ức chế nấm F oxysporum Fo.47 (D - d) mm Sinh khèi DÞch nuôi cấy 33 35,5 Kết bảng cho thÊy chÊt kh¸ng sinh kh¸ng nÊm F oxysporum Fo.47 cđa chđng HD54 vµ HD58 chØ cã dịch tách chiết từ sinh khối xạ khuẩn, dịch nuôi cấy xạ khuẩn Nh vậy, chất kh¸ng sinh kh¸ng nÊm F oxysporum Fo.47 chØ n»m sinh khối chủng xạ khuẩn III KếT LUậN Hai chủng xạ khuẩn Streptomyces cyaneogriceus HD54 S hygroscopicus HD58 đợc phân lập từ mẫu đất ViÖt Nam, thuéc nhãm vi sinh vËt −a Êm sinh trởng sinh tổng hợp chất kháng sinh kháng nấm Fusarium oxysporum Fo.47 ë nhiƯt ®é tõ 25oC - 37oC Nhiệt độ tốt cho sinh trởng khả sinh tổng hợp chất kháng sinh chúng 30oC với pH ban đầu môi trờng Môi trờng lên men thích hợp cho sinh trởng khả sinh tổng hợp chất kháng sinh kháng nấm F oxysporum Fo.47 hai chủng xạ khuẩn S cyaneogriceus HD54 S hygroscopicus HD58 môi trờng A-12 Trong trình lên men, sinh khối hai chủng xạ khuẩn bắt đầu tăng nhanh từ thứ 24 đạt cực đại thứ 96, sau giảm dần Chúng bắt đầu sinh tổng hợp chÊt kh¸ng sinh kh¸ng nÊm F oxysporum Fo.47 sau 48 lên men đạt cực đại thứ 120 Nh vậy, pha sinh chất kháng sinh xảy chËm h¬n so víi pha sinh tr−ëng cđa chđng xạ khuẩn Trong trình lên men, pH dịch nuôi cấy giảm dần 48 đầu tăng dần từ 48 đến 120 lên men, sau lại giảm dần kết thúc trình lên men (144 giờ) Chất kháng sinh kháng nấm F oxysporum Fo.47 chủng xạ khuÈn S cyaneogriceus HD54 vµ S hygroscopicus HD58 chØ n»m sinh khối chủng xạ khuẩn Tài liệu tham khảo Tăng Thị Chính cs., 2005: Tạp chí Sinh học, 27(1): 39-43, Hà Nội Lê Gia Hy, 1994: Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam, Luận ¸n Phã tiÕn sü Porter N., 1975: Methods in Enzymology, XVIII: 3-23 Shen Y Ch., 1992: Development and application of agricultural antibiotic jinggangmycin in China FAO regional expert consultation on biologycal control of plan diseases, Hangzhou, China Yuan-bod, 1992: Development of biological control of plant diseases in Asiapacific region FAO regional axpert consultation of plant diseases, Hangzhou, China Zhang I X., 1992: FAO regional Expert consultation of plant diseases, Hangzhou, China 93 Influences of fermentation conditions on the biosynthesy capacite of antibiotics against Fusarium oxysporum of two Streptomyces strains Streptomyces cyaneogriceus HD54 and Streptomyces hygroscopicus HD58 Le Thi Thanh Xuan, Tang Thi Chinh Summary Two strains Streptomyces cyaneogriceus HD54 and S hygroscopicus HD58 were isolated from soil samples in Vietnam They produced antibiotic against the fungus F oxysporum Fo47 These strains were mesophilic microorganisms and their growth temperature were about 25oC-37oC The optimum temperature for their growth and their antibiotic biosynthesy was 30oC in the media with pH = The medium A-12 was suitable for their growth and their antibiotic biosynthesy, with incubation temperature at 30oC and shaker rate of 220 rpm/min The A-12 medium contained soluble starch, soybean powder, molasses, K2HPO4, CaCO3 and NaCl These two strains HD54 and HD58 obtained maximum biomass at among 96h cultivation time They started to biosynthesize antibiotic after 48h of incubation and obtained maximum antibiotic activity against fungus F oxysporum Fo47 after among 120h of incubation Their antibiotic activity was obtained only inner their mycelium and non-extracted in the liquid medium Ngµy nhËn bµi: 4-7-2006 94 ... động thái lên men sinh chất kháng sinh kháng nấm F oxysporum Fo.47 chủng HD54 HD58 Kết đợc trình bày bảng Bảng Động thái lên men chủng xạ khuẩn HD54 HD58 môi trờng A-12 Chủng xạ khuẩn HD54 HD58 pH... sinh chủng xạ khuẩn pH = Vì vậy, chọn pH = cho nghiên cứu Bảng ảnh hởng pH lên sinh trởng khả sinh chất kháng sinh kháng F oxysporium Fo.47 chủng xạ khuẩn HD54 HD58 Sinh khối kh« (mg/ml) HD54 HD58. .. xạ khuẩn HD54 HD58 đợc trình bày bảng Bảng Khả sinh trởng hoạt tính kháng nấm chủng xạ khuẩn HD54 HD58 lên men môi trờng Môi trờng lên men A- A- 4H A- A-12 Sinh khèi kh« (mg/ml) HD54 HD58 12,23