Ảnh hưởng của than hoạt tính lên khả năng định hướng rễ ở cây hồng môn và cây cúc nuôi cấy in vitro

Than hoạt tính (Activated charcoal-AC) thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của cây nuôi cấy in vitro. Tuy nhiên, những nghiên cứu về hiệu quả định hướng rễ của chúng trong nuôi cấy mô thực vật còn rất hạn chế. Để bước đầu khảo sát khả năng này của AC, chúng tôi tiến hành cấy các chồi vào môi trường được phân thành 2 phần, một phần không có AC và phần còn lại bổ sung các nồng độ AC tối ưu đã khảo sát ở hai đối tượng cây Cúc (3 g/l AC) và Hồng môn (2 g/l AC) bằng cách thay đổi vị trí lớp AC trong môi trường nuôi cấy (trên, giữa hoặc dưới). Kết quả cho thấy, hầu hết các rễ phát sinh trong lớp môi trường có AC (trên 80% rễ). Ngoài ra, các kết quả cũng cho thấy sự định hướng rễ của cây Hồng môn phụ thuộc vào vị trí lớp AC nhiều hơn ở cây Cúc. Vị trí lớp môi trường có AC ở dưới là tối ưu cho sự phát triển của cây và rễ in vitro của cả cây Cúc và cây Hồng môn. Mặt khác, những cây sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện in vitro cũng sinh trưởng và phát triển tốt ở điều kiện ex vitro; điều này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu nhân giống vô tính cây trồng.

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3): 377-388 ẢNH HƯỞNG CỦA THAN HOẠT TÍNH LÊN KHẢ NĂNG ĐỊNH HƯỚNG RỄ Ở CÂY HỒNG MÔN VÀ CÂY CÚC NUÔI CẤY IN VITRO Nguyễn Thị Nhật Linh, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Thị Kim Yến, Lê Kim Cương, Nguyễn Phúc Huy, Dương Tấn Nhựt* Viện Sinh học Tây Nguyên, (*)duongtannhut@gmail.com TÓM TẮT: Than hoạt tính (Activated charcoal-AC) thường bổ sung vào mơi trường nuôi cấy để tăng cường sinh trưởng phát triển nuôi cấy in vitro Tuy nhiên, nghiên cứu hiệu định hướng rễ chúng ni cấy mơ thực vật hạn chế Để bước đầu khảo sát khả AC, tiến hành cấy chồi vào môi trường phân thành phần, phần khơng có AC phần lại bổ sung nồng độ AC tối ưu khảo sát hai đối tượng Cúc (3 g/l AC) Hồng môn (2 g/l AC) cách thay đổi vị trí lớp AC mơi trường nuôi cấy (trên, dưới) Kết cho thấy, hầu hết rễ phát sinh lớp môi trường có AC (trên 80% rễ) Ngồi ra, kết cho thấy định hướng rễ Hồng mơn phụ thuộc vào vị trí lớp AC nhiều Cúc Vị trí lớp mơi trường có AC tối ưu cho phát triển rễ in vitro Cúc Hồng môn Mặt khác, sinh trưởng phát triển tốt điều kiện in vitro sinh trưởng phát triển tốt điều kiện ex vitro; điều có ý nghĩa lớn nghiên cứu nhân giống vơ tính trồng Từ khóa: Anthurium andraeanum, Chrysanthemum morifolium, định hướng rễ, nuôi cấy mô thực vật, than hoạt tính MỞ ĐẦU Trước đây, than hoạt tính (Activated charcoal-AC) thường sử dụng để phòng độc, lọc khơng khí chất lỏng Hiện nay, AC tinh chế sản xuất rộng rãi chất có tính hấp thụ cao sử dụng phổ biến ni cấy mơ nhờ có tác động lên phát sinh hình thái phát sinh quan thực vật [17] Vai trò AC nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu tạo điều kiện “tối” cho môi trường nuôi cấy, hấp thụ chất độc chất ức chế sinh trưởng thực vật phenolic, dịch rỉ nâu sinh từ mẫu môi trường nuôi cấy [1, 17] Ngồi ra, than hoạt tính hấp thụ vitamin, cytokinin auxin [7, 9], làm thay đổi tỉ lệ thành phần chất có mơi trường nuôi cấy pH môi trường [21] Từ AC ứng dụng nuôi cấy mô, nhà khoa học chủ yếu tập trung nghiên cứu công bố ảnh hưởng việc cải tiến môi trường nuôi cấy [2, 21], tăng cường khả tái sinh [13], phát sinh phôi [11, 15], tăng sinh tế bào trần [14], ngăn cản phát triển bất thường [22], kích thích q trình hình thành phát triển chồi [12], thúc đẩy hay ức chế tăng trưởng hình thành rễ [3, 5, 19]; ngồi ra, AC có khả làm giảm tượng thủy tinh thể số loài thực vật [4] Trong đó, nghiên cứu khả định hướng rễ in vitro tác động AC lại hạn chế chưa có cơng bố vấn đề Chính vậy, nghiên cứu thực nhằm xây dựng tiền đề cho việc tìm hiểu khả định hướng rễ in vitro tác động AC Hồng mơn Cúc Từ đó, xác định đáp ứng hai đối tượng có bổ sung nồng độ vị trí AC mơi trường nuôi cấy khả sinh trưởng phát triển chúng điều kiện ex vitro PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Các chồi Cúc (Chrysanthemum morifolium ‘Jimba’) in vitro 30 ngày tuổi gồm đốt với ba nhỏ, có chiều dài khoảng cm nuôi cấy môi trường MS [16] có bổ sung 30 g/l sucrose g/l agar Các chồi Hồng môn (Anthurium 377 Nguyen Thi Nhat Linh et al andraeanum ‘Tropical’) có kích thước khoảng cm, gồm nhỏ tách từ cụm chồi có nguồn gốc từ mơ sẹo sau tháng nuôi cấy môi trường MS bổ sung 0,3 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 30 g/l sucrose g/l agar Than hoạt tính (cơng ty TNHH Guangdong Guanghua Sci-Tech Co, Ltd (JHD), Trung Quốc) bổ sung vào môi trường nuôi cấy theo nồng độ vị trí khác tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm Phương pháp Khảo sát ảnh hưởng nồng độ AC lên sinh trưởng, phát triển chồi Hồng môn Cúc in vitro Các chồi Cúc Hồng môn in vitro cấy vào bình thủy tinh 250 ml chứa 30 ml mơi trường MS khơng có chất điều hòa sinh trưởng, bổ sung AC với nồng độ khác (0, 1, 2, 3, 4, g/l AC), 30 g/l sucrose 8,5 g/l agar pH môi trường điều chỉnh đến 5,8 trước hấp khử trùng 121ºC atm 35 phút Khảo sát ảnh hưởng vị trí lớp AC mơi trường ni cấy lên khả định hướng rễ Hồng môn Cúc in vitro Để bước đầu nghiên cứu khả định hướng rễ AC, môi trường phân thành hai phần, phần có bổ sung AC phần lại khơng chứa AC; sau tiến hành thay đổi vị trí phần mơi trường có bổ sung AC (hình 1, từ N0-N4) để xác định hướng rễ phát sinh tăng trưởng lớp môi trường khác khả sinh trưởng phát triển Hồng môn Cúc Để minh họa rõ khả định hướng rễ tác động AC, tiến hành cấy chồi vào hệ thống ống nghiệm có kích thước × 20 cm, có thiết kế mơi trường hình (N5, N6) Hình Sơ đồ thiết kế thí nghiệm định hướng rễ tác động AC MT mơi trường MS khơng có bổ sung AC; MA mơi trường MS có bổ sung nồng độ AC tối ưu cho Hồng môn Cúc, 30 g/l sucrose 8,5 g/l agar; N0 môi trường AC; N1 lớp mơi trường có bổ sung AC nằm trên; N2 lớp mơi trường có bổ sung AC nằm giữa; N3 lớp mơi trường có bổ sung AC nằm dưới; N4 tồn mơi trường bổ sung AC; N5 lớp AC nằm nghiêng ống nghiệm; N6 lớp AC nằm thẳng đứng ống nghiệm 378 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3): 377-388 Các thí nghiệm ex vitro tiến hành nhiệt độ khoảng 17-25ºC, độ ẩm trung bình 8590% sử dụng ánh sáng tự nhiên trường có bổ sung nồng độ AC tối ưu mơi trường khơng có AC Lớp biểu bì lấy từ mặt dọc theo trục gân chính, sau quan sát chụp ảnh kính hiển vi quang học vật kính ×40 ×100 Đối với ex vitro Các Cúc (sau 30 ngày) Hồng môn (sau 60 ngày) trồng vườn ươm đo chiều dài (cm), chiều rộng (cm), số lá/cây, chiều cao (cm) (tính từ mặt đất lên) tỉ lệ sống sót (%) Xử lý thống kê Các thí nghiệm lặp lại lần, thí nghiệm tiến hành 10 bình, bình cấy mẫu Dữ liệu xử lý phần mềm phân tích thống kê SPSS 16.0 theo phương pháp Duncan với p = 0,05 (SPSS Inc Headquarters, United States) [6] Chỉ tiêu theo dõi KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Đối với in vitro Tiến hành xác định khối lượng tươi (mg), khối lượng khô (mg), chiều cao (cm), số lá/cây, số lượng rễ/cây chiều dài rễ (cm), tỉ lệ hình thành rễ (%) sau 21 ngày nuôi cấy Cúc sau 60 ngày nuôi cấy Hồng môn Ảnh hưởng nồng độ AC lên sinh trưởng, phát triển chồi Hồng môn Cúc in vitro Khảo sát sinh trưởng, phát triển điều kiện vườn ươm Các in vitro thí nghiệm lấy khỏi bình ni cấy rửa agar nước máy Sau đó, Cúc trồng vào chậu chứa đất đỏ xơ dừa với tỉ lệ 3:1 Hồng môn trồng dớn Sau khoảng 15 ngày, chuyển sang chậu lớn với loại giá thể bổ sung thêm phân hữu Điều kiện thí nghiệm Tất thí nghiệm in vitro giữ điều kiện nhiệt độ 25 ± 2ºC, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ 45 µmol.m-2.s-1 ẩm độ trung bình 75-80% Giải phẫu quan sát hình thái Hình thái rễ nghiên cứu định hướng rễ: hình thái rễ quan sát cách cắt mỏng dọc theo rễ tiến hành nhuộm với thuốc nhuộm màu Iodine-carmine (Merk KgaA-Germany) sau: mẫu sau giải phẫu ngâm Javel 10% khoảng 15 phút, tồn mẫu chuyển sang màu trắng Tiếp đó, mẫu rửa nước cất vơ trùng ngâm khoảng 15 phút dung dịch acid acetic 45% để cố định mẫu Sau đó, lấy mẫu rửa nước cất mùi acid ngâm vào thuốc nhuộm phút Cuối cùng, rửa lại mẫu nước cất vô trùng, đặt mẫu lên lamen, đậy lam kính lên tiến hành quan sát, chụp ảnh kính hiển vi quang học vật kính ×40 Cấu trúc khí khổng điều kiện có khơng có AC: khí khổng quan sát từ thứ ba thứ tư (từ xuống) Cúc Hồng môn nuôi cấy môi Các kết thu cho thấy, so với mơi trường khơng có AC, sinh trưởng phát triển môi trường có AC cho tiêu khối lượng chồi, chiều cao chồi, khối lượng rễ, chiều dài rễ số rễ vượt trội môi trường không bổ sung AC (bảng 1, 2, hình 2a, 2b) Đặc biệt thí nghiệm này, AC tác động lớn lên khả hình thành rễ Hồng mơn Cúc Đối với chồi Hồng môn sau 60 ngày nuôi cấy điều kiện in vitro, đa số sinh trưởng phát triển tốt nồng độ AC từ 1-3 g/l, đó, hình thành rễ phát triển tốt nghiệm thức bổ sung 2-3 g/l AC (bảng 1) Ở nghiệm thức bổ sung g/l AC chồi rễ phát triển tốt với tất tiêu chiều cao chồi (3,1 cm), khối lượng tươi chồi (96,7 mg), chiều dài rễ (1,5 cm), khối lượng khô chồi (13,5 mg), khối lượng khô rễ (5,3 mg), số lượng rễ (3,5 rễ) số (4,3 lá) đạt cao (bảng 1) Kết thu cho thấy AC chủ yếu tác động làm gia tăng khối lượng khô chồi gấp 3,2 lần, khối lượng khô rễ gấp 11 lần, chiều dài số rễ gấp lần so với môi trường 379 Nguyen Thi Nhat Linh et al không bổ sung AC Điều tương tự kết nghiên cứu Hồng môn (Anthurium andreanum) với nồng độ g/l tối ưu cho phát triển chồi tạo rễ [10] Ngoài ra, kết thu nồng độ g/l AC làm giảm khả sinh trưởng Hồng môn với số rễ, khối lượng rễ thấp so với g/l AC (bảng 1) Như vậy, AC ảnh hưởng lớn đến khả phát sinh tăng trưởng rễ, đồng thời giúp tăng trưởng tốt Bảng Ảnh hưởng nồng độ AC lên sinh trưởng, phát triển chồi Hồng môn in 60 ngày nuôi cấy AC (g/l) Chỉ tiêu theo dõi d* c a a Khối lượng tươi (mg) 39,7 55,7 96,7 91,0 85,0a Khối lượng khô (mg) 4,2d 8,2c 13,5a 12,5a 10,2b Chồi c a a ab Số 2,3 4,6 4,3 4,0 4,0ab d bc a ab Chiều cao (cm) 2,13 2,70 3,10 3,07 2,60c d b a a Khối lượng tươi (mg) 33,3 51,0 65,3 61,5 35,0c d c a b Khối lượng khô (mg) 0,5 3,3 5,3 4,3 2,8c d c ab a Rễ Chiều dài (cm) 0,5 1,2 1,5 1,6 1,4bc d bc a b Số rễ 1,1 2,3 3,5 2,6 2,7b c b a a Tỉ lệ hình thành rễ (%) 33 95 100 100 99a vitro sau 71,7b 10,1b 3,3bc 2,53c 36,0c 2,6c 1,4bc 2,3bc 95b *Các chữ a, b, c thể khác biệt có ý nghĩa mức tin cậy p = 0,05 phép thử Duncan Đối với Cúc, kết thu sau 21 ngày nuôi cấy cho thấy AC không ảnh hưởng nhiều lên q trình phát sinh rễ, 100% chồi Cúc rễ hai phần môi trường AC tác động mạnh lên sinh trưởng phát triển Cúc Ở công thức bổ sung g/l AC cho kết hình thành rễ tăng trưởng Cúc tốt hầu hết tiêu khối lượng tươi chồi (553,3 mg), khối lượng tươi rễ (193,3 mg), khối lượng khô chồi (18,3 mg), khối lượng khô rễ (7,0 mg), chiều cao (5,6 cm), số (9), chiều dài rễ (6,2 cm) số rễ (17) (bảng 2) Ở công thức bổ sung AC nồng độ g/l g/l, khả phát triển chồi (hình 2b, bảng 2) Bảng Ảnh hưởng nồng độ AC lên sinh trưởng, phát triển chồi Cúc in vitro sau 21 ngày nuôi cấy AC (g/l) Chỉ tiêu theo dõi Khối lượng tươi (mg) 316,7c* 340,0c 430,0b 553,3a 476,7b 345,0c Khối lượng khô (mg) 10,7c 13,2 c 16,5b 18,3a 17,2ab 16,8b Chồi Số 8,1d 8,7bc 8,9ab 9,0a 8,5c 8,0d d c b a a Chiều cao (cm) 4,3 4,9 5,3 5,6 5,5 5,5a d c b a b Khối lượng tươi (mg) 68,3 95,0 140,0 193,3 153,0 98,0c c b b a b Khối lượng khô (mg) 3,0 5,7 6,1 7,0 5,4 4,1c c b b a a Rễ Chiều dài (cm) 3,2 5,4 5,5 6,2 6,5 6,6a b b b a c Số rễ 16,0 16,5 16,3 17,0 13,9 12,7c a a a a a Tỉ lệ hình thành rễ (%) 100 100 100 100 100 100a *Các chữ a,b,… thể khác biệt có ý nghĩa mức tin cậy p = 0,05 phép thử Duncan Qua kết nghiên cứu cho thấy, mức độ ảnh hưởng AC đến khả phát triển 380 Cúc Hồng môn không giống có tác dụng gần TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3): 377-388 chất kích thích phát sinh hình thành rễ Khi nồng độ AC bổ sung vào mơi trường tăng khối lượng khơ, số lượng rễ tăng lên đáng kể, sinh trưởng phát triển tốt Hồng môn Cúc (bảng 1, 2, hình 2a, 2b) Tương tự với nghiên cứu trước cho thấy bổ sung AC vào môi trường nuôi cấy giúp tăng cường phát sinh quan, khả phát triển chồi [12, 13] gia tăng đáng kể tỉ lệ hình thành khả phát triển rễ số loài thân thảo thân gỗ [3, 5, 19] Ngoài ra, nghiên cứu Pan & Staden (1998) [17] ghi nhận AC có lợi cho tăng trưởng in vitro tác dụng ngược lại Trong đó, tác dụng có lợi AC đặc tính sẵn có màu đen làm mơi trường “tối” nên tạo điều kiện nuôi cấy tương tự đất giúp rễ dễ dàng phát triển hấp thu chất dinh dưỡng môi trường ni cấy Bên cạnh đó, Sánchez et al (1996) [18] chứng minh việc làm tối môi trường nuôi cấy chồi Quercus robur Q rubra với bạc vào giai đoạn rễ giúp tăng tỉ lệ tạo rễ không hiệu việc sử dụng AC Bởi vì, AC gồm cấu trúc mạng lưới lỗ xơ rỗng với vùng chuyên biệt lớn từ 600-2000 m2gl-1 lỗ phân bố từ 10-500 M có tính hấp thụ lớn, hấp thụ độc tố kìm hãm phát triển phenolic oxidase chất hay dịch rĩ nâu môi trường hay mẫu sinh Ngoài ra, Debergh et al (1981) [4] cho thấy AC có khả hấp thu khí khơng cần thiết ethylene, oxygen, nước môi trường nuôi cấy nên làm giảm tượng thủy tinh thể phát sinh trình ni cấy in vitro, từ đó, chồi ni cấy mơi trường có AC sinh trưởng phát triển tốt Tuy nhiên, Pan & Staden (1998) [17] cho AC có tác động hấp thu khơng chọn lọc nên tạo tác động không tốt lên mẫu nuôi cấy chúng hấp thu chất dinh dưỡng vitamin thiết yếu cho mẫu cấy thiamine, nicotinic acid, pyridoxine, folic acid, chất điều hòa sinh trưởng, kiềm, sắt, kẽm điều tiếp tục có cân phân tử bị hấp thu không bị hấp thu Hơn nữa, khả hấp thu AC tùy thuộc vào nhiều nhân tố mật độ, độ tinh pH AC Ở nghiên cứu bổ sung AC nồng độ vượt g/l làm giảm khả phát triển chồi Hồng môn lẫn Cúc, chồi Cúc có tượng thân giòn, dày dễ rụng Ảnh hưởng vị trí phần mơi trường có bổ sung AC lên khả định hướng rễ Hồng môn Cúc in vitro Các kết thu cho thấy, phát sinh hình thành rễ Hồng môn phụ thuộc lớn vào vị trí phần mơi trường có AC Khi ni cấy môi trường không bổ sung AC, rễ Hồng mơn hình thành kém, nữa, rễ có khuynh hướng hướng lên trên, phát triển bề mặt mơi trường ni cấy khơng hướng xuống rễ thuộc dạng rễ khí sinh thường có đặc điểm mọc khơng khí hướng sáng để quang hợp (hình 2c) Nhưng ni cấy mơi trường có bổ sung AC, tất rễ Hồng mơn hình thành lại hướng theo lớp AC đâm sâu vào môi trường nuôi cấy nhờ hấp thu tốt nguồn dinh dưỡng có môi trường (95% rễ phát sinh hay tăng trưởng theo phần mơi trường có AC) (bảng 3, hình 2c) Đặc biệt nuôi cấy Hồng môn ống nghiệm có vị trí mơi trường AC nằm nghiêng thẳng 100% rễ hình thành phát triển phía có AC (hình 2j, 2k) Theo dõi phát triển rễ Hồng mơn suốt q trình ni cấy, kết cho thấy chóp rễ ln hướng vào lớp AC khơng có rễ kéo dài hay phát triển xuống phần môi trường AC (hình 2c) Ngồi ra, phần mơi trường có bổ sung AC nằm 100% rễ Hồng môn tăng trưởng bám sát lên phần môi trường với chiều dài rễ (2,1 cm), số lượng rễ (4,7 rễ) tối ưu (hình 2c, bảng 3) Ở Cúc, kết quan sát cho thấy, có 83% rễ Cúc phát triển lớp mơi trường có bổ sung AC trên, 75% rễ phát triển phần AC nằm giữa, 95% rễ phát triển phần AC nằm hầu hết rễ hình thành kéo dài qua lớp AC phát triển mơi trường khơng có AC (bảng 4, hình 2e) Tuy vậy, trước rễ phát triển xuống lớp mơi trường khơng có AC số rễ kéo dài phát triển phần môi trường có AC tạo nên lớp rễ hai phần môi trường bên 381 Nguyen Thi Nhat Linh et al có chứa AC bên khơng có AC (hình 2e) Bên cạnh đó, cấy chồi Cúc vào hai lớp mơi trường có bổ sung AC không bổ sung AC ống nghiệm có mơi trường thạch nằm nghiêng hay thẳng đứng gần 99% rễ phát triển phần môi trường có AC (hình 2g, 2h) Tuy nhiên, Cúc rễ kéo dài, tăng trưởng hướng xuống tốt mơi trường khơng có AC, vậy, hướng rễ chịu tác động việc phân bố vị trí phần mơi trường có bổ sung AC rễ Hồng mơn chúng có khuynh hướng mọc phần môi trường tối AC với tỉ lệ rễ phụ thuộc vào lớp AC cao tất công thức (bảng 4) Bảng Ảnh hưởng vị trí phần mơi trường có bổ sung AC lên định hướng rễ Hồng môn in vitro sau 60 ngày nuôi cấy Công thức N0 N1 N2 N3 N4 Khối lượng tươi (mg) Chồi Rễ d* 48,2 10,3d c 129,2 53,0c b 146,4 58,7b 192,2a 70,7a b 153,1 72,1a Chiều cao chồi (cm) 2,00d 3,26c 3,75b 4,00a 3,80b Chiều dài rễ (cm) 0,2d 0,7c 1,0b 2,1a 1,9a Số Số rễ 2,0b 4,5a 4,8a 4,8a 5,0a 1,0d 3,8b 4,0ab 4,7a 4,2ab Rễ lớp AC (%) 95c 97b 100a 100a *Các chữ a, b, c thể khác biệt có ý nghĩa mức tin cậy p = 0,05 phép thử Duncan Bảng Ảnh hưởng vị trí lớp mơi trường có bổ sung AC lên định hướng rễ Cúc in vitro sau 21 ngày nuôi cấy Công thức N0 N1 N2 N3 N4 Khối lượng tươi (mg) Chồi Rễ 449,6c* 156,7b 505,0bc 185,0b 507,3bc 192,3b ab 572,3 226,7a 632,0a 229,7a Chiều cao chồi (cm) 4,6d 5,0c 5,6b 6,0a 6,1a Chiều dài rễ (cm) 4,2c 5,8ab 6,5ab 6,9a 6,6ab Số Số rễ 7,7b 9,3a 9,3a 9,7a 9,7a 16,7d 20,7bc 22,2b 25,5a 25,8a Rễ lớp AC (%) 83d 75c 96b 100a *Các chữ a, b, c thể khác biệt có ý nghĩa mức tin cậy p = 0,05 phép thử Duncan Ngồi ra, bổ sung AC vào mơi trường ni cấy vị trí khác phần mơi trường có bổ sung AC có ảnh hưởng định lên khả phát triển Hồng môn Cúc (bảng 3, 4) Đối với Hồng mơn, vị trí lớp AC nằm giúp cho phát triển tốt với khối lượng chồi (192,2 mg), khối lượng rễ (70,7 mg), chiều dài rễ (2,1 cm), số (4,8 lá), số rễ (4,7 rễ) Điều hướng rễ Hồng mơn mọc thẳng xuống vị trí có AC đa số rễ mọc nằm môi trường nuôi cấy, hấp thu chất dinh dưỡng tốt (hình 2c) Đối với Cúc, lớp mơi trường chứa AC nằm cho kết sinh trưởng, phát triển 382 tối ưu với khối lượng rễ (226,7 mg), chiều dài rễ (6,9 cm), số (9,7), số rễ (5,5), khối lượng chồi lại khơng cao nghiệm thức tồn mơi trường bổ sung AC (hình 2e, 2f, bảng 4) Kết quan sát hình thái giải phẫu học Hình thái rễ Hồng mơn Cúc thí nghiệm định hướng rễ Đối với Hồng mơn, kết quan sát cho thấy, rễ Hồng môn phát triển môi trường nuôi cấy không quan sát thấy lông hút, đặc biệt phần gần chóp rễ Mạch dẫn chóp rễ lớp mơi trường có AC nằm lớn khả tăng trưởng TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3): 377-388 rễ tốt (bảng 3) rễ mơi trường bổ sung tồn AC có lớp biểu bì bên ngồi dày phải chịu cọ sát nhiều với toàn AC mơi trường ni cấy (hình 2d) Đối với Cúc, rễ phát sinh từ chồi nuôi cấy mơi trường khơng có AC có số lượng lơng hút nhiều số lượng thấp toàn mơi trường có AC (số liệu khơng nêu ra, hình 2f) Cấu tạo phần rễ bên khơng có khác biệt nhiều với kích thước lớp biểu bì nhau, phần chóp rễ tương tự cơng thức có AC, mạch dẫn rễ Cúc nghiệm thức có lớp AC nằm lớn khơng đáng kể, có phần mạch dẫn rễ Cúc mơi trường khơng có AC nhỏ nhất, khả phát triển rễ từ nghiệm thức có bổ sung AC chênh lệch khơng q lớn (hình 2f, bảng 3) Khi so sánh Cúc Hồng mơn rễ Hồng mơn có đường kính lớn nhiều Tuy nhiên, nhìn chung phần chóp rễ Cúc dày dài rễ Hồng mơn, nữa, chóp rễ Cúc có phần bao đầu rễ dày nhọn hơn, chiều dài rễ dài Với thời gian sinh trưởng ngắn nhiều so với Hồng môn phần mô phân sinh chóp rễ dày nên tốc độ tăng trưởng rễ Cúc nhanh Hồng môn nhiều (bảng 3, 4) Bên cạnh đó, quan sát thấy lông hút rễ Cúc phát triển môi trường Hồng môn quan sát thấy lông hút rễ phát triển bề mặt mơi trường Điều đặc tính dạng rễ khí sinh Hồng mơn khác dạng rễ chùm Cúc (hình 2d, 2f) Hình 2d, 2f cho thấy tác động AC lên hình thái rễ phụ thuộc vào đặc điểm loài Các có dạng rễ Hồng mơn có kích thước mạch dẫn thay đổi vị trí mơi trường bổ sung AC thay đổi, có dạng rễ Cúc, vị trí lớp mơi trường có AC chủ yếu ảnh hưởng đến số lượng lông hút (hình 2c, 2d) Cấu trúc khí khổng điều kiện có khơng có AC Khi so sánh khí khổng từ mẫu cấy mơi trường khơng có AC với mẫu cấy mơi trường có nồng độ AC tối ưu cho thấy mật độ khí khổng nghiệm thức bổ sung AC dày độ mở khí khổng khơng q lớn giảm so với đối chứng (hình 2a1, 2a2, 2b1, 2b2) Đặc điểm khí khổng có khác biệt định, theo mô tả Vũ Văn Vụ nnk (2007) [20] Esau (1967) [8] cho thấy khí khổng Cúc xếp theo kiểu dị bào, Hồng môn theo kiểu song bào phản ứng chúng với điều kiện có AC khác Ở Cúc, AC chủ yếu giúp tăng mật độ khí khổng lên gấp lần làm giảm đáng kể kích thước khí khổng với kích thước giảm gần so với mơi trường khơng có AC khơng gây biến dạng khí khổng (số liệu khơng nêu ra, hình 2b1, 2b2) Ở Hồng mơn, tác động AC khơng làm biến dạng khí khổng hay thay đổi kích thước khí khổng mà làm gia tăng đáng kể mật độ khí khổng gấp hai lần so với mẫu ni cấy mơi trường khơng có bổ sung AC, nhiên không dày đặc Cúc (số liệu khơng nêu ra, hình 2a1, 2a2) Khảo sát sinh trưởng, phát triển điều kiện ex vitro Thích nghi ngồi vườn ươm giai đoạn cuối quan trọng toàn trình vi nhân giống Chất lượng giống in vitro định đến khả sống sót điều kiện ex vitro Các Hồng môn, Cúc sinh trưởng phát triển tốt điều kiện in vitro từ mơi trường có bổ sung g/l AC (Hồng môn), g/l AC (Cúc) cần lớp môi trường nằm (với khoảng 20 ml môi trường) tiếp tục tăng trưởng tốt điều kiện ex vitro (Bảng 5, 6, Hình 3) Cây tăng sinh nhanh, chiều dài [4,9 cm (Hồng môn), cm (Cúc)], chiều rộng [2,97 cm (Hồng môn), cm (Cúc)], số [4 (Hồng môn), 18 (Cúc)], chiều cao [4,17 cm (Hồng môn), 18,7 cm (Cúc)], tỉ lệ sống (100% Hồng mơn Cúc) (bảng 6, hình 3) Chỉ sau tuần điều kiện ex vitro, hầu hết Hồng môn Cúc bắt đầu hình thành mới, đặc biệt, Cúc tăng trưởng nhanh, sau khoảng 120 ngày bắt đầu nở hoa 383 Nguyen Thi Nhat Linh et al Hình Ảnh hưởng AC lên khả sinh trưởng, phát triển định hướng rễ Hồng môn Cúc Sự sinh trưởng phát triển Hồng môn (a) Cúc (b) với nồng độ AC từ 0-5 g/l (từ trái sang phải) Khả định hướng rễ AC Hồng môn (c, d, j, k), Cúc (e, f, g, h) d, f: hình thái giải phẫu rễ Hồng mơn Cúc vật kính ×40 Hình thái khí khổng vật kính ×40 ×100: (a1) khí khổng Cúc từ mẫu mơi trường khơng có AC, (a2) khí khổng Cúc từ mẫu mơi trường có AC, (b1) khí khổng Hồng mơn từ mẫu mơi trường khơng có AC, (b2) khí khổng Hồng mơn mơi trường có AC 384 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3): 377-388 Hình Ảnh hưởng AC lên khả sinh trưởng phát triển Hồng môn Cúc in vitro chuyển vườn ươm Cây Hồng môn ex vitro 60 ngày tuổi (a) Cúc ex vitro 30 ngày tuổi (b) từ thí nghiệm khảo sát nồng độ AC từ 0-5 g/l (từ trái sang phải) lên sinh trưởng phát triển chúng; Hồng môn ex vitro 60 ngày tuổi (c) Cúc ex vitro 30 ngày tuổi (d) từ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng vị trí lớp AC mơi trường ni cấy lên khả định hướng rễ chúng 385 Nguyen Thi Nhat Linh et al Bảng Ảnh hưởng nồng độ AC lên sinh trưởng, phát triển Hồng môn sau 60 ngày Cúc sau 30 ngày điều kiện vườn ươm Chỉ tiêu theo dõi Hồng môn Cúc Chiều dài (cm) Chiều rộng (cm) Chiều cao (cm) Số Tỉ lệ sống (%) Chiều dài (cm) Chiều rộng (cm) Chiều cao (cm) Số Tỉ lệ sống (%) 0,60c* 0,40c 2,5c 0,67c 35c 3,5ab 1,6c 6,9c 13,0d 100a 3,33ab 2,33b 3,27bc 3,33ab 95ab 5,0a 1,3b 7,7c 15,7ab 100a AC (g/l) 4,07a 3,13ab 4,67a 2,53b a 4,03 3,83a 4,67a 4,33ab a 100 90b a 4,9 4,5ab a 3,4 3,0a ab 12,8 14,5a bc 15,3 17,7a a 100 100a 2,33b 2,33b 3,50b 3,00ab 90b 3,1b 2,0bc 10,3bc 13,0d 100a 2,20b 1,80bc 3,33b 2,33bc 90b 3,2b 2,1bc 8,2c 13,3cd 100a *Các chữ a, b, c thể khác biệt có ý nghĩa mức tin cậy p = 0,05 phép thử Duncan Bảng Ảnh hưởng vị trí phần mơi trường bổ sung AC lên sinh trưởng, phát triển Hồng môn sau 60 ngày Cúc sau 30 ngày vườn ươm Chỉ tiêu theo dõi Hồng môn Cúc Chiều dài (cm) Chiều rộng (cm) Chiều cao (cm) Số Tỉ lệ sống (%) Chiều dài (cm) Chiều rộng (cm) Chiều cao (cm) Số Tỉ lệ sống (%) N0 0,5c* 0,38c 2,4c 2,1c 34c 4,3ab 2,6c 13,2c 12,7d 100a N1 3,8ab 2,97b 4,20a 2,7b 95b 4,0b 4,4a 15,9bc 17,5bc 100a Công thức N2 2,9b 2,03c 3,43b 2,6b 100a 5,3ab 4,0a 16,6bc 17,7bc 100a N3 4,9a 2,97b 4,17a 4,1a 100a 6,0a 3,0bc 18,7ab 18,2b 100a N4 4,4ab 4,07a 3,43b 4,0a 100a 5,9a 3,1bc 21,3a 19,7a 100a *Các chữ a, b, c thể khác biệt có ý nghĩa mức tin cậy p = 0,05 phép thử Duncan KẾT LUẬN Đối với sinh trưởng phát triển in vitro, nồng độ AC thích hợp bổ sung vào môi trường MS cho sinh trưởng phát triển chồi với mật độ khí khổng gia tăng đáng kể hình thành rễ chồi Hồng mơn g/l Cúc g/l Vị trí lớp AC nằm với thể tích 20 ml tối ưu cho sinh trưởng, phát triển Hồng môn Cúc nuôi cấy in vitro Đối với định hướng rễ in vitro, phát triển kéo dài đa số rễ phụ thuộc vào vị trí lớp AC hầu hết rễ hai loại trồng tăng trưởng lớp AC [Hồng mơn (trên 95%), Cúc (trên 80%)] Ngồi 386 ra, Hồng mơn vị trí lớp AC nằm cho thấy hệ thống mạch dẫn tăng kích thước rõ ràng Cúc Hơn nữa, rễ Cúc thay đổi vị trí lớp AC ảnh hưởng đáng kể đến phát triển lông hút vị trí lớp mơi trường nằm cho thấy số lượng lông hút không giảm so với mơi trường khơng có AC Đối với ex vitro, Hồng mơn Cúc có nguồn gốc từ AC sinh trưởng phát triển tốt khơng có nguồn gốc từ AC giai đoạn vườn thông qua số tiêu thu chiều dài lá, chiều rộng lá, số lá, chiều cao tỉ lệ sống Như vậy, AC có vai trò quan trọng chất lượng in vitro ex vitro TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3): 377-388 Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn Viện Sinh học Tây Nguyên tạo điều kiện để thực tốt đề tài TÀI LIỆU THAM KHẢO Biniak S., Kazmierczak J and Swiatkowski A., 1990 Adsorption of phenol from aqueous solutions on activated carbons with different oxygen contents Polish J Chem., 64: 182-191 Buter B., Pescitelli S M., Berger K., Schmid J E and Stamp P., 1993 Autoclaved and filter sterilised liquid media in maize anther culture: significance of activated charcoal Plant Cell Rep., 13: 7982 Christopher J C., Veronica A H and Roberto G L., 2012 Growth, morphology, and quality of rooted cuttings of several herbaceous annual bedding plants are influenced by photosynthetic daily light integral during root development Hort Sci., 47(1): 25-30 Debergh P., Harbaoui Y and Lemeur L., 1981 Mass propagation of globe artichoke (Cynara scolymus): evaluation of different hypotheses to overcome vitrification with special reference to water potential Physiol Plant, 53: 181-287 Dumas E and Monteuuis O., 1995 In vitro rooting of micropropagated shoots from Juvenile and mature Pinus pinaster explants–influence of activated charcoal Plant Cell Tiss Org Cult., 40: 231-235 Duncan D B., 1955 Multiple ranges and multiple F test Biometrics, 11: 1-42 Ebert A and Taylor H F., 1990 Assessment of the changes of 2,4dichlorophenoxyacetic acid concentrations in plant tissue culture media in the presence of activated charcoal Plant Cell Tiss Org Cult., 20: 165-172 Esau K., 1967 Plant anatomy, 2nd (ed) John Wliey and Sons, New York, 767 Fridborg G., Pederson M., Landstrom L E and Eriksson T., 1978 The effect of activated charcoal on tissue cultures: adsorption of metabolites inhibiting morphogenesis Physiol Plant, 43: 194-106 10 Gantait S., Mandal N., Bhattacharyya S and Das P K., 2008 In vitro mass multiplication with pure genetic identity in Anthurium andreanum Lind Plant Tiss Cult Biotech., 18(2): 113-122 11 Johansson L and Eriksson T., 1977 Induced embryo formation in anther culture of several Anemone species Physiol Plant, 40: 172-174 12 Kee-Yoeup P and Eun-Joo H., 2000 Cytokinins, auxins and activated charcoal affect organogenesis and anatomical characteristics of shoot-tip cultures of Lisianthus [Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn] In Vitro Cell Dev Bio Plant, 36(2): 128-132 13 Krajňáková J., Gömöry D and Häggman H., 2009 Effect of sucrose concentration, polyethylene glycol and activated charcoal on maturation and regeneration of Abies cephalonica somatic embryos Plant Cell Tiss Org Cult., 96: 251-262 14 Kunitake H., Nakashima T., Mori K., Tanaka M and Mii M., 1995 Plant regeneration from mesophyll protoplasts of Lisianthus (Eustoma grandiflorum) by adding activated charcoal into protoplast culture medium Plant Cell Tiss Org Cult., 43: 59-65 15 Mathews H., Schopke C., Carcamo R., Chavarriaga P., Fauquet C and Beachy R N., 1993 Improvement of somatic embryogenesis and plant recovery in cassava Plant Cell Rep., 12: 328-333 16 Murashige T and Skoog F., 1962 A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture Physiol Plant, 15: 473-479 17 Pan M J and Staden V J., 1998 The use of charcoal in in vitro culture: review J Plant Grow Reg., 26: 155-163 18 Sánchez M C., San-josé M C., Ballester A and Vieitez A M., 1996 Requirements for in vitro rooting of Quercus robur and Q rubra shoots derived from mature trees 387 Nguyen Thi Nhat Linh et al Tree Physiol., 16: 673-680 19 Takayama S and Misawa M., 1980 Differentiation in Lilium bulbscales in vitro Effect of activated charcoal, physiological age of bulbs and sucrose concentration on differentiation and scale leaf formation in vitro Physiol Plant, 48: 121-125 20 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm Hoàng Minh Tấn, 2007 Sinh lý thực vật, 7th, Nxb Giáo dục, Hà Nội, 312 21 Wann S R., Veazey R L and Kaphammer J., 1997 Activated charcoal does not catalyze sucrose hydrolysis in tissue culture media during autoclaving Plant Cell Tiss Org Cult., 50: 221-224 22 Ziv M and Gadasi G., 1986 Enhanced embryogenesis and plant regeneration from cucumber (Cucumis sativus L.) callus by activated charcoal in solid/liquid double layer cultures Plant Sci., 47: 115-122 EFFECTS OF ACTIVATED CHARCOAL ON THE ROOT ORIENTATION OF Anthurium andraeanum AND Chrysanthemum morifolium CULTURED IN VITRO Nguyen Thi Nhat Linh, Nguyen Ba Nam, Nguyen Thi Kim Yen, Le Kim Cuong, Nguyen Phuc Huy, Duong Tan Nhut Tay Nguyen Institute of Biology, VAST SUMMARY Activated charcoal (AC) is usually used in culture media to enhance the growth and development of in vitro plants, however, the effective ness of root orientation of AC has not yet been investigated Therefore, the precursor of root orientation designs was carried out by dividing media into two parts, AC-free part and AC part with the optimal investigated concentrations, g/l AC for Anthurium andraeanum and g/l AC for Chrysanthemum morifolium and then examining effects of positions of AC part (top, center or bottom) The results showed that most of the developing roots occurred in the AC parts (over 80%) Moreover, the root orientation of A andraeanum was more considerable than that of C morifolium In addition, position of AC part in the bottom was the best for the growth and development of in vitro roots and shoots of A andraeanum and C morifolium Besides, plantlets were grown and developed well in vitro conditions also have good growth and development in ex vitro conditions The results have a great signification in plant micropropagation Keywords: Anthurium andraeanum, Chrysanthemum morifolium, activated charcoal, root orientation, plant tissue culture Ngày nhận bài: 3-7-2012 388 ... lượng rễ/ cây chiều dài rễ (cm), tỉ lệ hình thành rễ (%) sau 21 ngày nuôi cấy Cúc sau 60 ngày nuôi cấy Hồng môn Ảnh hưởng nồng độ AC lên sinh trưởng, phát triển chồi Hồng môn Cúc in vitro Khảo... khoảng 120 ngày bắt đầu nở hoa 383 Nguyen Thi Nhat Linh et al Hình Ảnh hưởng AC lên khả sinh trưởng, phát triển định hướng rễ Hồng môn Cúc Sự sinh trưởng phát triển Hồng môn (a) Cúc (b) với nồng độ... sát ảnh hưởng nồng độ AC lên sinh trưởng, phát triển chồi Hồng môn Cúc in vitro Các chồi Cúc Hồng mơn in vitro cấy vào bình thủy tinh 250 ml chứa 30 ml mơi trường MS khơng có chất điều hòa sinh