ảnh hưởng một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng tích lũy lipid của một số chủng vi khuẩn lam

Trong khi các nguồn nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học thông thườngnhư dầu thực vật, mỡ động vật và nguồn dầu mỡ phế thải đều tỏ ra không thể đápứng được nhu cầu nhiên liệu sinh họ

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, hai vấn đề quan trọng đang được nhiều ngườiquan tâm đến đó là ô nhiễm môi trường và khủng hoảng năng lượng Chúng ta đềubiết rằng sử dụng nhiên liệu hoá thạch chính là nguyên nhân gây ra sự nóng dần lêncủa trái đất, đang và sẽ ảnh hưởng đến nhiều khía cạnh khác nhau của nhân loại vàmôi trường Tìm kiếm những nguồn nguyên liệu sạch và có khả năng tái sinh là mộttrong những vấn đề thách thức nhất mà con người đang đối mặt trong hiện tại lẫn vềlâu dài [20]

Trong khi các nguồn nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học thông thườngnhư dầu thực vật, mỡ động vật và nguồn dầu mỡ phế thải đều tỏ ra không thể đápứng được nhu cầu nhiên liệu sinh học trên toàn thế giới, vi tảo lại thể hiện là mộtđối tượng rất tiềm năng cho lĩnh vực này nhờ vào khả năng sản xuất sinh khối lớn

và nguồn lipid thu nhận từ các loài vi tảo cũng khá phù hợp để điều chế nhiên liệusinh học Tuy nhiên, giá thành sản xuất lipid từ tảo vẫn còn quá đắt, phần lớn là dosản lượng lipid của nuôi cấy tảo thấp [87] Nhưng mặt khác, tảo có thể được nuôicấy trên các môi trường sửa đổi để nâng cao năng suất lipid phục vụ cho sản xuấtnhiên liệu sinh học [73]

Vi khuẩn lam là một nhóm vi tảo có tiềm năng trong việc sử dụng làmnguồn nguyên liệu để sản xuất nhiên liệu sinh học Kết quả thăm dò hàm lượng

lipid ở một số chủng vi khuẩn lam thuộc các chi Oscillatoria, Nostoc, Microcystis,

… bằng phương pháp Soxhlet đã xác định được các chủng vi khuẩn lam chứa mộthàm lượng lipid từ 10,55 – 28,15% [83] Sự tích lũy lipid ở vi khuẩn lam xảy ra khi

cơ thể bị stress hoặc tăng trưởng ở giai đoạn tĩnh, đồng thời năng suất lipid có thểđược tăng trong điều kiện môi trường biến đổi [73] Với khả năng quang hợp cao, vikhuẩn lam có thể chuyển đổi đến 10% năng lượng mặt trời thành năng lượng sinhkhối so với 1% ở các cây năng lượng truyền thống như ngô, mía hoặc 5% ở các loàitảo khác Đồng thời, chúng phát triển với mật độ cao và có năng suất cao Nhu cầuphát triển của vi khuẩn lam tương đối đơn giản, chúng không cạnh tranh với nguồn

nước ngọt và đất canh tác [61] Ngoài sản xuất năng lượng sinh học, vi khuẩn lamcòn là đối tượng tiềm năng để khai thác nhiều sản phẩm có giá trị khác [6].

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới với nhiều ao, hồ, sông ngòi, đây là điều kiệnthuận lợi cho nhiều loài vi khuẩn lam phát triển Tuy nhiên, những nghiên cứu về vikhuẩn lam ở Việt Nam chỉ mới tập trung chủ yếu vào đa dạng sinh học, khả năngsinh độc tố [1], [2], [3], [4]

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Ảnhhưởng một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng tích lũy lipid của một số chủng vikhuẩn lam” được phân lập từ một số thủy vực nước ngọt ở Việt Nam

Mục tiêu đề tài nhằm tìm kiếm các chủng vi khuẩn lam có khả năng sản sinhlipid cao và thăm dò điều kiện nuôi cấy thích hợp cho việc tích lũy lipid ở cácchủng này Kết quả của đề tài sẽ làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn nhằm tìm rađược môi trường tối ưu để các chủng vi khuẩn lam cho hàm lượng lipid cao, đápứng được nhu cầu sản xuất nhiên liệu sinh học

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VI KHUẨN LAM

1.1.1 Sơ lược về vi khuẩn lam

Vi khuẩn lam là một nhóm các sinh vật prokaryote quang tự dưỡng đầu tiêntrong lịch sử tiến hoá Chúng xuất hiện vào đầu kỉ Cambri, cách đây khoảng 2,5 đến

3 tỉ năm Ngành có khoảng 150 chi với 2000 loài Do vị trí phân loại không rõ ràngnên có nhiều thuật ngữ khác được sử dụng cho vi khuẩn lam, bao gồm “tảo lam”,

“Cyanobacteria”, “Cyanophyta”, “Cyanocholoronta” và “Myzophyta” [81], [97]

1.1.1.1 Đặc điểm cấu trúc

Vi khuẩn lam là vi khuẩn Gram âm, nhưng chúng kết hợp tính chất của vikhuẩn Gram âm và Gram dương Chúng có chứa một lớp màng bên ngoài vàlipopolysaccharide xác định đặc điểm của vi khuẩn Gram âm, vách tế bào dày cấutạo bởi peptidoglycan tương tự như vi khuẩn Gram dương [39],[ 72]

Tế bào có kích thước 1–10 µm Vi khuẩn lam chưa có nhân hoàn chỉnh, chưa

có các bào quan có màng như ty thể, bộ máy golgi, lưới nội chất, không bào…Chúng có chứa ribosome 70 S [72]

Hầu hết các bộ phận bên trong tế bào vi khuẩn lam là thylakoid Các túithylakoid xếp chồng lên nhau tạo thành cấu trúc grana Trên màng thylakoid chứacác sắc tố chlorophyll α, β-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năngcarotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năngcủa ăng-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năngten thu nhận ánh sáng Ngoài ra, vi khuẩn lam còn chứa enzyme RuBisCo

là enzyme chịu trách nhiệm cho việc cố định CO2 trong chu trình Calvin [63]

1.1.1.2 Hình thái học vi khuẩn lam

Vi khuẩn lam đơn bào sống tự do hoặc đính kèm trong một bao nhầy Sau đótiến hóa dẫn đến hình thành một chuỗi các tế bào được gọi là trichome Khitrichome được bao quanh bởi vỏ bọc, cấu trúc được gọi là một filament Có thể cónhiều trichome trong filament [18]

Thông thường hình thái của vi khuẩn lam thuộc vào hai loại tổ chức: đơn bàohoặc tập đoàn và dạng sợi (hình 1.2).

Hình 1.1 Cấu trúc tế bào vi khuẩn lam (theo Koning, Ross E., 1994) [42]

Hình 1.2 Hình thái vi khuẩn lam [63]

A Dạng đơn bào (Aphanothece) B Dạng tập đoàn (Microcystis)

C Dạng sợi (Aphanizomenon) Đơn bào và tập đoàn

Đơn bào là dạng đơn giản và chiếm phần lớn của vi khuẩn lam Dạng đơn bàothường hình cầu, hình bầu dục hoặc hình trụ Tập đoàn có thể dạng hình cầu, dạngkhối, dạng ống, dạng sợi phân nhánh hoặc không phân nhánh với sự sắp xếp một lớphoặc nhiều lớp; sợi có thể có các tế bào dị hình hoặc bào tử vỏ dày Một vài dạng phù

màng thylakoid

ribosome tinh bột

thành tế bào chromosome

me

thể polyhedral

giọt lipid cyanophycin

du có thể nổi nhờ có không bào, hầu hết dạng sợi đều vận động được [21], [72].

Dạng đơn bào hoặc tập đoàn đôi khi tạo thành một cấu trúc sợi giả Chẳnghạn, bộ Chroococales bao gồm tất cả các tế bào đơn hoặc tập đoàn, nhưng khônghình thành sợi thật với sự giao thoa sinh lý trực tiếp giữa các tế bào

Đại diện chi Chroococcus, gồm các tế bào đơn lẻ hoặc tập đoàn gồm 2, 4, 16

tế bào hay ít gặp hơn là 32 tế bào hình bán cầu; chúng là kết quả của các tế bàocon sau khi phân chia, có thể có hoặc không có vỏ bọc [23]

Dạng sợi

Dạng sợi chính là trichome gồm một chuỗi dài các tế bào vẫn gắn với nhau

sau khi phân chia Trichome của Oscillatoria là dạng sợi đơn giản nhất, chúng

được tạo thành từ một chuỗi dài các tế bào đặt trong một lớp vỏ khác để tạo thành

một "trichome" Quá trình phân chia của tế bào sợi Oscillatoria xảy ra trong cùng một mặt phẳng Vỏ bọc của sợi Oscillatoria thường khó phân biệt trong khi nó có thể được nhìn thấy rõ ràng trong Lyngbya, đặc biệt là tại đỉnh sợi, Spirulina và Arthrospira thì sợi có hình dạng xoắn ốc [23], [98].

Trichome của vi khuẩn lam thường không phân nhánh như ở Oscillatoria và Lyngbya hoặc có thể được phân nhánh như ở Westiella, Hapalosiphon Trong các dạng nhánh, có dạng nhánh giả như ở Scytonema, Plectonema, Tylopothrix và các dạng nhánh thật như ở Haphalosiphon, Stigonema [23].

Trong nhánh giả thường xuất hiện nhánh giả đôi Do một sợi nhỏ gián đoạnbởi một tế bào chết bị phình cả hai đầu, hoặc ít phổ biến hơn là bởi sự khác biệt của

tế bào dị hình Các phân nhánh giả có thể là mảnh vỡ của trichome nảy mầm pháttriển tại chỗ, khi kết thúc chúng phát triển xuyên ra khỏi vỏ bọc của sợi mẹ [23]

Hình thái phức tạp nhất của vi khuẩn lam là sợi nhánh thật, chúng có thể

được tạo nên bởi một hàng tế bào duy nhất như trong Haphalosiphon hoặc nhiều hàng tế bào như trong Stigonema Phân nhánh này tạo ra bởi sự hình thành của

nhánh thật bên, cũng như trichome chính trở thành có răng như răng cưa Nhánhthật hình thành theo chiều dọc hoặc đôi khi xiên chéo Chúng phát sinh bởi sự phânchia tế bào theo phương vuông góc với trục chính của sợi [18], [98]

Một số filament hình thành các tế bào đặc trưng gọi là tế bào dịhình(heterocyst), có chức năng cố định nitrogen tự do trong không khí Tế bào dịhình thường trong suốt, có thể lớn hơn tế bào dinh dưỡng, có vách tế bào dày vớicác nốt u ở hai cực tế bào nối liền tế bào dị hình với tế bào dinh dưỡng [14].

1.1.1.3 Sinh lý học vi khuẩn lam

Vi khuẩn lam có khả năng hấp thụ ánh sáng mặt trời nhờ sự có mặt của cácsắc tố quang hợp, gồm một hoặc hai loại diệp lục cùng với carotene và phycobilin.Các sắc tố quang hợp ở trên thylakoid nằm trong tế bào chất

Chất diệp lục

Chất diệp lục là một thành phần sinh hóa quan trọng trong bộ máy quanghợp, trong đó năng lượng từ ánh sáng mặt trời được sử dụng để sản xuất oxygenduy trì sự sống Do có sự hiện diện của chất diệp lục nên vi khuẩn lam có đặc tínhquang hợp giống thực vật Một trong những đặc tính để phân biệt vi khuẩn lam vớicác vi khuẩn quang hợp khác đó là chúng sở hữu một sắc tố khác làbacteriochlorophyll Chất diệp lục là sắc tố quang hợp quan trọng, trong khi nhữngsắc tố khác (carotenoid và phycobilin) là sắc tố phụ [47]

Chất diệp lục b có ở một số chi như Prochloron, Prochlorococcus và Prochlorothrix được coi là một sắc tố phụ bởi vì nó mở rộng phạm vi của ánh sáng

có thể được sử dụng trong quang hợp, và chuyển năng lượng ánh sáng hấp thu đếnchất diệp lục [47]

Phycobilin

Vi khuẩn lam không sản xuất chất diệp lục b thường có sắc tố phycobilin hòatan trong nước, có thể hấp thụ các bước sóng ánh sáng cần cho quang hợp vàchuyển giao năng lượng cho chlorophyll a

Phycobilin của vi khuẩn lam bao gồm phycoerythrobilin và phycocyanobilin, kếthợp với protein cũng được gọi chung là phycobiliprotein Vi khuẩn lam có cácphycobiliprotein: C-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năngphycocyanin, allophycocyanin, C-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năngphycoerythrin,phycoerythrocyanin [14], [47]

Carotenoid được tìm thấy trong vi khuẩn lam bao gồm các sắc tố xanthophyll

có chứa oxy và β-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năngcarotene thiếu oxygen trong cấu trúc phân tử của chúng Nhữngsắc tố này nằm trên thylakoid cùng với chất diệp lục Các carotenoid chính có mặttrong vi khuẩn lam là β-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năngcarotene, nostoxanthin, caloxanthin, echinenone,myxoxanthin và zeaxanthin

Carotenoid là một trong những nhóm quan trọng nhất của các sắc tố tự nhiên,

vì chúng phân phối rộng rãi, cấu trúc đa dạng và nhiều chức năng Carotenoid lànhững sắc tố quan trọng trong các tế bào vi khuẩn lam Bởi vì chúng đóng vai trò làsắc tố phụ giúp vi khuẩn lam tăng khả năng hấp thụ ánh sáng xanh không được trựctiếp hấp thụ bởi chất diệp lục, đồng thời có vai trò bảo vệ chúng khỏi quá trình oxyhóa quang năng có hại, đặc biệt là bảo vệ cho chất diệp lục chống lại quá trình oxyhóa [14], [47]

1.1.1.4 Điều kiện sinh thái

Vi khuẩn lam có sự phân bố rộng, có thể sống trong môi trường nước biển vànước ngọt, đất ẩm và đá, sống tự do hoặc cộng sinh Chúng còn có thể phát triểnmạnh trong các suối nước nóng, băng tuyết, trong sa mạc nóng, các vùng đất khôcằn, trong các vùng nóng khô hạn và trong môi trường mà các vi tảo khác không thểtồn tại, hay cả Bắc Cực, Nam Cực [21], [97], [104]

Khoảng 20% vi khuẩn lam được biết sống trong môi trường nước mặn, phầnlớn trong số chúng thực sự ở biển và tạo thành một lớp quan trọng của thảm thựcvật biển Chúng sống ở các khu vực khác nhau của môi trường biển như đại dương,vùng cửa sông, nước biển đọng, hồ muối cửa sông, hồ nước mặn nội địa, đầm lầynước mặn và chảo muối siêu mặn [90], [104]

Vi khuẩn lam có thể cộng sinh trong cơ thể bọt biển, amip, tiên mao sinh vậtđơn bào, tảo cát, tảo lục, thực vật có mạch hay cộng sinh với nấm trong địa y [81]

1.1.1.5 Dinh dưỡng

Phần lớn vi khuẩn lam là các sinh vật quang tự dưỡng hiếu khí Đời sống củachúng cần có nước, CO2, chất vô cơ và ánh sáng Quang hợp là quá trình chính của

trao đổi chất và năng lượng Tuy nhiên, trong tự nhiên một số loài có thể tồn tạihoàn toàn trong bóng tối một thời gian dài Hơn nữa, một số vi khuẩn lam còn cókhả năng dinh dưỡng dị dưỡng [21].

-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng Dinh dưỡng carbon

Vi khuẩn lam có khả năng sử dụng các chế độ khác nhau của quá trình traođổi carbon Quang hợp, quá trình sản xuất các chất hữu cơ từ CO2 và H2O trongđiều kiện ánh sáng là phương pháp chính của dinh dưỡng carbon (autotrophy).Tuy nhiên, khi được cung cấp với các hợp chất hữu cơ để bổ sung CO2, nhiều vikhuẩn lam sử dụng carbon hữu cơ để tổng hợp Có vài loài có thể phát triển trongbóng tối với nguyên liệu nguồn carbon hữu cơ (heterotrophy)

-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng Dinh dưỡng nitrogen

Vi khuẩn lam có thể dễ dàng sử dụng các hợp chất nitrogen vô cơ như muốinitrate, nitrite và amoni Một số loài cũng có thể đồng hóa phân tử nitrogen từ bầu khíquyển (loài cố định N2), và một số loài có thể sử dụng các hợp chất nitrogen hữu cơ.Amoni-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năngnitrogen là nguồn cung cấp nitrogen thuận lợi nhất, nhưng chúng thường

hỗ trợ tăng trưởng kém hơn so với nitrate khi cung cấp ở mức tương đương và cóthể gây ra ly giải tế bào Nitrate là nguồn nitrogen ưa thích nhất trong môi trườngnuôi cấy

Cố định nitrogen

Cố định nitrogen là sự kết hợp nitrogen trong khí quyển như là một nguồnnitrogen vào trong các tế bào của sinh vật Khả năng cố định nitrogen bị hạn chế ởmột số vi sinh vật prokaryote Trong số vi khuẩn lam chỉ có 27 chi có khả năng cốđịnh nitrogen Enzyme tham gia vào quá trình cố định nitrogen là nitrogenase

Cố định nitrogen hiếu khí và quang hợp sản xuất oxygen là hai quá trình khôngthể xảy ra đồng thời trong cùng một tế bào

-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng Các chất dinh dưỡng khác

Bên cạnh C, H, N, và O, các yếu tố chính cần thiết cho tăng trưởng của vi khuẩnlam (P, S, K, Na, Mg, Ca) không khác với nhu cầu của các nhóm thực vật khác Cácyếu tố (Fe, Mn, Bo, Mo, Cu, Zn, Co) cũng là yếu tố cần thiết cho sự tăng trưởng của

vi khuẩn lam Molybdenum là một thành phần của cả nitrogenase và nitratereductase đều cần thiết cho dinh dưỡng đạm của vi khuẩn lam [75].

(Merismopedia, cho ra tập đoàn dạng phẳng) hay theo ba chiều cho ra một khối dày.

Ở các vi khuẩn lam đa bào dạng sợi thì tách thành từng dạng sợi gọi là tảođoạn (hormogonia): tản đứt ra nhiều đoạn ngắn, cử động được, rời tản mẹ và mọcthành sợi khác Nhờ cử động trượt mà tảo đoạn truyền lan loài rất xa

Ở những dạng có bao, tảo đoạn chui ra khỏi bao, chuyển động trong nướctheo hướng trục dài, sau đó dừng lại và nảy mầm thành sợi mới Sự hình thành tảođoạn là một trong những dạng sinh sản phổ biến nhất của các tảo dạng sợi

Một số vi khuẩn lam sinh sản vô tính bằng bào tử không roi, nội sinh hayngoại sinh Bào tử được hình thành từ những tế bào sinh dưỡng và thường lớn hơnnhững tế bào này, có màng dày bảo vệ, tránh những điều kiện bất lợi bên ngoài Bào

tử vừa là cơ quan sinh sản vừa là giai đoạn nghỉ của vi khuẩn lam Khi gặp điềukiện thuận lợi, bào tử nảy mầm thành cơ thể mới

1.1.2 Ứng dụng của vi khuẩn lam

1.1.2.1 Các hợp chất hoạt tính sinh học

Vi khuẩn lam đã được xác định là một nguồn các hợp chất hoạt tính sinh họcmới và phong phú Hợp chất phân lập được thuộc nhóm polyketide, amid, alkaloid,acid béo, indole và lipopeptide [5] Các tài liệu cho thấy, đến nay đã có 19 chủng vikhuẩn lam sản xuất được hơn 20 hợp chất hoạt tính sinh học khác nhau Hầu hết cáchợp chất hoạt tính sinh học phân lập từ vi khuẩn lam có bản chất lipopeptide Phạm vihoạt động sinh học của các chất chuyển hóa thứ cấp phân lập từ vi khuẩn lam bao gồmkháng khuẩn, kháng nấm, kháng tảo, kháng động vật nguyên sinh, và các hoạt độngchống virus [6]

Ví dụ, vi khuẩn lam Phormidium sp có thể ức chế sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn Gram dương và Gram âm, nấm men và nấm Lyngbya majuscula

sản xuất nhiều hợp chất bao gồm các hợp chất chứa nitrogen, polyketide,lipopeptide, peptide cyclic và nhiều hợp chất khác Các hoạt tính sinh học của hợpchất này cũng đa dạng, bao gồm hoạt hóa protein kinase C và khởi động khối u, cácchất ức chế microtubulin, các hợp chất kháng khuẩn, kháng nấm và thuốc chặn kênhnatri [6]

1.1.2.2 Nguồn thực phẩm lành mạnh

Các chi Spirulina, Anabaena và Nostoc được sử dụng làm thức ăn cho con người ở nhiều quốc gia bao gồm Chile, Mexico, Peru và Philippines Arthrospira platensis được trồng ở quy mô lớn bằng cách sử dụng ao ngoài trời hoặc các lò phản

ứng quang sinh học phức tạp Trên thị trường chúng ở dạng bột, mảnh, viên nén vàviên nang, được sử dụng như là một thực phẩm bổ sung vì giàu chất dinh dưỡng vàgiúp tiêu hóa Chúng chứa trên 60% protein, chứa nhiều thiamine, β-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năngcarotene,riboflavin, đồng thời được coi là một trong những nguồn giàu vitamin B12 nhất [6]

Nostoc commun giàu xơ, protein, có thể đóng vai trò sinh lý và dinh dưỡng quan trọng trong chế độ ăn uống của con người Aphanizomenon sp thu nhận từ hồ

Klamath (Oregon, Mỹ) được sử dụng như nguồn thực phẩm lành mạnh Vi khuẩnlam cố định nitrogen cũng được thử nghiệm để nuôi cá trong nuôi trồng thủy sản.Khi nuôi cá rô phi trong nhà và ngoài trời, sử dụng vi khuẩn lam làm thức ăn cho

thấy tốc độ tăng trưởng cao Phormidium valderianum đã được sử dụng ở Ấn Độ

như là một nguồn thức ăn nuôi trồng thủy sản dựa trên giá trị dinh dưỡng và tínhchất không độc hại của nó [6], [17], [52]

1.1.2.3 Tác nhân sinh học làm sạch môi trường

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy vi khuẩn lam có khả năng oxy hóa các thànhphần dầu và các hợp chất hữu cơ phức tạp khác như thuốc diệt cỏ [66] Sự hiệndiện của vi khuẩn lam cùng với vi khuẩn hiếu khí tạo điều kiện cho quá trình thoái

hóa dầu và các hợp chất hữu cơ phức tạp khác Tập đoàn Oscillatoria Gammaproteobacteria đã được chứng minh có thể làm suy giảm phenanthrene,

dibenzothiophene, pristine và n-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năngoctadecane Tỷ lệ suy thoái của các hợp chất này đãđược nâng cao với sự hiện diện của vi khuẩn lam [6].

Vi khuẩn lam và các vi khuẩn liên quan cũng đã được sử dụng thành công

trong xử lý nước thải Ví dụ, nuôi cấy Oscillatoria sp 30501 BDU, Aphanocapsa

sp BDU 16 và một loại vi khuẩn ưa mặn Halobacterium US 101 để xử lý một nhà

máy nước thải và kết quả làm giảm CaCl2 đến mức không ức chế sự tồn tại và và

sinh sản của cá Phormidium valderianum BDU 30501 được sử dụng để làm giảm nồng độ phenol trong khi Oscillatoria boryana BDU 92181 được sử dụng để loại bỏ

sắc tố melanoidin từ nước thải [40], [85]

1.1.2.4 Làm phân bón sinh học

Vi khuẩn lam có tế bào dị hình và một số vi khuẩn lam không có tế bào dịhình được biết đến với khả năng cố định nitrogen trong khí quyển Sự màu mỡ củanhiều vùng đất trồng lúa nhiệt đới có được chủ yếu là do hoạt động cố định đạm của

vi khuẩn lam Một ước tính cho thấy rằng hơn 18 kg N/ ha/ năm được bổ sung vàođất nhờ vi khuẩn lam [101]

Gần đây, vi khuẩn lam cố định đạm đã được báo cáo thống trị lớp vỏ sa mạctrên toàn thế giới Đây được coi là sự đóng góp đáng kể vào độ màu mỡ của đất samạc và cuối cùng có thể tạo điều kiện thuận lợi cho thảm thực vật của sa mạc [29]

1.1.2.5 Chất nhũ hóa

Vi khuẩn lam ưa mặn chứa số lượng lớn exopolysaccharide (EPS), có thểliên quan đến khả năng phục hồi dầu bằng cách giảm sức căng bề mặt, tăng dần độhòa tan và linh động của nó EPS trong điều kiện kiềm được sử dụng để loại bỏ

thuốc nhuộm từ nước thải dệt may Vi khuẩn lam sản xuất EPS là các Anabaena sp ATCC 33047 và Synechococcus sp chịu kiềm [53]

1.1.2.6 Sản xuất năng lượng bền vững

Vi khuẩn lam là một nhóm lớn các vi khuẩn quang tự dưỡng oxygen, có thể

cố định CO2 thông qua chu trình Calvin-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năngBenson và chuyển đổi nó thành các hợpchất hữu cơ Chúng là những nhà sản xuất quan trọng chủ yếu của vật liệu hữu cơ

và đóng vai trò ý nghĩa trong chu trình sinh địa hoá của carbon, nitrogen và oxygen

Thông qua khả năng quang hợp, vi khuẩn lam có vai trò quan trọng trong quá trìnhtiến hóa và thay đổi sinh thái trong suốt lịch sử của trái đất, và chúng tiếp tục đónggóp một phần lớn trong quang hợp khai thác năng lượng mặt trời và đồng hóa CO2thành các hợp chất hữu cơ Hàng năm, vi khuẩn lam sản xuất khoảng 30% oxygentrên Trái đất [39]

Vi khuẩn lam không chỉ được xem như là một chất xúc tác sinh học của ánhsáng mặt trời, chúng cũng có tính chất bổ sung khác cho phép trở thành ứng viên lýtưởng cho sự phát triển của thế hệ năng lượng sinh học thân thiện Do có khả năngphát triển mạnh trong điều kiện CO2 cao, vi khuẩn lam thời gian gần đây nhận đượcnhiều sự chú ý như một hệ thống đầy hứa hẹn để giảm thiểu CO2 sinh học, CO2 phátthải từ hoạt động công nghiệp Có thể khẳng định rằng việc sử dụng vi khuẩn lam đểkhai thác năng lượng mặt trời nhằm sản xuất các loại năng lượng sinh học khác nhau

có thể đại diện cho một hệ thống đơn giản và sạch hơn để sản xuất năng lượng bềnvững [34]

Vi khuẩn lam có thể tổng hợp các hợp chất dự trữ năng lượng làcarbohydrate, lipid và protein Những chất này tạo thành một nguyên liệu tiềm năng

có thể được chuyển đổi thành năng lượng sinh học Trong ba thành phần sinh hóa,thì lipid có năng lượng cao nhất Để trích xuất năng lượng từ phần lipid, nó phảiđược chuyển đổi theo một quá trình hóa học và sau đó các hydrocarbon tạo ra đượcchiết xuất Các hydrocarbon có thể được sử dụng làm nhiên liệu vận chuyển ở dạngnhiên liệu sinh học hoặc có thể được chuyển đổi thành ethanol bằng cách lên men

trong các điều kiện tối thiếu oxygen, hay với việc sử dụng lên men kỵ khí có thể

chuyển đổi thành khí CH4 Vi khuẩn lam có tính chất độc đáo làm cho chúng trởthành một mô hình đầy hứa hẹn để chuyển đổi tất cả các nguồn carbon thành nhiênliệu có giá trị [82], [94]

Sản xuất hydrogen

Vi khuẩn lam đã được sử dụng để sản xuất khí hydrogen, thành phần tạo nênmột nguồn năng lượng thay thế trong tương lai cho nguồn nhiên liệu hóa thạch bị giớihạn Các lợi thế của việc sử dụng hydrogen sinh học làm nhiên liệu là nó thân thiện

với môi trường tự nhiên, hiệu quả, có khả năng tái sinh và không có khí thải CO2 trongquá trình sản xuất và sử dụng nó Sản phẩm hydrogen của vi khuẩn lam như là mộtsản phẩm phụ của cố định đạm, khi vi khuẩn lam mang tế bào dị hình chứanitrogenase được nuôi cấy trong điều kiện thiếu nitrogen, hoặc bằng cách hồi phụchoạt động các enzyme hydrogenase Vi khuẩn lam có tế bào dị hình sản xuất hydrogenhiệu quả hơn so với các loại loài không có tế bào dị hình Trên 14 chi thuộc vi khuẩn

lam bao gồm cả Anabaena, Calothrix, Oscillatoria, Cyanothece, Nostoc, Synechococcus, Microcystis, Gloeobacter, Aphanocapsa, Chroococcidiopsis và Microcoleus được biết đến với khả năng sản xuất khí hydrogen trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau Anabaena spp có thể sản xuất một lượng đáng kể hydrogen Các tế bào Anabaena cylindrica thiếu nitrogen sản xuất lượng hydrogen cao nhất

(30 mLH2/L/giờ) Gloeocapsa alpicola tăng sản xuất hydrogen khi thiếu lưu huỳnh trong khi S platensis có thể sản xuất hydrogen trong điều kiện tối hoàn toàn [24].

Sản xuất ethanol

Ethanol được sản xuất từ các nguồn tài nguyên năng lượng tái tạo là mộtnguồn năng lượng hấp dẫn, do thực tế nó có thể được trộn với diesel hiện có vàđược sử dụng mà không cần có bất kì sự sửa đổi nào của các động cơ diesel Hiệnnay, ethanol sinh học được sản xuất bởi sự lên men của cây trồng nông nghiệp, chủyếu là mía ở Brazil hoặc ngô ở Mỹ Do sản xuất quy mô lớn từ cây trồng nôngnghiệp, nó vẫn còn là một lựa chọn gây tranh cãi với nhiên liệu hóa thạch bởi tácđộng tiêu cực của nó lên nguồn lương thực Lợi thế mà vi khuẩn lam có được hơncác loại cây trồng năng lượng truyền thống trong sản xuất ethanol là chúng lên men

tự nhiên mà không cần bổ sung môi trường lên men Đặc trưng này làm cho vikhuẩn lam là một ứng cử viên đầy hứa hẹn cho việc sản xuất ethanol [41], [73]

Để nghiên cứu khả năng lên men của vi khuẩn lam, Heyer và cs kiểm tra 37chủng và phân tích khả năng lên men của chúng cùng các sản phẩm tiết của lênmen Trong số 37 chủng được nghiên cứu, nhận thấy có 16 chủng có thể sản xuấtethanol là một trong những sản phẩm lên men, trong khi số lượng đáng kể ethanol

được sản xuất trong hai chủng Oscillatoria (> 10 mmol / mẫu) Quá trình lên men

diễn ra trong điều kiện tối khi không có oxygen quang hợp, do đó không bao gồmquá trình hô hấp sản xuất năng lượng [37].

Sản xuất biodiesel (xem mục 1.2.3.1)

Sản xuất methane

Sinh khối tế bào có thể được chuyển thành CH4 trong điều kiện thiếu oxy quamột quá trình được gọi là hô hấp kỵ khí Sau khi khai thác lipid từ sinh khối vikhuẩn lam, vật liệu còn có thể được chuyển đổi thành CH4 bởi quá trình này nângcao tổng năng lượng thu hồi Điều này sẽ dẫn đến một sự cân bằng năng lượngthuận lợi hay tích cực hơn của việc sản xuất nhiên liệu sinh học tổng thể từ vi khuẩnlam, mà cũng có thể làm giảm tổng chi phí của quá trình sản xuất năng lượng sinhhọc [89]

Tuy nhiên, ngoài các ứng dụng quan trọng trên, một số vi khuẩn lam còn cókhả năng gây hiện tượng nở hoa nước trong một số thủy vực nước ngọt gây mấtcảnh quan, ô nhiễm môi trường do sự phân hũy của chúng khi chết Một số loài còn

có khả năng sinh độc tố Độc tố của vi khuẩn lam có thể gây chết động vật và ảnhhưởng đến sức khỏe con người [16]

1.1.3 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lam

Một số các yếu tố môi trường đã được chứng minh có ảnh hưởng đến sự pháttriển của tế bào vi khuẩn lam Hiệu quả của các các thông số môi trường có thể khácnhau đáng kể giữa các loài do vi khuẩn lam có môi trường sống tự nhiên đa dạng.Tuy nhiên, nói chung tốc độ tăng trưởng đã thể hiện có nhiều sự tương quan vớimột vài yếu tố Chúng bao gồm ánh sáng, nhiệt độ, pH, điều kiện chất dinh dưỡngnhư nồng độ nitrate và phosphate, oxygen hòa tan, nồng độ sắt và độ mặn của môitrường xung quanh

1.1.3.1 Ánh sáng

Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự phát triển của vi khuẩn lam đã được nghiêncứu rộng rãi Tốc độ tăng trưởng tương quan với cường độ ánh sáng Chiếu sáng 16giờ sáng: 8 giờ tối không cho năng suất tốt hơn so với chiếu sáng liên tục và vikhuẩn lam đã không yêu cầu thay đổi luân phiên ngày đêm của chu kỳ sáng

tối để đạt được một tốc độ tăng trưởng tối ưu Thành phần quang phổ của ánh sángkhông quan trọng cho tăng trưởng, nhưng nó có thể có tác dụng nổi bật trên sắc tố

và sản xuất các độc tố [25]

1.1.3.2 Nhiệt độ

Nhiệt độ của môi trường nuôi cấy cũng đã được chứng minh có ảnh hưởngđến tốc độ sinh trưởng và năng suất sinh khối của vi khuẩn lam Phạm vi nhiệt độthích hợp cho sự sinh trưởng phụ thuộc vào từng loài Sự đa dạng này được minhhọa bằng những loài sống ở nhiệt độ lên đến 73°C và không thể tồn tại ở nhiệt độ

dưới 50°C, chẳng hạn như vi khuẩn lam ưa nhiệt Synechococcus Các loài khác

thích nghi với nhiệt độ thấp, chẳng hạn như những loài sinh sôi nảy nở ở Bắc Cực

và Nam Cực Nói chung, vi khuẩn lam phù du sống ở khu vực ôn đới nhiệt độ từ15°C đến 35°C cho sinh trưởng tối ưu [25], [51], [64]

1.1.3.3 Các chất dinh dưỡng

Hàm lượng dinh dưỡng của môi trường tự nhiên xung quanh hoặc môitrường nuôi cấy tương quan với tốc độ tăng trưởng và sự gia tăng sinh khối của vikhuẩn lam Mỗi loài có một hàm lượng dinh dưỡng tối ưu, phần lớn các nghiên cứutham gia vào điều tra những ảnh hưởng của các biến đổi ở nồng độ nitrate vàphosphate, hai nguyên nhân quan trọng gây ra hiện tượng nở hoa nước Loài nàycũng thường có một tỉ lệ N: P tăng trưởng tối ưu [64]

Nitrate

Để dự đoán ảnh hưởng của nồng độ nitrate lên vi khuẩn lam, dựa vào đặcđiểm một số loài có khả năng cố định nitrogen, trong khi các loài khác thiếu khả

năng này M aeruginosa là một loài không cố định nitrogen Nghiên cứu cho thấy,

hàm lượng nitrogen cao trong môi trường nuôi cấy làm tăng sự phát triển của vi

khuẩn lam như Oscillatoria (không có tế bào dị hình) [92] Tuy nhiên, Anabaena là

một loài cố định nitrogen, khi nuôi cấy trong môi trường nitrate biến đổi thấy không

có sự khác biệt đáng kể trong sản xuất sinh khối Thiếu dinh dưỡng với việc giảmnitrate cũng được đánh giá làm giảm sản xuất sinh khối [44]

Tăng trưởng đã được thể hiện tương quan tích cực với nồng độ phosphatecủa môi trường xung quanh [67]

Điều kiện thiếu phosphorus dẫn đến sự suy giảm trong sản xuất sinh khối của

M aeruginosa [101] Điều này cho thấy rằng nồng độ của phosphorus môi trường là

yếu tố quan trọng trong sự phát triển của vi khuẩn lam

1.1.3.4 Các yếu tố khác

Bên cạnh các yếu tố nêu trên, đến nay các thông số khác cũng đã được chứngminh ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi khuẩn lam Vi khuẩn lam ưa môi trườngkiềm Độ mặn là yếu tố cụ thể với một số loài được tìm thấy ở biển, cửa sông và

môi trường nước ngọt Một trong những ví dụ là Nodularia spumigena, đòi hỏi tăng

nồng độ natri clorua trong môi trường nuôi cấy để phát triển tốt Chúng phát triển ởnước mặn tốt hơn so với nước ngọt, nhưng thấp hơn so với nước biển Bên cạnh độ

pH và độ mặn, nồng độ sắt, oxygen hoà tan, sự khuấy sục và sự hiện diện của vikhuẩn dị dưỡng khác cũng có thể đóng một vai trò quan trọng trong sản xuất sinhkhối [12], [100]

1.2 LIPID Ở VI KHUẨN LAM

Các thành phần chính của các tế bào tảo là các protein, carbohydrate và lipid[10] Trong đó, lipid là nguồn năng lượng dự trữ hiệu quả nhất Lipid có vai trò nhưchất cách điện của các cơ quan và hoormon, đồng thời là thành phần cấu trúc củahầu hết các màng tế bào Nó cũng có vai trò quan trọng đối với khả năng chịu stresssinh lí của các vi sinh vật bao gồm vi khuẩn lam [91]

Hình 1.3 Lipid ở vi khuẩn lam (theo Nichols B W., 1970) [57]

Triacylglycerol (TAG) là chất béo dự trữ phổ biến nhất và có thể tạo thành80% lipid tổng số của vi khuẩn lam Chúng bao gồm một phân tử glycerol liên kếtvới ba acid béo, hoặc hai acid béo với vị trí thứ ba là nhóm phosphate(phospholipid) hoặc carbohydrate (glycolipid) Acid béo bao gồm một chuỗi carbondài không phân nhánh Bên cạnh đó có các lipid trung tính khác nhưsulphoquinovosyl diglyceride, monogalactosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride

Bảng 1.1.Thành phần các acid béo trong vi khuẩn lam [91]

14:0 -carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng 40

16:0 -carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng 60

17:1 -carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng 10

18:0 -carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng 30

và do đó thường xảy ra ở điều kiện sinh trưởng giảm [74]

1.2.3 Ứng dụng của lipid vi khuẩn lam

1.2.3.1 Sản xuất biodiesel

Nhiên liệu sinh học là nguồn nhiên liệu tái tạo hấp dẫn cho các động cơdiesel, được sản xuất nhờ quá trình chuyển vị ester một mono alcoholic, trong đócác chất béo trung tính phản ứng với một mono-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năngalcohol (thường là methanol hoặcethanol) với xúc tác của các enzyme [35], [45]

Nhiên liệu sinh học thường được sản xuất từ các loại cây có dầu như hạt cảidầu, đậu tương, hướng dương và cọ Tuy nhiên, hạn chế lớn của các cây này làchúng cạnh tranh với các nguồn thực phẩm của chúng ta về đất nông nghiệp và

nước [65] Vi tảo được đề xuất là ứng cử viên tiềm năng cho sản xuất nhiên liệusinh học bởi một số lí do:

Vi tảo có hiệu suất dầu cao nhất trong số các cây trồng lấy dầu đa dạng khác

Có thể trồng được vi tảo một cách dễ dàng trong nước biển, nước lợ và đấtkhông canh tác Chúng không cạnh tranh với các nguồn tài nguyên nông nghiệptruyền thống Vi tảo canh tác không cần thuốc diệt cỏ hoặc thuốc trừ sâu

Vi tảo phát triển rất nhanh chóng và nhiều loài tảo có lượng dầu phong phú.Mức dầu 20 – 50% là phổ biến ở vi tảo Trong điều kiện phòng thí nghiệm, lượngdầu lí tưởng có thể đạt 56 – 60% tổng sinh khối khô bằng kỹ thuật di truyền hoặc kỹthuật nuôi cấy dị dưỡng [38]

Vì vậy, việc sử dụng các vi tảo có thể là một sự thay thế phù hợp vì tảo sảnxuất dầu sinh học hiệu quả nhất trên hành tinh, là một nguồn sinh khối linh hoạt và

có thể sớm trở thành một trong những cây trồng nhiên liệu tái tạo quan trọng nhấtcủa trái đất [45]

Đối với vi khuẩn lam, chúng có các thuộc tính cho phép được xem là mộttrong những nguyên liệu có triển vọng cho năng lượng sinh học: chúng chứa mộtlượng chất béo đáng kể, mức độ quang hợp và tốc độ tăng trưởng cao hơn so vớicác loài tảo khác, phát triển dễ dàng với các yêu cầu dinh dưỡng cơ bản, dó đó canhtác tương đối đơn giản và không tốn kém [65]

Bảng 1.2 Hàm lượng lipid của một số chủng vi khuẩn lam

6 -carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng79,224

Sallaln (1990) [76]Fontes (1987) [26]Becker (1994) [10]Afify (2010) [8]Miao (2006) [50]

Sự tích luỹ lipid trong vi khuẩn lam xảy ra khi cơ thể bị stress hoặc tăngtrưởng ở giai đoạn tĩnh Một lợi thế thứ hai là năng suất lipid của vi khuẩn lam cóthể được nâng cao trong môi trường nuôi cấy có sửa đổi Vì vậy, vi khuẩn lam làmột ứng cử viên tiềm năng để sản xuất nhiên liệu sinh học [73]

Tuy nhiên, đối với sản xuất năng lượng sinh học dựa trên lipid, vi khuẩn lam

đã nhận được sự quan tâm ít hơn so với các nguyên liệu khác của vi tảo và cây trồng[50] Năm 1998, 3000 loài đã được nghiên cứu trong Chương trình Chất lượng Thuỷsản ở nước Mỹ với mục đích xác định các loài có hàm lượng lipid cao Trong chươngtrình này ít thông tin về vi khuẩn lam được cung cấp khi chúng không tích luỹ đượclipid với hàm lượng cao Tuy nhiên vi khuẩn lam có tốc độ tăng trưởng nhanh nhất vànăng suất lipid cao nhất trong môi trường nuôi cấy tăng trưởng theo cấp số nhân [86]

Spirulina cũng được lựa chọn sử dụng nhiều nhất trong chế biến các nguyên liệu

lỏng [82]

Mặt khác, một so sánh gần đây trong các chủng vi tảo khác nhau cho thấymặc dù vi khuẩn lam sở hữu năng suất sinh khối cao nhất nhưng nó chỉ chứa hàmlượng lipid thấp, điều này chứng tỏ sự tiêu tốn cao trong quá trình tổng hợp lipid.Khoảng 2.000 loài vi khuẩn lam đã được xác định nhưng thông tin liên quan đếnsản xuất nhiên liệu sinh học từ các loài này hoặc các thông số liên quan như đặcđiểm sinh hoá, tốc độ tăng trưởng và năng lượng của các loài khác nhau đang còn ít[28], [50], [86]

Để chọn ra loài phù hợp để sản xuất quy mô lớn, một loạt các sửa đổi quantrọng về hàm lượng lipid, năng suất, tốc độ tăng trưởng là chìa khoá để sản xuấtnhiên liệu sinh học [31]

1.2.3.2 Nguồn thực phẩm có giá trị cho người và động vật

Vi khuẩn lam có thể chứa một lượng lipid (chất béo và dầu) đáng kể với các sảnphẩm tương tự như các loại dầu thực vật Các chất béo của một số loài vi khuẩn lamcũng rất giàu acid béo thiết yếu như C18 linoleic (18:02ω6) và y-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức nănglinolenic (18:03ω3)

và các dẫn xuất của acid C20, acid eicosapentaenoic (20:05ω3) và acid arachidonic(20:04ω6) Những acid béo là thành phần thiết yếu của chế độ ăn uống của conngười và động vật, đồng thời trở thành thức ăn phụ gia quan trọng trong nuôi trồngthủy sản [13]

1.2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tích lũy lipid của vi tảo

Vi tảo có khả năng tồn tại trong những điều kiện đa dạng và khắc nghiệt, đôikhi lipid tế bào thu được bất thường từ những vi tảo này [79] Hơn nữa, một số vitảo này cũng có thể thay đổi chuyển hóa lipid hiệu quả để đáp ứng với những thayđổi trong điều kiện môi trường [96]

Hình 1.4 Cảm ứng lipid ở tảo dưới các điều kiện stress

(theo Sharma K., 2012) [84]

Trong điều kiện phát triển tốt nhất, một lượng lớn sinh khối tảo được sảnxuất nhưng với hàm lượng lipid tương đối thấp, trong đó chiếm khoảng 5-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng20% khốilượng khô tế bào Về cơ bản, sinh khối vi tảo và TAG cạnh tranh đồng hóa quanghợp và lập trình lại các con đường sinh lý cần thiết để kích thích quá trình sinh tổnghợp lipid Trong điều kiện không thuận lợi hay stress môi trường, nhiều vi tảo làmthay đổi con đường sinh tổng hợp lipid của chúng đối với sự hình thành và tích lũylipid (20-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng50% khối lượng khô), chủ yếu trong các TAG, tạo điều kiện để vi tảo cóthể chịu đựng những thay đổi của môi trường (hình 1.4) [84]

Các điều kiện stress gây cảm ứng lipid:

• Giới hạn các chất dinh dưỡng

• Nhiệt độ thay đổi (thấp, cao)

Có nhiều nghiên cứu được thực hiện trên kỹ thuật cảm ứng lipid trong vi tảonhư sử dụng stress chất dinh dưỡng, bao gồm thiếu nitrogen và / hoặc phosphorus,ánh sáng, pH, nhiệt độ, kim loại nặng và các hóa chất khác.

1.2.4.1 Dinh dưỡng

Lượng dinh dưỡng có tác động đáng kể đến tăng trưởng của vi tảo và ảnhhưởng mạnh mẽ đến thành phần lipid của chúng Điều kiện môi trường stress khicác chất dinh dưỡng được giới hạn luôn làm cho tỷ lệ phân chia tế bào giảm mạnh.Tuy nhiên, hoạt động sinh tổng hợp các acid béo vẫn được duy trì trong một số loàitảo trong điều kiện như vậy, miễn là có đủ ánh sáng và CO2 cho quang hợp [96]

Nitrogen là chất dinh dưỡng quan trọng nhất ảnh hưởng đến chuyển hóa lipidtrong tảo Nhiều nghiên cứu cho thấy, sự sinh tổng hợp và tích lũy lipid gia tăngtrong điều kiện giới hạn nitrogen Ngược lại với lipid phân cực trong điều kiện đủnitrogen, lipid trung tính ở dạng TAG là thành phần ưu thế của lipid trong tế bàothiếu nitrogen [84]

1.2.4.2 Ánh sáng

Ánh sáng là yếu tố quan trọng nhất cho quang hợp, không có ánh sáng đờisống tự dưỡng không thể duy trì hoặc phát triển Nhiều nghiên cứu cho thấy, vitảo phát triển ở điều kiện cường độ ánh sáng khác nhau sẽ có những thay đổiđáng kể trong thành phần hóa học, hàm lượng sắc tố và hoạt động quang hợp[71] Hơn nữa, cường độ và bước sóng ánh sáng khác nhau đã được báo cáo làmthay đổi sự trao đổi lipid dẫn tới sự thay đổi trong thành phần lipid vi tảo Cường

độ ánh sáng cao dẫn đến oxy hóa gây thiệt hại đến hàm lượng acid béo không no,nhưng cũng cần thiết cho sự tổng hợp của C16:1 và làm thay đổi nồng độ acidbéo trong vi tảo [36]

Thông thường, cường độ ánh sáng thấp dẫn đến sự hình thành chất béo phâncực, đặc biệt là lipid phân cực trên màng liên kết với lục lạp, trong khi cường độánh sáng cao làm giảm hàm lượng lipid phân cực tổng số với một sự gia tăng đồngthời số lượng chất béo trung tính, chủ yếu là TAG [59]

1.2.4.3 Nhiệt độ

Nhiệt độ đã được chứng minh có ảnh hưởng lớn đến thành phần acid béo của

vi tảo Một xu hướng chung theo hướng tăng acid béo bất bão hòa với nhiệt độ giảm

và tăng acid béo bão hòa với nhiệt độ ngày càng tăng đã được quan sát thấy ở nhiều

vi tảo và vi khuẩn lam [70], [78]

Thường được chấp nhận rằng, nhiều thay đổi trong cấu trúc lipid làm thayđổi tính chất vật lý của màng tế bào để đảm bảo các chức năng bình thường (ví dụ

độ thấm ion, quá trình quang hợp và hô hấp) có thể vẫn tiếp tục được giữ nguyên

Sự thay đổi thường thấy nhất của lipid màng sau sự thay đổi nhiệt độ là một sự thayđổi trong acid béo bất bão hòa [93]

1.2.4.4 pH

Biến động của độ pH trong môi trường cũng đã được cho thấy để thay đổi thànhphần lipid của vi tảo Dựa trên những quan sát hình thái học, pH kiềm đã ức chế sựtăng trưởng của vi tảo, do đó chuyển hướng năng lượng để tạo thành TAG [32]

1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU THĂM DÒ VỀ LIPID VI KHUẨN LAM VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN LIPID Ở VI KHUẨN LAM

1.3.1 Các nghiên cứu thăm dò hàm lượng lipid các chủng vi khuẩn lam

Năm 1990, Sallal và cs đã tiến hành nghiên cứu lipid và thành phần acid béocủa một số loài vi khuẩn lam nước ngọt Nuôi ở nhiệt độ 28oC, môi trường BG–11, ánhsáng đèn huỳnh quang với cường độ 3500 lux Thu sinh khối bằng phương pháp lytâm, lipid được chiết bằng dung môi 2-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năngpropanol/chlorofom (1: 2, v/v) Kết quả cho

thấy bốn loài vi khuẩn lam nước ngọt (Anabaena cylindrica, Anacystis nidulans, Nostoc canilta and Nostoc muscorum) có hàm lượng lipid tổng số dao động trong

khoảng 10,7 -carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng 12,3% khối lượng khô [76]

Nagarkar và cs (2004) báo cáo về thành phần hoá học và giá trị nhiệt lượngtương ứng của 13 loài vi khuẩn lam (họ không báo cáo về hàm lượng lipid) Họnhận thấy rằng các giá trị nhiệt lượng khác nhau trong khoảng 15–35kJ 10g-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng1 dw,

trong đó Spirulina và Phormidium cho giá trị cao hơn [55].

Griffiths và cs (2009) thu thập dữ liệu về sản xuất diesel sinh học của 55 loài

vi tảo Trong đó, Synechococus với sản lượng lipid 75mg/L mỗi ngày là một trong

những chủng có năng suất cao nhất [31]

Bảng 1.3 Hàm lượng lipid tổng số của một số chủng vi khuẩn lam

tra với các chi Oscillatoria, Microcystis, Nostoc… Kết quả xác định được các

chủng vi khuẩn lam chứa một hàm lượng lipid từ 10,55 – 28,15%, trong đó

Microcystis aeruginosa có hàm lượng lipid cao nhất (bảng 1.3) [83].

1.3.2 Các nghiên cứu điều kiện môi trường để gia tăng hàm lượng lipid

1.3.2.1 Ảnh hưởng của thiếu dinh dưỡng

Nguồn và nồng độ nitrogen trong môi trường sinh trưởng ảnh hưởng rấtnhiều đến năng suất lipid vi tảo Bên cạnh đó, việc gây thiếu nitrogen dễ dàng đểthao tác và giá rẻ Vì vậy đây là phương pháp được nhiều nhà khoa học nghiên cứutrên nhiều đối tượng nhằm gia tăng hàm lượng lipid

Năm 1987, de Loura và cs đã nghiên cứu ảnh hưởng của thiếu nitrogen lên

hàm lượng lipid ở 2 chủng Pseudanabaena sp và Oscillatoria splendida được nuôi

trong môi trường Z8, nhiệt độ 25oC, chiếu sáng 12/24, pH 6,8 Kết quả cho thấy, tráingược với những gì xảy ra trong thực vật bậc cao và tảo eukaryotic, sự thiếunitrogen trong quá trình tăng trưởng gây ra một sự thay đổi trong thành phần sắc tốnhưng không có thay đổi đáng kể trong lipid tổng số và thành phần acid béo của hai

chủng vi khuẩn lam Pseudanabaena sp và Oscillatoria splendida Thiếu nitrogen

không ảnh hưởng đến hàm lượng chlorophyll a, nhưng nó gây ra sự mất mátphycobiliprotein, tăng hàm lượng carotenoid, giảm phycocyanin [22]

Uslu (2011) đã nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện thiếu 50% và 100%

nitrogen đối với hàm lượng lipid của tế bào Spirulina platensis trong điều kiện phòng thí nghiệm S platensis được nuôi cấy trong môi trường Z8 và giữ ở nhiệt độ

phòng 26 ± 1oC, chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang với bức xạ 80 μmol mmol m-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng2 s-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng1 và sục

khí liên tục Sinh khối Spirulina thu hoạch ở giai đoạn tĩnh nhận được 5,78; 13,66;

17,05% lipid tương ứng các môi trường đối chứng, (-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng)50% N, (-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng)100% N Hàmlượng lipid cao nhất với 1,00g/L khối lượng khô nhận được từ môi trường nuôi cấy(-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng)100% N [99]

1.3.2.2 Ảnh hưởng của ánh sáng

Năm 1988, Alhasan và cs đã nghiên cứu hiệu quả của ánh sáng và ủ tối lên

lipid của năm loài vi khuẩn lam biển: Anabaena constricta (chủng KCCA/C l00), Phormidium corium (KCCA/C200), Phormidium jenkelianum (KCCA/C210), Spirulina subsalsa (KCCA/C300) và Synechocystis sp (KCCA/C400) Chúng được

nuôi cấy ở điều kiện ánh sáng 1500lux, nhiệt độ 38oC, pH 6,8 Một lô được nuôi ởđiều kiện chiếu sáng liên tục 7 ngày và sau đó ủ tối 7 ngày, còn một lô nuôi ở điều

kiện chiếu sáng liên tục 14 ngày Kết quả cho thấy, hàm lượng lipid tổng số A constricta và P jenkelianum giảm trong bóng tối, trong khi đó của ba chủng vi

khuẩn lam còn lại là tương đối ít bị ảnh hưởng [9]

Theo Tedesco (1989), hàm lượng lipid tổng số và acid béo của Spirulina platensis UTEX 1928 là 7,2 và 2,2% khối lượng khô tế bào dưới điều kiện kiểm soát

tốc độ tăng trưởng cao Với sự gia tăng bức xạ từ 170 -carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng 870 mmol photon m -carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng2 s -carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng1 ,tốc độ tăng trưởng tăng, lipid tổng số giảm, còn thành phần acid béo không bịảnh hưởng Với bức xạ 1411 mmol photon m -carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng2 s-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng1, lipid tổng số tăng ít và thành phần

% của acid béo γ-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức nănglinolenic tăng lên Tăng trưởng và hàm lượng lipid tổng số của

S platensis đã bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi nhiệt độ tăng trưởng từ 25 -carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng 38 °C Vớitốc độ tăng trưởng tăng lên, hàm lượng lipid tổng số tăng [95]

Sallal và cs (1990) khi nghiên cứu lipid và thành phần acid béo của một số loài

vi khuẩn lam nước ngọt (Anabaena cylindrica, Anacystis nidulans, Nostoc canilta and Nostoc muscorum), ông bố trí một lô nuôi dưới ánh sáng 7 ngày, sau đó ủ tối 7

ngày; một lô khác duy trì ánh sáng liên tục trong 14 ngày Kết quả cho thấy, không có

sự khác biệt rõ ràng trong hàm lượng lipid giữa môi trường nuôi cấy chiếu sáng và ủtối của bốn loài vi khuẩn lam [76]

Năm 2001, Olguinvàcs tiến hành thực hiện đánh giá về hiệu quả của cường độ

ánh sáng thấp lên sự tăng trưởng và thành phần hóa học của Spirulina sp trong môi

trường nuôi cấy phức tạp có chứa nước biển bổ sung với nước thải từ chất thải củalợn Nuôi cấy thực hiện ở ánh sáng có bức xạ 66 mmol photon m-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng2s-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng1 (thấp) và 144mmol photon m-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng2s-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng1 (cao) Khối lượng khô được xác định sau 12 ngày nuôi cấy Kếtquả cho thấy, khi môi trường nuôi cấy phức tạp được tiếp xúc với cường độ ánh sángthấp đã làm giàu lipid tổng số (28,6%) hơn so với cường độ ánh sáng cao (18%) [58]

Sự thay đổi của thành phần acid béo với nhiệt độ tăng trưởng cũng được Fork

và cs (1979) nghiên cứu Khi nhiệt độ tăng trưởng giảm xuống từ 55 đến 38oC, lượngacid béo bão hòa 18:00, các chất béo tích điện âm sulfoquinovosyl diglyceride vàphosphatidyl glycerol giảm trong khi các acid béo bất bão hòa 18:01 và 16:01 tăng.Trong mono và diglyceride digalactosyl các acid béo bão hòa 18:00 và 16:00 giảm,acid béo không bão hòa 16:01 tăng Nói chung, có sự gia tăng của các chất béo lỏngtrong tất cả các lớp lipid khi các tế bào được phát triển ở nhiệt độ thấp hơn [27]

1.3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Những biến đổi của hàm lượng lipid sau khi có sự thay đổi của nhiệt độ tăng

trưởng đã được Sato và cs (1980) nghiên cứu ở vi khuẩn lam Anabaena variabilis.

Trong 10h đầu sau khi có sự thay đổi nhiệt độ từ 22 -carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng 38 ºC, tổng hợp lipid bị ức chế

rõ rệt Trong những giờ sau lipid được tổng hợp trở lại Trong 5h đầu tiên sau khithay đổi nhiệt độ tăng trưởng từ 22 -carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng 38 ºC, tổng hợp lipid kích thích đáng kể [77]

Ảnh hưởng của nhiệt độ từ 10°C -carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng 35°C lên hàm lượng lipid tổng số của các

loài vi tảo biển nhiệt đới Isochrysis sp, Nitzschia closterium, N paleacea và Tahitian Isochrysis sp đã được Renaud (1995) điều tra N paleacea sản xuất lượng

lipid cao nhất ở 10°C, trong khi các loài khác đã sản xuất một lượng tối đa lipid ở20°C [69]

1.3.2.4 Ảnh hưởng phương pháp chiết xuất

Năm 2008, Chaiklahan và cs đã nghiên cứu chiết xuất lipid từ Spirulina thực

hiện ở 30OC Kết quả cho thấy, với tỉ lệ mẫu: dung môi là 1:10 và thời gian chiếtxuất 120 phút cho năng suất acid béo tổng số cao nhất Việc tăng nhiệt độ trongchiết xuất dẫn đến sản lượng lipid và hàm lượng acid béo tổng số cao hơn Tăngnhiệt độ từ 30oC – 60oC, giảm thời gian chiết xuất làm tăng hàm lượng lipid và acid

béo tổng số lần lượt khoảng 69% và 55% Lipid chiết xuất từ Spirulina có khoảng 25% acid linoleic và 18% acid γ-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức nănglinolenic [19].

Năm 1998, Reis A và cộng sự đã nghiên cứu về ảnh hưởng của một số phươngpháp chiết xuất lên hàm lượng lipid và thành phần acid béo tổng số từ sinh khối cực

đại của Arthrospira (Spirulina) Năm hỗn hợp dung môi (hexane, ethanol (100%),

acetone, ethanol (96%) / hexane 0.9:1 v / v và ethanol (96%) / hexane 2.5:1 v / v) đãđược sử dụng Kết quả tốt nhất thu được với ethanol (73% lipid tổng số) [68]

Ở Việt Nam, các nghiên cứu cho thấy thành phần loài của vi khuẩn lam rất

đa dạng và phong phú Theo Dương Đức Tiến (2001), Việt Nam có khoảng 300 loài

vi khuẩn lam [3] Nguyễn Thị Thu Liên (2007) cũng đã nghiên cứu xác định được

33 loài vi khuẩn lam nước ngọt trong các thủy vực nước ngọt Thừa Thiên Huế [56].Bên cạnh đó còn có các nghiên cứu tập trung vào thăm dò khả năng sinh độc tố của

vi khuẩn lam [2] Tuy nhiên, chưa thấy báo cáo nào công bố về nghiên cứu vi khuẩnlam nhằm mục đích sản xuất nhiên liệu sinh học

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Một số chủng vi khuẩn lam được phân lập ở các thủy vực nước ngọt ViệtNam, được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Đại học Khoa học,Đại học Huế Danh sách và hình ảnh các chủng vi khuẩn lam nghiên cứu được trìnhbày trong bảng 2.1 và hình 2

Bảng 2.1 Các chủng vi khuẩn lam nghiên cứu

M aeruginosa ĐA Ma1 Đức An, Gia Lai

ĐA Ma2 Đức An, Gia Lai

BH Ma1 Biển Hồ, Gia Lai

BHB Ma2 Biển Hồ B, Gia Lai

HK Ma2 Hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội

M wesenbergii HK Mw1 Hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội

HK Mw2 Hồ Hoàn Kiếm, Hà nội

ĐA Mw Đức An, Gia Lai

M botrys HK Mb1 Cửa Ngăn, TT Huế

CN Mb1 Cửa Ngăn, TT Huế

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 2 đến tháng 9 năm 2012

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, khoaSinh học, trường Đại học Khoa học, Đại học Huế

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Điều kiện nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy Z8 (bảng 2.2) [43]

Hình 2.1 Hình thái các chủng vi khuẩn lam nghiên cứu

1 ĐA Ma1, 2 ĐA Ma2,3 BH Ma1, 4 BHB Ma2, 5 HKMa2,

6 ĐA Mw, 7 HK Mw2 , 8 HK Mw1, 9 CN Mb1, 10 HK Mb1

Bảng 2.2 Công thức môi trường Z8 (theo Kotail, 1971) [43]

Dung dịch Stock I

Ca(NO3)2.4H2O 5,9Dung dịch Stock II K2HPONa 4.3H2O 4,1

Na2WO4.2H2O 0,33(NH4)6Mo7O24.H2O 0,88

3

0

NiSO4(NH4)2SO4.6H2O 1,98Cr(NO3)3.9H2O 0,41

KAl(SO4)2.12H2O 4,74

Cách pha môi trường Z8:

-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng Stock I (100mL) = 1mL MgSO4 3H2O + 1mL NaNO3 + 1mLCa(NO3)2.4H2O + 97 mL nước cất

-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng Stock II (100mL) = 1mL K2HPO4.3H2O + 1mL + 98 mL nước cất

-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng Stock III (100mL) = 1mL FeCl3 + 1mL EDTA + 98mL nước cất

-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng Vi lượng Z8: Các dung dịch V2O5 và H3BO3 lấy 10mL, các dung dịch cònlại lấy 1mL rồi bổ sung nước cất cho đủ 1L

Môi trường Z8 (1L) = 10mL Stock I + 10mL Stock II + 10ml Stock III + 1mLdung dịch vi lượng + 969mL nước cất

Môi trường được khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 15 phút

Nhiệt độ phòng nuôi 22 -carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng 25oC, ánh sáng đèn huỳnh quang 1500 – 2000 lux,

pH 7,2 [88 ]

2.2.2 Các phương pháp xác định điều kiện môi trường nuôi cấy

Nhiệt độ được điều chỉnh bằng máy điều hòa nhiệt độ Toshiba – Nhật Bản

pH được đo bằng máy Sension 3 – Hach – Mỹ

Cường độ ánh sáng được đo bằng Lux kế HI 97500 luxmeter – HANNA -carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng Italy

2.2.3 Phương pháp nhân sinh khối

Nhân giống cấp 1 với thể tích môi trường 200 mL trong bình kín dung tích

500 mL Sau 7 ngày, sử dụng giống cấp 1 để nhân giống cấp 2 trong thùng xốpdung tích 20 L với thể tích môi trường 15 L Mật độ ban đầu giống nhau là 4.104 tếbào/mL Thực hiện khuấy đảo hằng ngày Khi tảo sinh trưởng cực đại, tiến hành thusinh khối và chiết lipid

Trong quá trình nhân sinh khối, kiểm tra sự tạp nhiễm của giống trước khi

tiến hành nhân giống và trước khi thu sinh khối bằng cách quan sát mẫu dưới kínhhiển vi.

2.2.4 Phương pháp xác định mật độ tế bào

Số lượng tế bào vi khuẩn lam trong một thể tích nước được xác định bằngcách sử dụng buồng đếm Sedgewick Rafter có dung tích 1mL với 1000 ô đếm Mẫuđược đếm dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại x 100

Đếm 5 ô ( 4 góc 4 ô và 1 ô ở giữa) của buồng đếm Tính số tế bào trung bìnhcủa mỗi ô

Nếu a là số lượng tế bào vi khuẩn lam trung bình của mỗi ô thì số lượng tếbào (X) trong 1mL là: X = a x 1000 (tế bào)

2.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng lipid

Sử dụng phương pháp Soxhlet để tách chiết lipid Đây là phương pháp táchchiết lipid hiệu quả nhất theo Gutierrez-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năngWing [30]

Tiến hành thu sinh khối vi khuẩn lam bằng phương pháp để lắng và li tâmvới tốc độ 8500 vòng/ phút trong 5 phút [103] Cho mẫu thu được vào giấy lọc (đãđược sấy khô và xác định trọng lượng, tối thiểu 1g), sấy ở nhiệt độ 65oC đến khốilượng không đổi Sau đó đặt túi giấy lọc có chứa mẫu vào hệ thống Soxhlet, cho vàodung môi methanol: chloroform với tỉ lệ 1: 2 Đặt hệ thống chiết lên bếp cách thuỷ vàchiết Đến khi trích ly hoàn toàn lipid, tiến hành thu mẫu, sấy khô và xác định trọnglượng [33]

Hàm lượng lipid tổng số được tính theo công thức: X =

Trong đó: X : hàm lượng lipid tổng số ( %)

a : trọng lượng giấy lọc và mẫu trước khi chiết (g)

b : trọng lượng giấy lọc và mẫu sau khi chiết (g)

c : trọng lượng mẫu lấy để phân tích lipid (g)

2.2.6 Bố trí thí nghiệm

2.2.6.1 Xây dựng đường cong sinh trưởng của các chủng nghiên cứu

Tiến hành nuôi cấy 10 chủng vi khuẩn lam trên môi trường Z8 trong bìnhtam giác dung tích 250 mL Mỗi bình cho vào 100 mL môi trường Cấy giống vào

môi trường với mật độ tế bào ban đầu giống nhau là 4.104 tế bào/mL Xác định mật

độ tế bào sau 2, 4, 6 ngày nuôi cấy để xây dựng đường cong sinh trưởng

2.2.6.2 Thăm dò hàm lượng lipid của các chủng vi khuẩn lam

Sử dụng môi trường Z8, chiếu sáng với chu kì 12h sáng: 12h tối

Nhân giống cấp 1 trong chai thủy tinh dung tích 500 mL, mỗi chai cho vào

200 mL môi trường Z8, hấp khử trùng môi trường Cấy giống vào môi trường vớimật độ ban đầu là 4.104 tế bào/mL, thao tác trong tủ cấy vô trùng

Nhân giống cấp 2 trong thùng xốp dung tích 20 mL Chuẩn bị môi trườngtrong chai thủy tinh dung tích 500 mL để hấp khử trùng môi trường Sau đó chuyểnmôi trường đã được khử trùng qua thùng xốp để nhân giống cấp 2, mật độ ban đầu

là 4.104 tế bào/mL, thao tác trong phòng nuôi vô trùng

2.2.6.3 Khảo sát sự sinh trưởng của một số chủng vi khuẩn lam trong các điều kiện môi trường khác nhau

Tuyển chọn 4 chủng vi khuẩn lam có hàm lượng lipid cao Tiến hành khảosát sự sinh trưởng trong bình tam giác dung tích 250 mL, mỗi bình chứa 100 mLmôi trường Mỗi chủng chuẩn bị hai lô thí nghiệm với 4 công thức môi trường Z8thiếu dinh dưỡng:

-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng Môi trường thiếu 50% nitrogen ((-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng)50% N): sử dụng NaNO3 8,35g/100mL,Ca(NO3)2 2,5g/100mL trong Stock I

-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng Môi trường thiếu 100% nitrogen ((-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng)100% N): loại NaNO3 và Ca(NO3) khỏiStock I

-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng Môi trường thiếu 50% nitrogen và 50% phosphorus ((-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng)50% N (-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng)50% P): sửdụng NaNO3 8,35g/100mL, Ca(NO3)2 2,5g/100mL trong Stock I, K2HPO42,05g/100mL trong Stock II

-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng Môi trường thiếu 50% phosphorus ((-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng)50% P): sử dụng K2HPO42,05g/100mL trong Stock II

Một lô bố trí dưới điều kiện chiếu sáng 12h sáng: 12h tối (12h:12h), còn lôkia bố trí dưới điều kiện chiếu sáng 7 ngày sáng: 7 ngày tối (7d:7d)

Tiến hành xác định mật độ tế bào sau 2, 4, 6, … ngày nuôi cấy

2.2.6.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện dinh dưỡng và chiếu sáng lên hàm lượng lipid của một số chủng vi khuẩn lam

Nhân giống cấp 1 của mỗi chủng nghiên cứu trong chai thủy tinh với 200mLmôi trường

Nhân giống cấp 2 trong các thùng xốp: Mỗi chủng chuẩn bị môi trường thínghiệm giống mục 2.2.6.3 nhưng được đựng trong chai thủy tinh 500mL để hấp khửtrùng môi trường Sau đó chuyển môi trường đã được hấp khử trùng vào các thùngxốp để nhân giống cấp 2 Nuôi cấy trong thời gian 14 ngày, tiến hành thu sinh khối

và chiết lipid Bố trí các công thức thí nghiệm theo bảng 2.3

Bảng 2.3 Bố trí công thức thí nghiệm ảnh hưởng của điều kiện dinh dưỡng và

chiếu sáng đến hàm lượng lipid

12h: 12h

(-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng) 50% N I(-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng) 100% N II(-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng) 50% N, (-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng) 50% P III(-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng) 50% P IV

7 d: 7d

(-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng) 50% N V(-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng) 100% N VI(-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng) 50% N, (-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng) 50% P VII(-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng) 50% P VIII

2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu

Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Sử dụng chương trình Microsoft Excel và SPSS

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAM

Mỗi chủng vi khuẩn lam có tốc độ sinh trưởng khác nhau nên việc xây dựngđường cong sinh trưởng cho mỗi chủng có vai trò quan trọng trong nghiên cứu Đường cong sinh trưởng là cơ sở để xác định thời gian cấy chuyển, tiếp giống cũngnhư thời điểm thu sinh khối thích hợp

Trong thí nghiệm, để xây dựng đường cong sinh trưởng, chúng tôi tiến hànhnuôi cấy 10 chủng trên môi trường Z8 trong chai thủy tinh dung tích 250ml Mỗichai 100ml môi trường với mật độ tế bào ban đầu giống nhau là 4.104 tb/mL Tiếnhành đếm mật độ tế bào sau 2, 4, 6 ngày nuôi cấy Sự sinh trưởng của các chủng

vi khuẩn lam được xác định dựa vào sự gia tăng mật độ tế bào, được thể hiện ở hình3.1 và bảng 3.1 (xem thêm phụ lục 1).

Kết quả cho thấy, các chủng được nghiên cứu có tốc độ sinh trưởng khácnhau nhưng đều đạt cực đại trong khoảng thời gian từ 12–24 ngày

Các chủng ĐA Ma1, ĐA Ma2, BHB Ma2 có tốc độ sinh trưởng mạnh ở giai đoạn 8 – 10 ngày, mật độ đạt cực đại sau 12 ngày nuôi cấy Sau đó cả 3 chủng đều nhanh chóng đi vào pha tử vong (hình 3.2)

Các chủng BHMa1, Đa Mw, HK Mw1 mật độ tế bào đạt cực đại vào ngày thứ

20 BH Ma1 tăng trưởng mạnh ở ngày 12– 14, ĐA Mw ở ngày 16 – 18, còn HK

Mw1 tăng trưởng mạnh ở ngày 10 – 12 (hình 3.3)

Các chủng HK Mb1, HK Ma2 sinh trưởng khá chậm, HK Ma2 tăng trưởngmạnh ở ngày 12-carotene và xanthophyll, chúng thực hiện các chức năng14, HK Mb1 tăng trưởng mạnh ở ngày 14 – 16 , cả hai đều đạt cựcđại sau 22 ngày nuôi cấy (hình 3.4)

Các chủng CN Mb1, HK Mw2 sinh trưởng chậm, đạt cực đại sau 24 ngàynuôi cấy HK Mw2 có tốc độ tăng trưởng mạnh ở ngày 10 – 12, CN Mb1 tăngtrưởng mạnh ở ngày 14 – 16 (hình 3.5)

Hình 3.1.Hình ảnh các bình nuôi cấy các chủng vi khuẩn lam ở môi trường Z8 Bảng 3.1 Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn lam qua thời gian nuôi cấy

Mật độ tế bào (x10 4 tb /mL) Chủng Thời gian nuôi cấy (ngày)