nghiên cứu biến động một số chỉ tiêu hóa sinhcủa cây nha đam dưới tác động của mannitol trong điều kiện nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HUỲNH THỊ HỒNG TRANG NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỘNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA SINH CỦA CÂY NHA ĐAM DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA MANNITOL TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN VITRO CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ SỐ : 60. 42. 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. HOÀNG THỊ KIM HỒNG Huế, 2012 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.Các số liệu, kết quả trình bày trong đề tài là trung thực, khách quan và nghiêm túc. Những tài liệu tham khảo có nguồn gốc rõ ràng. Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tác giả luận văn HUỲNH THỊ HỒNG TRANG Trong suốt thời gian học cũng như làm luận văn em nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ của các thầy cô giáo trong khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học, Đại học Huế. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý giá đó. Đặc biệt, em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS.Hoàng Thị Kim Hồng, PGS.TS Nguyễn Hoàng Lộc đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Em xin gởi lời cảm ơn đến các anh chị tại phòng thí nghiệm Công nghệ gen và phòng Miễn dịch, Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ trong suốt thời gian học tập cho đến khi hoàn thành luận văn. Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn! Huế, tháng 9 năm 2012 Tác giả luận văn Huỳnh Thị Hồng Trang MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình Danh mục đồ thị MỞ ĐẦU 1 Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu chung về thực vật CAM 3 1.1.1. Thực vật CAM 3 1.1.2. Cơ chế chuyển hóa acid malic trong quá trình quang hợp của thực vật CAM 5 1.2. Giới thiệu chung về cây nha đam 7 1.2.1. Lịch sử phát hiện cây nha đam 7 1.2.2. Đặc điểm sinh học của cây nha đam 8 1.2.3. Thành phần hóa học cây nha đam 9 1.3. Nhân giống in vitro 9 1.3.1. Thuật ngữ nhân giống in vitro 9 1.3.2. Lược sử phát triển của nhân giống in vitro 10 1.3.3. Nhân nhanh cây con in vitro 14 1.4. Đặc tính chịu hạn của thực vật 15 1.4.1. Cơ sở sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn của thực vật 15 1.4.2. Ảnh hưởng của mannitol lên nuôi cấy mô tế bào thực vật 17 1.5. Tổng quan về một số thành phần hóa sinh 18 1.5.1. Tổng quan về tinh bột 18 1.5.2. Tổng quan về acid oxaloacetic (OAA) 19 1.5.3. Tổng quan về acid pyruvic 20 1.5.4. Tổng quan về mannitol 20 1.6. Tổng quan về protein và kỹ thuật điện di SDS-PAGE 21 1.6.1. Khái quát về protein 21 1.6.2. Giới thiệu về kỹ thuật điện di 22 Chƣơng 2 . ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Đối tượng nghiên cứu 24 2.2. Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro 24 2.2.1.1. Kiểm tra môi trường tối ưu 24 2.2.1.2. Kỹ thuật nhân nhanh từ cây tái sinh 25 2.2.1.3. Xử lý stress nước cho cây con in vitro và thu mẫu 25 2.2.2. Xác định tốc độ sinh trưởng tương đối 26 2.2.3. Xác định hàm lượng nước bằng phương pháp sấy khô mẫu 26 2.2.4. Xác định cường độ quang hợp bằng máy đo cường độ quang hợp Ciras-2 Portable hệ thống quang hợp của hãng Licor - Mỹ 26 2.2.5. Xác định hàm lượng tinh bột theo phương pháp của Coombs và cs (1987) 26 2.2.6. Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp dinitro salixylic acid 26 2.2.7. Xác định hàm lượng OAA và pyruvate bằng phương pháp đo mật độ quang học ở bước sóng 340 nm 26 2.2.8. Xác định hoạt tính enzyme 27 2.2.9. Xác định hàm lượng protein và chạy điện di SDS - PAGE 27 2.2.10. Xử lý kết quả thí nghiệm 28 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 29 3.1. Tạo nguồn nguyên liệu ban đầu 29 3.1.1. Khả năng nhân chồi của đoạn thân tách từ cây nha đam in vitro 29 3.1.2. Khả năng nhân chồi của đỉnh sinh trưởng tách từ cây nha đam in vitro 29 3.1.3. Nhân nhanh cây nha đam in vitro lên môi trường tối ưu và cấy chuyển lên môi trường bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 31 3.2. Ảnh hưởng của mannitol ở các nồng độ khác nhau lên khả năng sinh trưởng và các chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh của cây nha đam in vitro 32 3.2.1. Ảnh hưởng của mannitol lên khả năng sinh trưởng của cây nha đam in vitro 32 3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ mannitol đến tốc độ sinh trưởng tương đối cây nha đam trong điều kiện in vitro 34 3.2.3. Ảnh hưởng của mannitol đến các chỉ tiêu sinh lý của cây nha đam in vitro 35 3.2.3.1. Biến động pH của dịch lá nha đam in vitro nuôi cấy trên môi trường có bổ sung các nồng độ mannitol khác nhau 35 3.2.3.2. Cường độ quang hợp ở lá của cây nha đam in vitro sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 37 3.3. Ảnh hưởng của mannitol đến các chỉ tiêu hóa sinh của lá cây nha đam in vitro nuôi cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau . 38 3.3.1. Hàm lượng nước trong lá cây nha đam in vitro cấy chuyển lên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 38 3.3.2. Hàm lượng protein 39 3.3.3. Hàm lượng đường khử và hàm lượng tinh bột 40 3.3.4. Hàm lượng pyruvate và OAA 42 3.3.5. Hoạt độ enzyme 44 3.6. Kết quả chạy điện di SDS-PAGE 46 Chƣơng 4 . KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 4.1. Kết luận 48 4.2. Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT cs : Cộng sự CAM : Crassulacean acid metabolism DTT : dithiothreiton MDH : malate dehydrogenase ME : malate enzyme MS : Murashige & Skoog OAA : acid oxaloacetic PBS : phosphate buffer in salt PCK : phosphoenolpyruvate carboxylkinase PEP : phosphoenolpyrvate PEPC : phosphoenolpyruvate carboxylase PVP : polyvinylpyrrolidone SDS : sodium dodecyl sulfate SDS - PAGE : sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis DANH MỤC BẢNG Số hiệu bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Thành phần môi trường MS 25 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ mannitol đến tốc độ sinh trưởng tương đối của cây nha đam trong điều kiện in vitro 34 Bảng 3.2 Biến động pH của dịch lá cây nha đam in vitro sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 36 Bảng 3.3 Cường độ quang hợp của lá cây nha đam in vitro nuôi cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 37 Bảng 3.4 Hàm lượng chất khô và protein trong lá nha đam được nuôi cấy trên môi trường bổ sung các nồng độ mannitol khác nhau 39 Bảng 3.5 Hàm lượng đường khử và hàm lượng tinh bột trong lá cây nha đam in vitro khi nuôi cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 41 Bảng 3.6 Hàm lượng pyruvate và OAA trong lá nha đam in vitro khi nuôi cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 42 Bảng 3.7 Hoạt độ enzyme MDH, PEPC và ME trong dịch chiết lá nha đam in vitro trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 44 DANH MỤC HÌNH VẼ Số hiệu hình Tên hình Trang Hình 1.1 Các giai đoạn của chu trình quang hợp 5 Hình 1.2 Sơ đồ phân loại thực vật CAM 6 Hình1.3 Sơ đồ chuyển hóa acid malic 7 Hình 1.4 Cấu trúc amylose và amylopectin 19 Hình 1.5 Cấu tạo phân tử mannitol 21 Hình 2.1 Cây nha đam (Aloe vera L.) in vitro 24 Hình 3.1 Cụm chồi thu được từ đoạn thân tách từ cây nha đam in vitro 29 Hình 3.2 Cụm chồi thu được từ đỉnh sinh trưởng tách từ cây nha đam in vitro 3 tuần 30 Hình 3.3 Chồi đơn tách từ cụm chồi nha đam in vitro mới cấy chuyển 31 Hình 3.4 Chồi đơn tách từ cụm chồi nha đam in vitro sau cấy chuyển 4 tuần 32 Hình 3.5 Mẫu nha đam in vitro xử límannitol :a,b,c,d,e,f,g tương ứng với nồng độ mannitol: 1, 3, 6, 9, 12,15, 18% cấy chuyển sau 4 tuần. 33 Hình 3.6 Quá trình tích lũy và chuyển hóa acid malic trong nhóm PCK – CAM 35 Hình 3.7 Phổ điện di protein hòa tan tổng số của lá cây nha đam in vitro trên môi trường bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau. 46 DANH MỤC ĐỒ THỊ Số hiệu đồ thị Tên đồ thị Trang Đồ thị 3.1 Hàm lượng protein trong lá cây nha đam in vitro nuôi cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 40 Đồ thị 3.2 Hàm lượng pyruvate của cây nha đam in vitro khi nuôi cấy trên các môi trường có bổ sung hàm lượng mannitol khác nhau 43 Đồ thị 3.3 Hàm lượng OAA của cây nha đam in vitro khi nuôi cấy trên các môi trường có bổ sung hàm lượng mannitol khác nhau 44 [...]... thương…[14] Một số nghiên cứu gần đây đã xây dựng hoàn chỉnh quy trình nhân nhanh giống cây nha đam bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Quy trình nuôi cấy này cho phép tạo ra một lượng lớn cây nha đam in vitro làm nguồn vật liệu khởi đầu trong việc nghiên cứu khả năng chịu hạn của cây trong điều kiện nhân tạo Trong kỹ thuật nuôi cấy mô, người ta thường dùng mannitol để gây hạn sinh lý trong cây in vitro Mannitol. .. bình nuôi cấy Trong thực tế, các nhà vi nhân giống dùng thuật ngữ nhân giống in vitro và nuôi cấy mô thay đổi cho nhau để chỉ mọi phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng Thuật ngữ đồng nghĩa là nuôi cấy in vitro Nhân giống in vitro và nuôi cấy mô bắt đầu bằng các mảnh nhỏ của thực vật, sạch vi sinh vật, và được nuôi cấy vô trùng [2] 10 1.3.2 Lược sử phát triển của nhân giống in vitro: ... vật CAM, chúng tôi chọn đề tài Nghiên cứu biến động một số chỉ tiêu hóa sinh của cây nha đam dƣới tác động của mannitol trong điều kiện nuôi cấy in vitro 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về thực vật CAM 1.1.1 Thực vật CAM Thực vật CAM được phát hiện đầu tiên vào cuối năm 1940, bởi 2 nhà thực vật học Rason và Thormas Thuật ngữ “CAM” được đặt theo tên của họ thực vật mà cơ chế này... giữa là nha đam tươi rồi dùng thìa nạo ở giữa lá nha đam quan sát sẽ thấy có một chất gel trong suốt 9 1.2.3 Thành phần hóa học cây nha đam Phân tích các thành phần lấy từ lá nha đam, các nhà nghiên cứu tìm thấy các chất sau [14]: 1 Hợp chất anthraquinon: đây là thành phần có tác dụng chữa bệnh của nha đam bao gồm: o Aloe emodin (chất này không có trong dịch tươi nha đam) Trong nhựa khô, Aloe emodin chiếm... Sinh học, trường đại học Khoa Học, Đại học Huế Sau đó, các cây được tách riêng và cấy lên môi trường nuôi cấy - Điều kiện nuôi cấy: mẫu được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm với điều kiện nhiệt độ là 250C, cường độ chiếu sáng 2.000 lux, thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày 2.2.1.3 Xử lý stress nước cho cây con in vitro và thu mẫu Các cây nha đam in vitro lớn, có kích thước tương đối đồng đều nhau được cấy. .. phân tử protein bị biến tính trong điều kiện cực đoan + Các sản phẩm của gen tham gia đào thải những chất bị biến tính, những chất có khả năng gây độc cho tế bào khi tế bào gặp tác động của điều kiện bất lợi - Hoạt động của nhóm gen tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào: Các chất điều hòa áp suất thẩm thấu có vai trò khác nhau trong việc giữ và lấy nước vào tế bào Đó là việc điều chỉnh các... hàm lượng của chúng Kỹ thuật điện di SDS chủ yếu để xác định sự xuất hiện của các protein mới trong mẫu nghiên cứu Ngoài tác dụng phân tách các băng protein có khối lượng phân tử khác nhau, polyacrylamide gel còn được ứng dụng để phân tách các đoạn DNA có kích thước bé ( . NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỘNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA SINH CỦA CÂY NHA ĐAM DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA MANNITOL TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN VITRO CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ SỐ : 60. 42 sống. Để hiểu rõ hơn đặc tính này trong nhóm thực vật CAM, chúng tôi chọn đề tài Nghiên cứu biến động một số chỉ tiêu hóa sinh của cây nha đam dƣới tác động của mannitol trong điều kiện nuôi. lá của cây nha đam in vitro sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 37 3.3. Ảnh hưởng của mannitol đến các chỉ tiêu hóa sinh của lá cây nha đam in vitro