- Tách chiết protein
Protein được tách chiết theo phương pháp thông thường ở phòng thí nghiệm như sau: Lấy 1 (g) mẫu lá nha đam in vitro tươi được rửa sạch với nước cất, lau khô, cắt nhỏ và nghiền mịn bằng nitơ lỏng. Protein hòa tan tổng số được chiết với đệm phosphate buffer in salt (PBS) theo tỉ lệ 1g mẫu: 1ml đệm, khuấy trộn mạnh 15
28
phút, sau đó ly tâm thu dịch ở 15.000 vòng/15 phút/40C cho đến khi hết cặn.Dịch chiết được kết tủa protein với aceton 100% theo tỉ lệ 2 acetol : 1 dịch chiết trong 2 giờ. Tiếp đó ly tâm 15.000 vòng/15 phút/40C để thu kết tủa protein. Kết tủa protein được để khô ở 40C. Cuối cùng ta hòa lại đệm chiết theo thể tích xác định hàm lượng protein và chạy điện di. Đệm chiết protein PBS (pH 7,4) có thành phần như sau :
NaCl 4g/L
KCl 0,2g/L
Na2HPO4 1,44g/L KH2PO4 0,24g/L - Xác định hàm lượng protein
Hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Bradford, sử dụng albumin huyết thanh bò (lyophilized bovine serum albumin, Bio Rad) để dựng đường chuần protein. Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ = 595 nm bằng máy quang phổ.
- Điện di protein
Protein được điện di trên polyacrylamide gel 12% theo khối lượng phân tử bằng hệ điện di đứng Mini PROTEAN 3(Bio Rad) ở điện áp 60V. Protein chuẩn có khối lượng phân tử từ 45 kDa – 200 kDa.
Sau khi điện di, gel được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R250 0,1% trong 15 phút. Tiếp đó rửa gel bằng dung dịch rửa là acid acetic: methanol: nước cất theo tỷ lệ tương ứng 1 : 3 : 6 từ 2 – 3 lần, mỗi lần 15 phút. Khi nhuộm và rửa gel đặt trên máy lắc nhẹ.