- Polyacrylamide gel
Điện di trên polyacrylamide gel được Weintraub sử dụng lần đầu tiên năm 1959 [44]. Hợp chất cơ bản được sử dụng trong gel là acrylamide, đây là một monomer có cấu trúc phân tử là CH2=CH-CO-NH2. Khi có mặt các gốc tự do được cung cấp bởiammonium persulfatevà ổn định bởi N,N,N’,N; - tetramethylethylenediamine, phản ứng chuỗi được bắt đầu trong đó có các acrylamide monomer được polymer hóa thành một chuỗi dài. Khi bisacrulamide (N,N’ – methylenebisacrylamide) được bổ sung trong phản ứng polymer hóa, các chuỗi sẽ liên kết chéo tạo thành dạng gel. Độ xốp của gel được xác định bởi chiều dài của chuỗi và mức độ liên kết chéo [4].
Polyacrylamide gel có hai thành phần chính là stacking gel nằm phía trên và separating gel nằm phía dưới. Stacking gel có nồng độ polyacrylamide thấp, thường là 5%. Mục đích của stacking gel tập trung lại các phân tử protein trên đường separating gel trước khi được phân tách theo khối lượng phân tử. Do gel có nồng độ polyacrylamide thấp nên các mắt lưới của gel cũng ít đi, vì vậy các phân tử protein di chuyển qua nó một cách dễ dàng. Separating gel có nồng độ polyacrylamide cao hơn stacking gel rất nhiều, thường nằm trong khoảng 10 – 15%. Mục đích của separating gel là để phân tách đoạn protein có khối lượng phân tử khác nhau. Do separating gel có nồng độ polyacrylamide cao nên các mắt lưới trong đó cũng dày hơn. Vì vậy, các phân tử protein di chuyển qua nó cũng khó khăn hơn nhiều [4].
Khi các phân tử protein di chuyển qua stacking gel gặp separating gel có nồng độ cao hơn, chúng sẽ tập trung lại trên bề mặt separating gel, do đó nồng độ của chúng sẽ tăng lên nhiều lần. Ở đó, các phân tử protein do đã được biến tính có khối lượng phân tử thấp, cấu trúc không gian đơn giản dễ dàng đi qua được các mắt lưới. Kết quả là các phân tử protein được phân tách thành các đoạn khác nhau.
- Nguyên lý của kỹ thuật điện di:
Trong quá trình chạy điện di một chiều các phân tử protein sẽ dịch chuyển giữa các mắt lưới polyacrylamide gel để di chuyển sang điện cực trái dấu. Sự phân tách này xảy ra nhờ điện tích của protein trái dấu ở pH cho trước, kích thước của
23
protein và sự cản trở của chúng trong quá trình dịch chuyển trong điện trường. Vì vậy, nếu các đặc điểm này bù trừ lẫn nhau thì protein khác điện tích và kích thước nhưng cũng có thể di chuyển cùng tốc độ như nhau trong gel. Để đơn giản hóa sự phân tách hỗn hợp protein mà chỉ phụ thuộc vào kích thước của chuỗi polypeptide, người ta tiến hành biến tính protein bằng thuốc tẩy sodium dodecyl sulfate (SDS). SDS liên kết rất chặt với protein làm cấu trúc ba chiều của protein bị biến tính trở thành các chuỗi polypeptide gắn đầy SDS trên đó. Trung bình, một amino acid sẽ liên kết với hai phân tử SDS và SDS sẽ tạo điện tích âm cho hạt SDS – polypeptide. Ngoài ra, SDS còn làm giảm mức độ khác nhau của các phân tử bằng cách phá vỡ các liên kết hydrogen, kìm hãm các phản ứng kị nước nội phân tử, phá vỡ cấu trúc bậc hai và bậc bốn của phân tử protein [4] .
Nhờ vào cấu trúc dạng mạng lưới của polyacrylamide gel mà các protein có khối lượng phân tử khác nhau (hay cấu trúc không gian phức tạp khác nhau) lần lượt di chuyển qua lớp gel với tốc độ khác nhau. Tốc độ dịch chuyển của các phân tử này phụ thuộc vào khối lượng của chúng, các phân tử có khối lượng bé dịch chuyển nhanh hơn và ngược lại. Kết quả cuối cùng các phân tử có khối lượng bằng nhau sẽ tập hợp thành 1 băng trên gel.
Sau khi tiến hành nhuộm các băng protein trên polyacrylamide gel và rửa sạch thuốc nhuộm. Dựa vào vị trí và độ đậm nhạt của các băng protein (cùng với các băng protein chuẩn), ta có thể định tính thành phần các loại protein cùng với sự thay đổi hàm lượng của chúng. Kỹ thuật điện di SDS chủ yếu để xác định sự xuất hiện của các protein mới trong mẫu nghiên cứu. Ngoài tác dụng phân tách các băng protein có khối lượng phân tử khác nhau, polyacrylamide gel còn được ứng dụng để phân tách các đoạn DNA có kích thước bé (<200bp).
24
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là cây nha đam in vitro (Aloe vera L.)
Hình 2.1. Cây nha đam (Aloe vera L.) in vitro
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Luận văn được tiến hành từ tháng 4/2012 đến tháng 9/2012 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ gen, Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế.
2.2.1. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro
2.2.1.1. Kiểm tra môi trường tối ưu
Đoạn thân hoặc đỉnh sinh trưởng của cây nha đam in vitro sẽ được tách thành những mảnh nhỏ (0,5cm x 0,5cm) và cấy vào môi trường nhân chồi. Chúng tôi sử dụng môi trường nhân chồi tối ưu đã được công bố trong các nghiên cứu trước đây của tác
25
giả Trương Thị Bích Phượng và cộng sự (2010) [13]. Môi trường nhân chồi tối ưu này là môi trường cơ bản MS (Murashige Skoog, 1962) [39], có chứa 8g/l agar, 30 g/lsaccharose, 1g/l than hoạt tính, 1,0 mg/l BAP kết hợp với 0,5 mg/l NAA, pH 5,8.
Từ đó sử dụng môi trường này để tiến hành nhân nhanh tạo nguồn nguyên liệu mẫu nha đam in vitro ban đầu.
Bảng 2.1. Thành phần môi trường MS [1] THÀNH PHẦN HÀM LƢỢNG (mg/L) THÀNH PHẦN HÀM LƢỢNG (mg/L) THÀNH PHẦN HÀM LƢỢNG (mg/L) 1. Đa lượng KNO3 KH2PO4 NH4NO3 MgSO4.7H20 CaCl2.2H2O FeSO4.7H2O Na2-EDTA 1900 170 1650 370 440 27,8 37,3 2. Vi lượng H3BO3 MnSO4.4H2O CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O ZnSO4.4H2O Na2MoO4.2H2O KI 6,2 22,3 0,025 0,025 8,6 0,25 0,83 3. Vitamin Myo-inositol Thiamine.HCl Pyridoxine.HCl Nicotinic acid 4. Amino acid Glycine 100 0,1 0,5 0,5 2
2.2.1.2. Kỹ thuật nhân nhanh từ cây tái sinh
Sử dụng mẫu nha đam in vitro được lưu tại bộ môn Sinh lý động vật – Di truyền, khoa Sinh học, trường đại học Khoa Học, Đại học Huế. Sau đó, các cây được tách riêng và cấy lên môi trường nuôi cấy.
- Điều kiện nuôi cấy: mẫu được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm với điều kiện nhiệt độ là 250C, cường độ chiếu sáng 2.000 lux, thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày.
2.2.1.3. Xử lý stress nước cho cây con in vitro và thu mẫu
Các cây nha đam in vitro lớn, có kích thước tương đối đồng đều nhau được cấy lên môi trường nhân chồi tối ưu có bổ sung mannitol ở các nồng độ 1, 3, 6,
26 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
9,12,15,18% để gây stress nước. Các cây nha đam in vitro có kích thước nhỏ hơn được cấy lên môi trường tối ưu. Sau khoảng 20 – 30 ngày các cây lớn sẽ được cấy chuyển sang môi trường có bổ sung mannitol. Quá trình cấy chuyển thực hiện liên tục nhiều lần với mục đích nhân nhanh cây con và tạo ra số lượng lớn cây xử lí mannitol dùng làm nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm sinh hóa sau này.
Mẫu lá nha đam in vitro xử lí stress nước được thu sau 4 tuần xử lí. Thời gian thu mẫu lúc 10 giờ sáng. Mẫu thu được rửa sạch với nước cất và sử dụng làm nguồn nguyên liệu để tiến hành các thí nghiệm.
2.2.2. Xác định tốc độ sinh trưởng tương đối
Khả năng sinh trưởng của cây được xác định bằng chỉ số tốc độ sinh trưởng tương đối (RGR) theo công thức của Lutt và cộng sự (1996) [12]:
(mg/g/ngày)
Trong đó:
Δt = t2 - t1 (t1: thời điểm bắt đầu nuôi cấy, t2: thời điểm sau khi nuôi cấy) W1: trọng lượng tươi (g) của mô tại thời điểm t1
W2: trọng lượng tươi (g) của mô tại thời điểm t2 ln: logarit cơ số e
2.2.3. Xác định hàm lượng nước bằng phương pháp sấy khô mẫu
2.2.4. Xác định cường độ quang hợp bằng máy đo cường độ quang hợp Ciras-2 Portable hệ thống quang hợp của hãng Licor - Mỹ Portable hệ thống quang hợp của hãng Licor - Mỹ
2.2.5. Xác định hàm lượng tinh bột theo phương pháp của Coombs và cs (1987) [ 21 ]
2.2.6. Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp dinitro salixylic acid [11]
2.2.7. Xác định hàm lượng OAA và pyruvate bằng phương pháp đo mật độ quang học ở bước sóng 340nm [34] học ở bước sóng 340nm [34]
Nghiền mịn 1,7 (g) lá nha đam in vitro với 6,5ml HClO4 4% (v/v). Sau đó giữ trong đá 30 phút và ly tâm thu dịch ở 15.000 vòng/15 phút/40C. Dùng 5ml dịch đem trung hòa với 5M K2CO3 ở 40C và loại kết tủa bởi ly tâm 15.000 vòng/10
27
phút/40C. Thêm vào dịch chiết 15mg than hoạt tính và để 15 phút ở 40C. Cuối cùng ta ly tâm thu dịch ở 15.000 vòng/10 phút/40C. Dịch này được dùng để đo hàm lượng OAA và pyruvate ở bước sóng 340nm. 0,1 ml dịch chiết đo hàm lượng OAA cùng với 150mM Tris–HCl (pH 7,6), 10mM EDTA–NaOH, 0,15mM NADH. 0,1ml dịch chiết dùng đo hàm lượng pyruvate cùng với 100mM Tris–HCl (pH 7,6), 3 mM EDTA–NaOH, 0,2mM NADH.
2.2.8. Xác định hoạt tính enzyme
Mẫu lá nha đam in vitro (0,2 g) được đồng nhất trong 10mg PVP và 1ml đệm chiết bao gồm: 50mM Tris – HCl (pH 8,2), 1mM EDTA, 5mM DTT, 5mM MgCl2, 0,2% BSA, 0,02% Trixton X – 100. Sau đó ly tâm 15.000 vòng/10 phút/40C thu dịch để xác định hoạt độ enzyme .
-Đo hoạt độ PEPC (E.C.4.1.1.31): 50 mM Tris – HCl (pH 8,2), 2mM NaHCO3, 5mM MgCl2, 0,2 mM NADH, 5mM DTT, 10 units/ml MDH, 2mM PEP trong tổng thể tích 1ml.
- Đo hoạt độ NAD – ME (E.C.1.1.1.40): 50 mM Tris – HCl (pH 8,2), 2,5mM EDTA, 10mM MgCl2, 0,5mM NADP, 5mM DTT, 0,1% Trixton X – 100, 10 mM malate trong tổng thể tích 1ml.
-Đo hoạt độ MDH (E.C.1.1.1.37): 0,3M mannitol, 10mM KH2PO4, 10mM KCl, 0,1% bovine serum albumin (BSA), 5mM MgCl2, 0,1% Trixton X – 100, 2mM NADH, 600mM α – ketoglutarate trong tổng thể tích 1ml.
Hoạt độ enzyme được xác định khi đo sự thay đổi độ hấp thụ ở bước sóng 340nm. Hàm lượng protein tổng số được xác định bằng phương pháp Bradford với đồ thị chuẩn bovine serum albumin, đo ở bước sóng 595nm.
2.2.9. Xác định hàm lượng protein và chạy điện di SDS - PAGE
- Tách chiết protein
Protein được tách chiết theo phương pháp thông thường ở phòng thí nghiệm như sau: Lấy 1 (g) mẫu lá nha đam in vitro tươi được rửa sạch với nước cất, lau khô, cắt nhỏ và nghiền mịn bằng nitơ lỏng. Protein hòa tan tổng số được chiết với đệm phosphate buffer in salt (PBS) theo tỉ lệ 1g mẫu: 1ml đệm, khuấy trộn mạnh 15
28
phút, sau đó ly tâm thu dịch ở 15.000 vòng/15 phút/40C cho đến khi hết cặn.Dịch chiết được kết tủa protein với aceton 100% theo tỉ lệ 2 acetol : 1 dịch chiết trong 2 giờ. Tiếp đó ly tâm 15.000 vòng/15 phút/40C để thu kết tủa protein. Kết tủa protein được để khô ở 40C. Cuối cùng ta hòa lại đệm chiết theo thể tích xác định hàm lượng protein và chạy điện di. Đệm chiết protein PBS (pH 7,4) có thành phần như sau :
NaCl 4g/L
KCl 0,2g/L
Na2HPO4 1,44g/L KH2PO4 0,24g/L - Xác định hàm lượng protein (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Bradford, sử dụng albumin huyết thanh bò (lyophilized bovine serum albumin, Bio Rad) để dựng đường chuần protein. Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ = 595 nm bằng máy quang phổ.
- Điện di protein
Protein được điện di trên polyacrylamide gel 12% theo khối lượng phân tử bằng hệ điện di đứng Mini PROTEAN 3(Bio Rad) ở điện áp 60V. Protein chuẩn có khối lượng phân tử từ 45 kDa – 200 kDa.
Sau khi điện di, gel được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R250 0,1% trong 15 phút. Tiếp đó rửa gel bằng dung dịch rửa là acid acetic: methanol: nước cất theo tỷ lệ tương ứng 1 : 3 : 6 từ 2 – 3 lần, mỗi lần 15 phút. Khi nhuộm và rửa gel đặt trên máy lắc nhẹ.
2.2.10. Xử lý kết quả thí nghiệm
Kết quả thí nghiệm được tính trung bình mẫu và sai số chuẩn của ít nhất 3 lần lặp lại bằng phần mềm Microsoft Excell 2007, xây dựng phương trình đường chuẩn, xác định hệ số tương quan (r), xử lí thống kê bằng phần mềm SAS.
29
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Tạo nguồn nguyên liệu ban đầu
3.1.1. Khả năng nhân chồi của đoạn thân tách từ cây nha đam in vitro
Đoạn thân của mẫu nha đam in vitro sau khi được cấy vào môi trường nhân chồi tối ưu đều sống sót, sinh trưởng và phát triển tốt. Hầu hết các mẫu nuôi cấy đều có khả năng tạo cụm chồi rất tốt. Sau 6 tuần nuôi cấy chúng tôi thu được số lượng chồi tạo thành cũng như khả năng sinh trưởng và phát triển của các mẫu thí nghiệm như đã trình bày ở hình 3.1.
Hình 3.1. Cụm chồi thu được từ đoạn thân tách từ cây nha đam in vitro
Từ các kết quả thu được ở hình 3.1, chúng tôi nhận thấy hầu hết các đoạn thân tách từ cây nha đam in vitro khi cấy vào môi trường nhân chồi tối ưu đều có khả năng tạo cụm chồi khá cao, đồng thời các chồi từ cụm chồi được tạo thành có khả năng sinh trưởng và phát triển được trên môi trường nghiên cứu.
3.1.2. Khả năng nhân chồi của đỉnh sinh trưởng tách từ cây nha đam in vitro
Khi cấy mẫu vào môi trường tối ưu, hầu hết các đỉnh sinh trưởng tách từ cây nha đam in vitro đều có khả năng tạo cụm chồi rất tốt. Các chồi con tạo thành có khả năng sinh trưởng và phát triển được trên môi trường nuôi cấy.
30
Các kết quả thu được trong phần này được chúng tôi trình bày ở hình 3.2. Từ kết quả đánh giá ở hình 3.1 và 3.2 cho thấy trên môi trường nhân chồi tối ưu, tất cả các mẫu thí nghiệm của đoạn thân và đỉnh sinh trưởng tách từ cây nha đam in vitro
đều có khả năng sinh trưởng và phát triển tương đối tốt.
Hình 3.2. Cụm chồi thu được từ đỉnh sinh trưởng tách từ cây nha đam in vitro sau 3 tuần Một số nghiên cứu trước đây của Aggarwal và cs (2004) [16] hoặc Davood và cs (2008) [24] cho thấy khi chuyển mẫu nuôi cấy từ đoạn thân của cây nha đam
in vitro trên môi trường nhân nhanh có bổ sung tổ hợp BAP và NAA thu được kết quả cao nhất tương ứng là 12,43 chồi/mẫu hoặc 9,67 chồi/mẫu.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy khi tiến hành nuôi cấy đoạn thân và đỉnh sinh trưởng tách từ cây nha đam in vitro trên cùng một môi trường nhân chồi tối ưu, sau 4 tuần nuôi cấy, lượng chồi trung bình thu được từ nuôi cấy đoạn thân là 11,13 chồi/mẫu và từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là 12,20 chồi/mẫu. Kết quả này của chúng tôi phù hợp với kết quả đã công bố trước đây của tác giả Trương Thị Bích Phượng và cs (2010) khi nhóm tác giả này cấy mẫu tách từ đoạn thân hay đỉnh sinh trưởng của cây nha đam in vitro vào môi trường nhân chồi tối ưu, họ đã thu được trung bình 12,8 chồi/đoạn thân và 10,83 chồi/đỉnh sinh trưởng [12].
Kết quả này của chúng tôi là chứng cứ thực nghiệm kiểm chứng và khẳng định được môi trường cơ bản MS có bổ sung 8 g/l agar, 30 g/l saccharose, 1g/l than
31
hoạt tính, 1,0 mg/l BAP kết hợp với 0,5 mg/l NAA, pH 5,8 là môi trường nhân chồi thích hợp cho việc nhân nhanh mẫu cây nha đam in vitro tách từ đoạn thân hoặc đỉnh sinh trưởng của cây nha đam in vitro trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào cây nha đam. Nhìn chung, cụm chồi in vitro hình thành từ đoạn thân hay đỉnh sinh trưởng đều có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trên môi trường nuôi cấy. Chồi đơn tách từ cụm chồi in vitro được cấy vào môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA, 1 mg/l BAP để tái sinh cây in vitro. Các cây con in vitro này tạo rễ, sinh trưởng và phát triển tốt.
3.1.3. Nhân nhanh cây nha đam in vitro lên môi trường tối ưu và cấy chuyển lên môi trường bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau chuyển lên môi trường bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau
Sau khi nhân chồi chúng tôi thu được một số lượng chồi lớn. Sau đó, chúng tôi tiến hành chọn các cây có kích thước lớn và tương đối đồng đều nhau cấy lên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau. Sau 4 tuần xử lí, chúng tôi sử dụng các mẫu cây này để nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa của chúng dưới tác động của mannitol ở các nồng độ khác nhau. Các cây con in vitro có kích