Các cây con in vitro có kích thước lớn và tương đối đồng đều nhau được cấy lên môi trường nuôi cấy MS chứa 8 g/l agar, 30 g/l saccharose, 1g/l than hoạt tính, 1mg/l BAP, 0,5 mg/l NAA, pH 5,8 và bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau từ 1, 3, 6, 9, 12, 15 và 18% với mật độ 2 cây/bình mẫu, sau 4 tuần nuôi cấy, tỷ lệ mẫu sống là 100%. Kết quả được trình bày ở hình 3.5.
Sau 4 tuần gây hạn sinh lí bằng mannitol nhận thấy: khi tăng nồng độ mannitol từ 1 – 18% thì lá cây bị cháy nám dần, đến nồng độ 15% hoặc 18% thì những lá phía ngoài cùng mất màu xanh, bị vàng và héo. Nguyên nhân có thể được giải thích như sau: trong cây, nước tồn tại dưới 2 dạng nước liên kết và nước tự do. Có hai dạng nước liên kết trong đó nước liên kết chặt cây không sử dụng được nhưng cây sử dụng được dạng nước liên kết lỏng lẻo. Hàm lượng nước tự do chiếm khoảng 70% lượng nước trong cây, chúng là dạng nước chủ yếu mà cây sử dụng được vì thế chúng đóng một vai trò hết sức quan trọng trong đời sống của cây. Khi cây thiếu nước thì tế bào thường bị co nguyên sinh, nguyên sinh chất tách ra khỏi màng tế bào và co cụm lại, nếu không được bổ sung một lượng nước kịp thời thì mất đi lượng nước tự do, quá trình quang hợp giảm dẫn đến lá vàng và héo đi.
33
Hình 3.5. Mẫu nha đam in vitro xử lí mannitol : a, b, c, d, e, f, g tương ứng với nồng độ mannitol: 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18% cấy chuyển sau 4 tuần.
a b
c d
34
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ mannitol đến tốc độ sinh trưởng tương đối cây nha đam trong điều kiện in vitro
Tốc độ tăng trưởng tương đối (TĐSTTĐ) là chỉ tiêu phản ánh khả năng sinh trưởng và phát triển của cây và phản ánh hiệu quả thực của quá trình quang hợp, vì vậy việc xác định TĐSTTĐ rất có ý nghĩa trong việc đánh giá khả năng tăng trưởng của cây. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nồng độ mannitol đến TĐSTTĐ của cây nha đam trong điều kiện in vitro dựa trên các thí nghiệm xử lý mannitol ở các nồng độ khác nhau trong 28 ngày được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.5.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ mannitol đến tốc độ sinh trưởng tương đối cây nha đam trong điều kiện in vitro
NĐ (%) KLT (mg) KLS (mg) RGR (mg.g-1.ngày-1) KNST 0 1170a 3190a 36 ++++ 1 1020b 2500b 32 ++++ 3 1030b 1710b 18 +++ 6 930b 1160c 8 +++
9 960b 910c - 2 Không sinh trưởng
12 1070b 930c - 5 Không sinh trưởng
15 900b 690c -9 Không sinh trưởng
18 1120b 800c - 12 Không sinh trưởng
Chú thích: NĐ: Nồng độ mannitol KLT: Khối lượng trước khi xử lý KLS: Khối lượng sau khi xử lý RGR: Tốc độ sinh trưởng tương đối KNST: Khả năng sinh trưởng ++++: Sinh trưởng tốt
+++: Sinh trưởng chậm
Từ kết quả thu được ở bảng 3.1 và hình 3.5 chúng tôi nhận thấy khi tiến hành xử lý mannitol ở nồng độ thấp (1 – 6%), mẫu thí nghiệm sinh trưởng tốt, trong 7 ngày đầu sau khi xử lý mannitol ở các nồng độ thấp, mẫu thí nghiệm sinh trưởng nhanh tương tự mẫu đối chứng, thời gian sau từ 10 – 28 ngày xử lý, mẫu thí nghiệm
35
có xu hướng sinh trưởng chậm lại, TĐSTTĐ khi xử lý mannitol ở các nồng độ 1, 3, 6% trong các mẫu thí nghiệm tương ứng là 32; 18 và 8 mg.g-1.ngày-1, so với đối chứng là 36 mg.g-1.ngày-1. Kết quả thu được ở nghiên cứu này cho thấy trong quá trình nuôi cấy in vitro, việc xử lý mannitol ở nồng độ thấp (1 – 6%) cũng đã có tác động đến khả năng, tốc độ sinh trưởng và phát triển của mẫu nuôi cấy. Cây in vitro
thí nghiệm vẫn có thể duy trì sự sống nhưng sinh trưởng và phát triển chậm. Xử lý mannitol từ nồng độ 9 – 18%, cây không sinh trưởng.