ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển và hàm lượng lipid ở tảo silic

Vì vậy, trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển và hàm lượng lipid ở tảo silic”.. Các hợp chất hoạt tính sinh

MỞ ĐẦU

Tảo silic (Bacillariophyceae hay diatom) là một nhóm tảo có hàm lượng lipid

và acid béo cao, có tiềm năng ứng dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học ở quy môcông nghiệp, đặc biệt là sản xuất biodiesel Tảo silic phân bố hết sức rộng rãi trênTrái Đất: trên thân cây ở đỉnh núi cao, trên đất, đá ẩm, mọi thủy vực nước ngọt,nước lợ, nước mặn [6] Trong hệ phù du dưới biển, tảo silic là nhóm chiếm ưu thế,đặc biệt ở những vùng biển giàu dinh dưỡng [42] Tảo silic được cho là nhóm phù

du nhân thật quan trọng nhất, tạo ra khoảng 20-25% tổng sinh khối sơ cấp ở cácthủy vực trên cạn và khoảng 40% sinh khối sơ cấp ở biển [28] Do có hàm lượnglipid cao nên từ lâu tảo silic đã được sử dụng làm thức ăn cho ấu trùng tôm, cá,

động vật thân mềm như Phaeodactylum, Chaetoceros, Skeletonema, Thalassiosira, [38] Một số loài tảo silic còn được dùng để sản xuất các chất béo

không no có giá trị như EPA, AA và DHA [16] Một số vi tảo rất phổ biến cho sản

xuất lipid đó là Chlorella, Crypthecodinium, Cylindrotheca, Nitzschia vì năng suất

sinh khối cao nên năng suất lipid đạt từ 20-50% sinh khối khô [71] Trong đó, hàmlượng lipid chính là chìa khóa để tuyển chọn các chủng làm nguyên liệu cho sảnxuất biodiesel [63] Chi phí cao do năng suất lipid thấp là một vấn đề, gây trở ngạicho việc sản xuất thương mại dầu diesel sinh học có nguồn gốc từ vi tảo Nhữngnghiên cứu nuôi cấy vi tảo trong phòng thí nghiệm hoặc điều kiện ngoài trời chothấy rằng để có được hàm lượng lipid cao cần có những kỹ thuật cảm ứng tạo lipidhoặc gây sốc (stress) cho môi trường nuôi vi tảo [63]

Trong nuôi tảo nói chung, nguồn tảo giống, chất dinh dưỡng và điều kiệnmôi trường nuôi là những yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và thành phầnsinh hoá của tảo Các thành phần dinh dưỡng đa lượng (C, N, P) và vi lượng ảnhhưởng rất lớn đến sinh trưởng của tảo, đặc biệt trong điều kiện nuôi với mật độcao[38] Trong các nguyên tố đa lượng thì nitrogen (N) và phosphorus (P) có vai tròquan trọng hơn cả N có vai trò quan trọng trong thành phần và cấu trúc của protein,thành phần cấu tạo nên bộ máy quang hợp và hệ enzym Nitrogen là thành phần củaacid amin, nucleotide, hormone, coenzyme,… Thiếu nitrogen, sườn carbon không

được dùng cho sự tổng hợp các hợp chất nitrogen (tỷ lệ C/N cao) Trong đó, mứcnitrogen khác nhau trong môi trường nuôi có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng, hàmlượng lipid của tảo đã được đề cập trong nhiều nghiên cứu Thiếu hụt nitrogen lànguyên nhân làm giảm tốc độ sinh trưởng, sinh khối, thời gian duy trì mật độ cựcđại, hàm lượng sắc tố, protein, lipid, acid béo không no, vitamin, carotenoids,phycociamin, enzyme,… ở nhiều loài tảo Ngoài ra môi trường nuôi và nguồnnitrogen khác nhau cũng ảnh hưởng đến nhu cầu nitrogen [51].

Thừa Thiên Huế có thủy vực nước lợ ven bờ rất đa dạng về thành phần loàithủy hải sản, đặc biệt là các loài vi tảo silic Những nghiên cứu trước đây về vi tảophù du ở vùng này đều tập trung vào việc xác định sự đa dạng và biến động thànhphần loài [9] Nguyễn Quang Huy (2010) đã bước đầu phân lập và khảo sát hàmlượng lipid ở một số chủng tảo silic cho hàm lượng lipid cao ở vùng biển ThừaThiên Huế có tiềm năng trong sản xuất biodiesel Vì vậy, trong đề tài này, chúng tôi

tiến hành nghiên cứu “Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển và hàm lượng lipid ở tảo silic”

Mục đích luận văn:

- Tối ưu hóa một số điều kiện nuôi cấy các chủng tảo silic triển vọng thuộc

các chi Pleurosigma sp và Nitzschia sp nhằm mục đích cho tốc độ sinh trưởng cao

và hàm lượng lipid cao

- Kết quả của đề tài sẽ làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo với mục đíchtạo ra nguồn nguyên liệu để sản xuất các hợp chất sinh học có giá trị ứng dụng trongnhiều lĩnh vực: nuôi trồng thủy sản, công nghệ sản xuất các hợp chất sinh học vàsản xuất nhiên liệu sinh học

Nội dung luận văn:

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitrogen khác nhau (nitrate,

ammonium, urea…) đến sự sinh trưởng và hàm lượng lipid tích luỹ của chủng

Pleurosigma sp và Nitzschia sp.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nitrogen kết hợp với điều kiện ánh

sáng đến sự sinh trưởng và hàm lượng lipid tích luỹ của chủng Pleurosigma sp và Nitzschia sp.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TẢO SILIC

1.1.1 Đặc điểm chung

- Sinh thái: Trong môi trường nước, tảo là nhóm sinh vật chiếm ưu thế,

trong đó, vi tảo ở các tầng trên của biển đóng vai trò quan trọng trong chu trìnhcarbon, oxygen, nitrogen, phosphorus, silicon và những thành phần khác Trong hệphù du ở biển, tảo silic là nhóm chiếm ưu thế, đặc biệt ở những vùng biển giàu dinhdưỡng Tảo silic thường gặp nhất ở trong môi trường nước kể cả ở nước ngọt vàbiển Chúng chiếm ưu thế trong hệ phù du, đặc biệt khi các cột nước động và giàudinh dưỡng Hầu hết tảo silic sống ở tầng đáy như trên đá, sỏi, cát, bùn, bề mặt độngthực vật ở đáy hồ, sông, biển Đại đa số chúng quang hợp, do đó chúng chỉ hạn chế

ở các tầng nông [22]

- Cấu trúc tế bào: Tế bào tảo silic hầu hết có kích thước từ 10-200 μm theom theo

chiều lớn nhất Tế bào chứa nguyên sinh chất và thành tế bào bao quanh, có các bàoquan của thực vật nhân thật, bao gồm nhân, thể Golgi, Ty thể, Lục lạp Nhân khá dễdàng nhận thấy, thường nằm ở trung tâm tế bào bởi các cầu hoặc sợi của nguyênsinh chất, hoặc nằm về một phía của tế bào Lục lạp có màu nâu, vàng kim hoặcvàng xanh với một lượng lớn carotenoid, chủ yếu là β-carotene, fucoxanthin,diatoxanthin và diadinoxanthin Màu sắc của tế bào là do các carotenoid, chúng chephủ các chlorophylla, c1, c2 Khi bị tổn thương hoặc xử lý bằng acid, tế bào chuyểnthành màu xanh do carotenoid bị phá hủy làm lộ ra các chlorophyll [22]

Có hai nhóm tảo silic chính: tảo silic lông chim và tảo silic trung tâm Tảosilic lông chim thường có mảnh vỏ dài, lưỡng cực, đa số đối xứng hai bên Tuynhiên một số tảo silic lông chim không đối xứng hai bên, chẳng hạn Cymbella,Gomphonema, đó là do sự phát triển không đều của bào tử và dễ biến dạng từ bênnày sang bên kia đai Tảo silic trung tâm có dạng đối xứng tỏa tròn [22]

Tảo silic có cấu tạo đơn bào, sống đơn độc hay thành tập đoàn dạng pamella,dạng sợi, dạng chuỗi, dạng dải, dạng sao….Tế bào có nhân lưỡng bội, có cấu trúc

màng độc đáo gọi là vỏ giáp Vỏ gồm hai lớp: lớp trong là pectin, lớp ngoài làdioxide silic (SiO2.7H2O) Ngoài silica, thành tế bào còn có vật liệu hữu cơ bao gồmprotein, lipid và polysaccharide Chức năng của hầu hết thành phần hữu cơ là chưađược biết rõ, có thể là bảo vệ silica khỏi bị hòa tan, một số khác liên kết các phân tửsilica và một số có thể liên quan tới sự nhận biết tế bào - tế bào, chẳng hạn trongsinh sản hữu tính Những hợp phần silica của thành tế bào được gọi là “vỏ”(frustule), là phần còn lại khi tế bào được tẩy sạch bởi acid đậm đặc hoặc các tácnhân oxy hóa khác để loại bỏ hết thành phần hữu cơ Vỏ không phải là toàn bộthành tế bào, thậm chí có lúc không phải là phần chính của thành tế bào Vỏ gồmhai mảnh (valve) gắn với nhau bới một đai (girdle) Vỏ trên (epitheca) lớn hơn vừakhít với vỏ dưới nhỏ hơn (hypotheca).Cấu trúc vỏ và cách sắp xếp hoa văn trên vỏchính là điểm đặc biệt của tảo silic, làm cho chúng dễ dàng được nhận biết và là đặcđiểm chìa khóa để phân loại [22].

- Sinh sản: Tảo silic phân chia tế bào theo hình thức sinh sản sinh dưỡng bằng

cách phân đôi Là tế bào nhân thật, tế bào tảo silic cũng trải qua các pha G1, S, G2.Không như thành tế bào làm từ cellulose hay các polysaccharide khác, mảnh vỏ silicakhông thể kéo giãn, mặc dù có thể bẻ cong, sự tăng thể tích tế bào trong suốt các phaG1, S, G2 không thể thực hiện bằng cách kéo giãn thành phần vỏ [43] Thay vì vậy, sự

mở rộng được thực hiện bằng vỏ trên và vỏ dưới trượt khỏi nhau Hai tế bào con hìnhthành, một thừa hưởng vỏ trên của mẹ và tổng hợp vỏ dưới mới, tế bào còn lại thừahưởng vỏ dưới của mẹ, cái mà lúc này trở thành vỏ trên, và tổng hợp một vỏ dưới mới

Vì vậy, tế bào con luôn nhỏ hơn tế bào mẹ sau mỗi lần phân chia [22]

Tuy nhiên, kích cỡ tế bào không nhỏ vô hạn định Khi kích thước tế bào nhỏtới mức giới hạn, tảo silic khôi phục lại kích thước thông qua quá trình hình thànhbào tử sinh trưởng (auxospore), điều này thường liên quan tới sự sinh sản hữu tính.Các tế bào dạng lưỡng bội giảm phân tạo giao tử Một giao tử sẽ rời bỏ lớp vỏ silica

để hợp nhất vào giao tử kia Sau đó, hình thành một khối cầu lớn, được bao bọc bởimột màng hữu cơ Bên trong khối cầu này, một vỏ mới với kích thước tối đa đượctạo thành và chu trình mới bắt đầu [22]

Chi Pleurosigma (Smith 1852) [27].

Mô tả chung: Tế bào đơn độc, hai đầu nhọn hơi uốn nhẹ, chiều dài vỏ hìnhmũi mác, thường có đường sigma Đường rãnh thường có hình sigma, trung tâmhoặc lệch tâm Vân mịn, có các đốm nhỏ trong các đường xiên và ngang Sinh chấtphân bố khắp tế bào Nhân trung tâm thường nhỏ và tròn Chiều dài 60-68 µm,

chiều rộng 12-15 µm Khoảng 16 loài Pleurosigma đã được mô tả bởi Smith (1852).

Pleurosigma angulatum , P aestuarii , P affine , P normani , P nubecula , P peragalli , P stuxbergii…[27]

1.1.3 Chi Nitzschia

Hình 1.2 Nitzschia sp (NITA)

Lớp Bacillariophyceae

Bộ Bacillariales Hendey 1937

Họ Bacillariaceae Ehrenberg 1831

Chi Nitzschia Hassall 1845 [9].

Mô tả chung: Tế bào sống đơn độc Chiều dài 90-94 µm, chiều rộng mặt vỏ5-7 µm Sinh chất phân bố 2 đầu tế bào Hai đầu tế bào thuôn nhọn, ở giữa hơiphình to Không thấy vân Nội sinh chất ít

1.2 ỨNG DỤNG CỦA TẢO SILIC

1.2.1 Các hợp chất hoạt tính sinh học

Lipid thu được từ tảo có thể được sử dụng để sản xuất mỹ phẩm và các thànhphần của dược phẩm (thuốc giảm béo, chống tích lũy mỡ dưới da, chống sự lão hóa

da và các thuốc hỗn hợp cho da nhạy cảm) [75]

Hàm lượng chất béo có ý nghĩa ở tảo silic là 1,7 pg/tb, hàm lượng này ở

Chaetoceros (2 pg/tb) cao hơn so với Skeletonema costatum (1,4 pg/tb) Thành phần

acid béo mỗi chi thường giống nhau Giá trị dinh dưỡng của vi tảo có thể bị thay đổirất lớn ở các pha phát triển và dưới các điều kiện nuôi khác nhau Vi tảo phát triểnđến cuối pha logarit thường chứa 30 – 40% protein, 10 – 20% lipid và 5 – 15 %carbohydrate Khi tảo được nuôi qua pha cân bằng thì hàm lượng này bị thay đổirất lớn, ví dụ như: khi nitrate giảm thì hàm lượng carbonhydrate có thể tăng gấp 2lần hàm lượng protein [13].

Tảo silic là loài trao đổi chất linh hoạt do chúng có thể sản xuất và tích lũyloạt các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học, chẳng hạn như PUFA(polyunsaturated fatty acid) và các chất polyme ngoại bào ví dụ như:Docosahexaenoic acid (DHA), eicosapentaenoic acid (EPA), arachidonic acid (AA)rất cần thiết đối với động vật nuôi thủy sản [20]

Sử dụng tảo silic để sản xuất PUFA có lợi thế hơn chiết xuất từ dầu cá.Đầu tiên, tảo silic có một hàm lượng PUFA; thành phần của PUFA trong một sốloài có thể lên tới 5% - 6% của trọng lượng khô tế bào Thứ hai, tảo silic là tảo đơnbào với sự phát triển nhanh chóng, và có thể áp dụng các kĩ thuật công nghệ sinhhọc lên tế bào của chúng để thúc đẩy quá trình tổng hợp PUFA, ví dụ như thao tác

di truyền và thay đổi các điều kiện nuôi cấy [55] Như vậy, sản xuất vi tảo để thucác hợp chất ở quy mô lớn là dễ dàng, và các chất chuyển hóa cao có thể thu đượcthông qua điều kiện nuôi cấy được kiểm soát Thứ ba, việc tách chiết và tinh sạchcác PUFA từ tảo silic đơn giản hơn từ cá Đặc biệt, các sản phẩm tảo silic khôngchứa mùi tanh, cholesterol, hoặc ô nhiễm bởi thuốc trừ sâu và các kim loại nặng cónhiều khả năng xuất hiện trong dầu cá [37].

Trong nuôi trồng thủy sản, EPA và DHA là thành phần dinh dưỡng quantrọng của ấu trùng của nhiều loài cá, tôm và sinh vật hai mảnh vỏ PUFA có khảnăng duy trì tốc độ tăng trưởng của ấu trùng cao và cho tỷ lệ sinh sản cao Như vậy,PUFA là một trong những chỉ số quan trọng nhất cho việc đánh giá giá trị dinhdưỡng thức ăn thủy sản [37]

Nhận thức về lợi ích của PUFA đối với người và động vật, thêm vào đó là sựcạn kiệt của dầu cá (là nguồn cung cấp PUFA chính hiện nay) đã dẫn đến việc tìmkiếm nguồn PUFA rẻ tiền trong vài năm qua Trong thực tế, cá không tự tổng hợpđược PUFA mà tích lũy qua thức ăn là các vi tảo giàu PUFA Vi tảo, đặc biệt lànguồn gốc biển, giàu PUFA trong tế bào rất được các nhà khoa học quan tâm,nghiên cứu [46]

1.2.2 Ứng dụng của tảo silic trong nuôi trồng thủy sản

Tảo đơn bào là thức ăn tươi sống đặc biệt quan trọng cho tất cả các giai đoạnphát triển của động vật thân mềm hai mảnh vỏ (Bivalvia) như: hầu, vẹm, điệp, sò.Chúng còn là thức ăn cho ấu trùng của hầu hết các loài tôm, cá, ốc và cho các độngvật phù du Đã có hàng trăm loài tảo được thử nghiệm làm thức ăn nhưng cho tớinay chỉ khoảng hai mươi loài tảo đơn bào được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồngthủy sản [70]

Vi tảo là nguồn cung cấp vitamin quan trọng cho các đối tượng nuôi thuỷsản Theo thống kê của Brown (2002), hàm lượng acid ascorbic (vitamin C) trong vitảo có sự khác nhau rất lớn giữa các loài (16 mg/g khối lượng khô ở tảo

Chaetoceros muelleri; 1,1 mg/g ở tảo Thalassiosira pseudonana) Còn lại các

vitamin khác (thiamin – B1, riboflavin – B2, pyridoxine – B6, cyanocobalamin –B12, biotin, pyridoxine…) chỉ khác nhau từ 2 – 4 lần giữa các loài tảo Điều này

chứng tỏ rằng, việc lựa chọn một cách cẩn thận các loại vi tảo kết hợp với nhau sẽcung cấp đầy đủ vitamin cho chuỗi thức ăn của động vật nuôi thủy sản [20].

Hiện nay, trên thế giới có khoảng 40 loài vi tảo được nuôi sử dụng làm thức

ăn trong nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên, ở Việt Nam chủ yếu mới phân lập và làm

thức ăn trong nuôi trồng thủy sản chủ yếu 2 loài Skeletonema costatum và Chaetoceros sp Hiện nay, ở nước ta các giống vi tảo này chủ yếu được nhập khẩu

nên thường gặp những khó khăn, không những trong bảo quản, vận chuyển mà còngặp các vấn đề trong nuôi cấy Sự thay đổi về môi trường sống, thời tiết, khí hậucần phải có thời gian để con giống thích nghi lại Ngoài ra, giá thành cũng là mộtyếu tố quan trọng trong việc nhập khẩu giống [8]

Trong nuôi trồng thủy sản, màu nước có vai trò rất quan trọng trong việctham gia hình thành chuỗi thức ăn tự nhiên, hệ lọc sinh học, ổn định các thông sốmôi trường …tảo silic nhiều góp phần tạo màu nước tốt Sự hiện diện của các loài

vi tảo này trong ao hồ nuôi thủy sản thể hiện môi trường rất nhiều thức ăn tự nhiên

và phong phú về chủng loại, cân bằng các yếu tố môi trường và các phương trìnhsinh hóa sinh lý, ít các loài tảo độc rong độc giàu dưỡng chất [6]

Trong công nghiệp nuôi tôm sú, tảo silic là một trong những loài tảo phù hợp

về kích thước và chất lượng dinh dưỡng cho ấu trùng tôm Tảo có tốc độ tăngtrưởng nhanh, có thể nuôi trong điều kiện nhân tạo, trong các trại sản xuất giống

Có rất nhiều loại thức ăn để ươm nuôi ấu trùng tôm sú, riêng tảo lục và tảo silic đã

có tới hơn 15 loài [4] Các loài thường được sử dụng nhất để làm thức ăn cho ấu

trùng tôm, cá là Phaeodactylum, Chaetoceros, Skeletonema và Thalassiosira [4].

Tảo silic chiếm ưu thế ở môi trường nước, có hàm lượng lipid cao, kích thướcphù hợp nên từ lâu đã được dùng làm thức ăn cho nuôi trồng thủy sản Hàm lượngprotein là yếu tố chính quyết định giá trị dinh dưỡng của vi tảo Bên cạnh đó, hàmlượng các acid béo không no như EPA, AA, DHA cũng là yếu tố quan trọng Thực tế,một số acid béo cần thiết cho nhiều động vật biển [71] và cần thiết cho sinh trưởng,phát triển của nhiều ấu trùng [15] Theo Brown và cs (1997), vi tảo cần thiết cho dinhdưỡng trong suốt một thời gian ngắn, ở dạng trực tiếp tiêu thụ của động vật thân mềm

và tôm, hay gián tiếp như nguồn thức ăn cho các con mồi làm thức ăn cho cá con [21]

1.2.3 Ứng dụng của tảo silic trong sản xuất biodiesel

Sản xuất biodiesel là một hướng ứng dụng khá mới mẻ của tảo silic Chìakhóa cho sản xuất biodiesel chính là lipid có trong nguyên liệu [33] Vi tảo có nhiều

ưu điểm như dễ nuôi trồng, có thể sinh trưởng mà cần ít hoặc không cần chăm sócchu đáo, tận dụng được nguồn nước không sử dụng và dễ dàng hấp thụ chất dinhdưỡng [25] Biodiesel là hỗn hợp các ester giữa acid béo và alkyl thu được thôngqua quá trình chuyển vị ester của dầu thực vật hay mỡ động vật Nguồn nguyên liệulipid dầu thực vật hay mỡ động vật bao gồm 90-98% khối lượng là các triglyceride

và một lượng nhỏ các mono và diglyceride, acid béo tự do chiếm khoảng 1-5%,phần còn lại là các phospholipid, phosphatide, carotene, tocopherol, hợp chấtsulphur, và một ít nước [18]

Biodiesel chủ yếu được sản xuất từ dầu của đậu nành và các loại rau quả, cọ,hoa hướng dương, hạt cây cải dầu cũng như dầu phế thải từ các nhà hàng Sử dụngnguồn nguyên liệu thực vật để sản xuất biodiesel dẫn đến việc mở rộng diện tíchtrồng trọt, áp lực trong sự thay đổi sử dụng đất trồng và sự gia tăng các cánh đồngcanh tác có thể dẫn tới cạnh tranh đất đai và làm mất đi sự đa dạng sinh học do sựlấn chiếm rừng và các vùng sinh thái quan trọng [54] Vi tảo được xem là ứng cửviên tiềm năng cho sản xuất biodiesel bởi một số lí do:

Nguồn nguyên liệu là sinh khối vi tảo, có thể góp phần giảm bớt được nhữngđòi hỏi bức thiết về mặt bằng nhờ có hiệu suất năng lượng cao hơn trên mỗi đơn vịdiện tích đất cũng như không cạnh tranh ảnh hưởng tới đất nông nghiệp Hơn nữa,biodiesel sản xuất từ vi tảo ảnh hưởng đến môi trường thấp hơn và có cùng chấtlượng so với các nguồn nhiên liệu hiện nay [55]

Vi tảo phát triển rất nhanh chóng và nhiều loài tảo có lượng dầu phong phú.Mức dầu 20 – 50% là phổ biến ở vi tảo Trong điều kiện phòng thí nghiệm, lượngdầu lý tưởng có thể đạt 56 – 60% tổng sinh khối khô bằng kỹ thuật di truyền hoặc

kỹ thuật nuôi cấy dị dưỡng [57]

Thực tế, vi tảo có hiệu suất dầu cao nhất trong số các cây trồng lấy dầu đadạng khác Có thể so sánh hiệu suất nuôi trồng vi tảo với việc khai thác các nguồnsinh khối khác qua bảng số liệu sau

Bảng 1.1 So sánh vi tảo với các nguồn nguyên liệu sản xuất biodiesel khác [71]

Nguồn

Hàm lượng dầu(% khối lượngsinh khối)

Năng suấtlipid (Ldầu/ha/năm)

Đất sử dụng(m2 /năm/kgbiodiesel)

Năng suấtbiodiesel (kgbiodiesel/ ha/năm)Bắp/Ngô

Vi tảo có khả năng quang hợp hiệu quả hơn bất kỳ loại sinh khối thực vật nàokhác, quá trình quang hợp của vi sinh vật là quá trình tái sinh sử dụng năng lượngmặt trời để chuyển hóa thành một dạng năng lượng dự trữ mới dưới dạng các liênkết hóa học, ngoài ra con người hoàn toàn có thể chủ động sản xuất sinh khối vi tảovới số lượng lớn Vì vậy nếu có thể thu hồi năng lượng với năng suất cao từ chúngthì sinh khối vi tảo được xem là một nguồn tài nguyên đầy hứa hẹn để sản xuấtnhiên liệu, và vi tảo có thể được xem như một nguồn năng lượng thay thế chonguồn năng lượng hóa thạch đang cạn kiệt dần [18] Hơn nữa, theo tiêu chuẩnbiodiesel của tổ chức kiểm tra nguyên liệu Mỹ (ASTM), biodiesel từ dầu vi tảo cócác thuộc tính tương tự với biodiesel tiêu chuẩn, và nó cũng an toàn hơn vì có nhiệt

độ phát cháy cao

Những ưu điểm khi nuôi cấy vi tảo như nguồn tài nguyên sinh khối tảo đượcxem là các cơ thể sống có khả năng thu nhận năng lượng mặt trời để tạo ra các hợpchất hữu cơ rất hiệu quả [77]

- Tảo được xếp vào loài thực vật không có hệ mạch dẫn, đa phần đều thiếu cơquan sinh sản phức tạp [77]

- Vi tảo dễ dàng nuôi cấy để sản xuất một số hợp chất đặc thù chọn lọc, có giátrị kinh tế với nồng độ cao như protein, carbohydrate, lipid và các sắc tố dựa vàocác điều kiện sinh trưởng đa dạng [77] Từ đó có thể tối ưu hóa môi trường để thuđược sinh khối với hàm lượng lipid cao

- Vi tảo thuộc vào nhóm vi sinh vật sinh sản theo chu kỳ phân đôi tế bào [77]

- Hệ thống sản xuất sinh khối tảo dễ dàng thích nghi ở các quy mô và kỹ thuậtkhác nhau [77]

- Việc nuôi thu sinh khối vi tảo không đòi hỏi nhiều diện tích như khi trồngcác loại cây lấy dầu khác, và năng suất sinh khối vi tảo cũng không phụ thuộc vàothời tiết hay ảnh hưởng của môi trường Biodiesel sản xuất từ vi tảo không làm ảnhhưởng đến việc sản xuất thực phẩm và các sản phẩm khác từ thực vật [77]

- Vi tảo có mức độ sinh trưởng rất nhanh, chu kỳ sinh trưởng hoàn tất chỉtrong vài ngày [77], và có rất nhiều loài tảo chứa nhiều dầu [], năng suất dầu trênmỗi đơn vị nuôi cấy vi tảo có thể cao vượt trội hơn so với năng suất dầu của cây cóhạt chứa hàm lượng dầu nhiều nhất Thông thường các loài vi tảo có hàm lượng dầuvào khoảng 20-50% [39]

- Sản xuất sinh khối vi tảo có thể được xem là một phương pháp cố định trựctiếp khí thải CO2 vì vi tảo sử dụng CO2 như nguồn carbon nhờ khả năng quang hợp(1kg sinh khối khô đòi hỏi cần có 1.8 kg CO2) [39]

- Các phần sinh khối vi tảo còn dư lại sau quá trình trích ly dầu có thể đượcdùng như nguồn thức ăn cho gia súc, hoặc làm phân bón, hoặc qua quá trình lênmen tạo các sản phẩm ethanol hay methane [39]

1.3 LIPID Ở TẢO SILIC

Các thành phần chính của tế bào tảo là các protein, carbohydrate và lipid.Trong đó, lipid là nguồn năng lượng dự trữ hiệu quả nhất Lipid có vai trò như chấtcách điện của các cơ quan, đồng thời là thành phần cấu trúc của hầu hết màng tếbào Nó cũng có vai trò quan trọng đối với khả năng chịu stress sinh lí của các visinh vật bao gồm tảo silic [23]

Lipid là ester của acid béo và rượu, chúng bao gồm một nhóm lớn các hợp chấthữu cơ có cấu trúc khác nhau như lipid, sáp, phospholipid, glycolipid, … [23].Lipid sản xuất bởi vi tảo thường bao gồm lipid trung tính, lipid phân cực(polarlipids), ester sáp, sterol và hydrocarbon, cũng như các dẫn xuất prenyl nhưtocopherols, carotenoids, terpene, quinines và các dẫn xuất pyrrole như chlorophyl.Lipid sản xuất bởi vi tảo có thể được nhóm lại thành hai loại: lipid tích trữ (lipidkhông phân cực) và lipid cấu trúc (lipid phân cực) [37].

Lipid lưu trữ ở dạng TAG (Triacylglyceride) là chủ yếu, cấu tạo bởi các acidbéo bão hòa và không bão hòa đơn, một số nhóm có thể được chuyển vị để sản xuấtdầu diesel sinh học TAG là sản phẩm tích trữ phong phú, có thể dễ dàng cung cấpnăng lượng chuyển hóa cho tế bào Nói chung, TAG chủ yếu được tổng hợp dướiánh sáng, lưu trữ trong tế bào chất, và sau đó dùng để tổng hợp lipid phân cực trongbóng tối [73]

Lipid cấu trúc thường có một hàm lượng acid béo không bão hòa đa (các acidbéo có nhiều liên kết đôi - PUFA), cũng là những dưỡng chất cần thiết cho động vậtthủy sản và con người Lipid phân cực (phospholipid) và sterol là thành phần cấutrúc quan trọng của màng tế bào có vai trò như một hàng rào thấm có chọn lọc chocác tế bào và các bào quan Những lipid này duy trì chức năng màng sinh học, thamgia một loạt các quá trình trao đổi chất Ngoài chức năng cấu trúc, một số lipid phâncực đóng vai trò trung gian (hoặc tiền thân của trung gian) trong con đường tín hiệucủa tế bào (ví dụ: lipid inositol, sphingolipids, các sản phẩm oxy hóa) và đóng mộtvai trò trong việc đáp ứng với những thay đổi của môi trường Sự sẵn có của cácchất dinh dưỡng, tốc độ phản ứng enzyme đều có thể hạn chế sự tổng hợp lipid Sảnxuất các chất béo dự trữ đặc biệt là nguồn tài nguyên năng lượng lớn và do đóthường xảy ra ở điều kiện sinh trưởng giảm [37]

1.4 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY LIPID CỦA TẢO SILIC

1.4.1 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự sinh trưởng của tảo silic

Tảo silic là sinh vật quang tự dưỡng, nhờ hoạt động quang hợp mà chúng

có thể tổng hợp các chất hữu cơ từ nguồn CO2 và các chất vô cơ hòa tan trong

nước để xây dựng tế bào, vì vậy trong quá trình sinh trưởng và phát triển, tảochịu tác động của nhiều yếu tố môi trường Hiệu quả của các yếu tố môi trường

có thể khác nhau đáng kể giữa các loài do tảo silic có môi trường sống tự nhiên

đa dạng Những yếu tố như ánh sáng, độ mặn, pH, và thành phần dinh dưỡngkhông chỉ ảnh hưởng đến quang hợp và sản xuất sinh khối của tế bào mà còn ảnhhưởng đến các hoạt động chuyển hóa của tế bào Việc tối ưu hoá một thông sốnào đó chỉ có ý nghĩa với một loài cụ thể và không thể tránh khỏi sự tác độngqua lại giữa các yếu tố môi trường [37]

1.4.1.1 Ảnh hưởng của ánh sáng

Ánh sáng là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến quang hợp của các loài sinhvật Quá trình quang hợp sử dụng ánh sáng mặt trời để cung cấp năng lượng nhằmđồng hóa carbon vô cơ của tế bào tảo Raven và Geider (2003) đã mô tả phươngtrình quang hợp (tối thiểu) ở tảo:

Nhân tố quang hợp

CO2 + 2 H2O + 8 photon (CH2O) + *O2 +H2O

Để tiếp nhận ánh sáng, thực vật phiêu sinh có bộ sắc tố cấu thành từ nhiềunhóm sắc tố khác nhau, bao gồm 3 loại chính: chlorophyll hấp thụ ánh sáng lam vàđỏ; carotenoid hấp thụ ánh sáng lam và lục; phycobilin hấp thu ánh sáng lục, vàng

và da cam Tất cả các loài tảo đều có chlorophylla, giữ vai trò trung tâm của hệ

thống quang hợp Các loại chlorophyll khác có thể có hay không tùy mỗi loài Ở tảo

silic, chỉ có chlorophyllc mà không có loại b và d Các nhóm sắc tố phụ chia nhau

không gian trong hệ thống quang hợp để thu nhận tối đa nguồn năng lượng chiếu

xuống, rồi truyền năng lượng đó vào trung tâm phản ứng là chlorophylla [6] Tỉ lệ

chlorophyll trên sinh khối cũng như hiệu suất quang hợp trên mỗi đơn vịchlorophyll của mỗi loài có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của chúng Khi so sánhtảo 2 roi và tảo silic, Chan (1980) đã phát hiện tỷ lệ carbon trên chlorophylla (C/Chl

a) của tảo silic thấp hơn, và tỉ lệ tốc độ quang hợp tối đa với carbon nội bào

(Pmax/C) cao hơn tảo hai roi Điều này giải thích được tốc độ tăng trưởng cao củatảo silic trong các thủy vực tự nhiên [45]

Ánh sáng tác động lên vi tảo thông qua hệ thống sắc tố tập trung trong các

lục lạp Số lượng và kích thước trong tế bào tảo có vai trò rất lớn trong việc xác

định hàm lượng chlorophyll, như ở Skeletonema costatum có hai lục lạp to chiếm

phần lớn thể tích tế bào [2] Cường độ chiếu sáng, chất lượng quang phổ, thời gianchiếu sáng là các yếu tố được quan tâm Cường độ chiếu sáng đóng vai trò quantrọng nhưng nhu cầu về nó lại thay đổi lớn tùy theo độ sâu và mật độ tảo trong môitrường nuôi cấy

Ở một cường độ chiếu sáng nhất định, tốc độ tăng trưởng (µ) của thực vậtphiêu sinh chịu ảnh hưởng rõ rệt của sự thất thoát năng lượng do hô hấp, quá trìnhchủ yếu để chuyển hóa các sản phẩm sơ cấp của quá trình quang hợp thành vật chấtmới cho tế bào (ví dụ như protein) [2]

Bên cạnh đó, tốc độ tăng trưởng cũng lệ thuộc nhiều vào tỉ lệ Chl:C, phảnánh hiệu suất hấp thu năng lượng của mỗi loài Tỉ lệ Chl:C càng cao tức tế bào càng

có nhiều chlorophyll, tốc độ hấp thu ánh sáng càng gia tăng, trong khi hiệu quả sửdụng ánh sáng tối đa trong quang hợp không thay đổi ở mỗi loài [1]

Nghiên cứu đối với Cyclotella cho thấy mật độ tế bào đạt cực đại với cường

độ chiếu sáng là 100 µE.m-2.s-1 và sinh trưởng gần tương đương ở 200 µE.m-2.s-1

[50] Còn Skeletonema costatum sinh trưởng tối ưu ở 1.6×106.cm-2.s-1 (tương đương

267 µE.m-2.s-1) [72]

Tốc độ tăng trưởng của Skeletonema tăng với cường độ ánh sáng từ 500 đến

10.000 lux và suy tàn khi cường độ vượt quá 10.000 lux Theo nghiên cứu của

Uddin và Zafar (2006), sinh trưởng của Skeletonema costatum tốt nếu duy trì cường

độ ánh sáng trong khoảng 1000-10000 lux Ánh sáng tăng cường hoạt động quanghợp và sự phân chia của tế bào phiêu sinh vật Cường độ ánh sáng và thời gian

chiếu sáng có vai trò rất quan trọng đối với sự sinh trưởng và phát triển của S costatum Khoảng thời gian chiếu sáng tối ưu cho loài này sinh trưởng thường 10h

tối, 14h sáng vào mùa hè và 12h sáng, 12h tối vào mùa đông [75]

1.4.1.2 Ảnh hưởng của độ mặn

Độ mặn ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển của các loài vi tảo, đặc biệt làtảo nước mặn Tuy nhiên, có nhiều loài có phổ chịu muối rất rộng Khi độ mặn củamôi trường tăng cao (sốc muối), tế bào thực vật phiêu sinh có một số cơ chế thích

nghi, tăng cường sinh tổng hợp các chất điều hòa thẩm thấu, duy trì cân bằng nộimôi nhằm đảm bảo sự tồn tại của chúng trong môi trường, như sản sinh glycerol (ở

Dunaliella), sản sinh glucose và proline (ở Chlorella emersonii), tích lũy β-carotene (ở Dunaliella), … [47].

Đối với Skeletonema costatum độ mặn tối ưu cho sinh trưởng là từ 18-30‰ [72] Nitzschia hungarica có khả năng chịu mặn cao và không sinh trưởng được ở

độ mặn trên 52‰, không có khác biệt lớn về tốc độ sinh trưởng ở độ mặn từ

17-35‰ Amphora coffeaeformis đạt tốc độ sinh trưởng lớn nhất ở độ mặn 35‰ và

độ mặn tốt nhất cho Skeletonema costatum sinh trưởng nhanh và đạt được mật độ

cao nhất trong thời gian ngắn là 32 ‰ [58]

Theo Murugaraj và cs (2007), sinh trưởng của Amphora coffeaeformis giảm

ở độ mặn thấp và tăng khi độ mặn lên tới 35‰ Hàm lượng lipid cũng tăng khi độmặn tăng, ngoại trừ ở 40‰ trở lên [47]

1.4.1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Mỗi loài thực vật phiêu sinh, cũng như tất cả các loài sinh vật khác nhau, đều

có các ngưỡng nhiệt độ để tồn tại, tối đa để chống chịu, và tối ưu để tăng trưởngphát triển tốt nhất Nhiệt độ thấp làm giảm tốc độ tăng trưởng nhưng lại tăng kíchthước của tế bào [2]

Nhiệt độ tối ưu cho sự nuôi cấy thường là từ 20 đến 24oC, mặc dù điều nàycòn phụ thuộc vào sự khác nhau của thành phần nuôi cấy, tùy loài và chủng đượcnuôi cấy Nhiệt độ thấp hơn 16oC sẽ làm chậm sự sinh trưởng, ngược lại nhiệt độcao hơn 35oC có thể giết chết một số loài [50]

Theo Blanchemain (1993), Skeletonema costatum thích nghi với nhiệt độ từ

2 đến 30oC, và nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 20oC [4], trong khi Cyclotella

D-35 và Nitzschia TR-114 đạt mật độ cực đại ở 30°C [2].

1.4.1.4 Ảnh hưởng của pH

pH của môi trường là một nhân tố quan trọng trong nuôi cấy tảo pH là yếu

tố nội tại luôn thay đổi Khi tảo phát triển mạnh, pH môi trường bị thay đổi và trởthành yếu tố kìm hãm sinh trưởng và phát triển Do đó, pH quá cao hoặc quá thấpđều làm chậm sinh trưởng của tảo Mỗi loại tảo sinh trưởng tối ưu ở một độ pH nhấtđịnh của môi trường Độ pH thay đổi có thể gây ra các tác động rất rõ trên nhiềuquá trình sinh học khác nhau như khả năng phân ly muối và phức chất (gián tiếpgây độc và ức chế tăng trưởng), tính hòa tan của muối kim loại, hàm lượng độc tốcủa tảo độc [7]

Các loài khác nhau sẽ thích hợp với các mức pH khác nhau, chẳng hạn loài

Skeletonema costatum sinh trưởng ổn định ở pH 6,5-8,5 và giảm khi pH >9 [70].

Thornton (2009) khi nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến tổng hợp carbonhydrate ở

Chaetoceros muelleri đã nhận thấy, tốc độ sinh trưởng không bị ảnh hưởng trong

khoảng từ 7,4- 8,2 Tuy nhiên lại giảm mạnh ở pH 6,8 [74]

1.4.1.5 Ảnh hưởng của chế độ sục khí

Trong môi trường tự nhiên, dưới sự tác động của sóng gió, thủy triều, cáctầng nước bị phân tầng giúp cho tảo đủ dinh dưỡng và ánh sáng cần thiết để quangtổng hợp Trong môi trường nuôi nhân tạo các yếu tố trên được đảm bảo qua hìnhthức sục khí Trong nuôi cấy, sự sục khí là rất quan trọng bởi vì: 1) Không khí làmột nguồn carbon (từ CO2) cho quang hợp; 2) Cung cấp CO2 như là sự cân bằnggiữa CO2 và HCO3- làm ổn định pH; và 3) Sục khí trong môi trường giữ cho chấtdinh dưỡng và tế bào phân phối đều trong môi trường, giảm sự che ánh sáng hoặc

ức chế quang hợp (làm giảm quang hợp vì sự vượt quá giới hạn của ánh sáng) vàtránh sự phân tầng nhiệt độ ở hệ thống nuôi cấy ngoài trời [26]

Theo Sanchez và cs (1993), điều kiện thích hợp nhất để tạo ra được sinh

khối lớn Skeletonema costatum với giá trị dinh dưỡng tốt khi nuôi cấy mẻ trong

photobioreactor là môi trường Walne với dung dịch stock 1% và tốc độ sục khí là1,5 vvm (thể tích khí sục vào/thể tích dung dịch môi trường/phút) [60]

1.4.1.6 Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng

Các nguyên tố đa lượng (C, N, P, K, S, Cl, Mg, Na, Ca và Fe) và các nguyên

tố vi lượng (Zn, Cu, Ni, Co, W) đều ảnh hưởng đến sinh trưởng của tảo Trong đó,các nguyên tố vi lượng là thành phần bắt buộc hay tác nhân kích thích hoạt độngcủa nhiều hệ enzyme, có tác dụng thúc đẩy sinh tổng hợp chlorophyll và làm giảm

sự phân hủy chlorophyll nhờ làm tăng độ bền vững của phức hệ liên kết giữachlorophyll với protein [8]

Cũng giống như thực vật bậc cao, thực vật phiêu sinh cần có các chất khoáng

ở nồng độ cao (đa lượng) như N, P, S, Ca, Mg, Si,… cho sự tăng trưởng của chúngđồng thời với các chất khác ở nồng độ thấp (vi lượng) như Cu, Zn, Mn, Fe, …Thông thường, các chất khoáng vi lượng này có mặt trong môi trường tự nhiên vớilượng đủ cho sự tăng trưởng bình thường của thực vật phiêu sinh, nhưng khi có cácyếu tố khác can thiệp, đặc biệt là tình trạng ô nhiễm do các hoạt động của conngười làm nồng độ tăng cao hơn ngưỡng bình thường thì sẽ gây ra hiệu ứng ức chếtăng trưởng [2]

Sự hấp thu các chất khoáng như nitrate, ammonium hay phosphate vào tế bào

vi tảo trong tự nhiên phụ thuộc nhiều vào cường độ ánh sáng cũng như kích thước tếbào Do đó, mỗi loài trong cùng quần xã tự nhiên có khả năng sử dụng ánh sáng vàkhoáng chất khác nhau Ở cấp độ tế bào, điều này có thể lệ thuộc vào mức độ tối ưuhóa việc sử dụng năng lượng Ở cấp độ quần thể, sự khác biệt đó có thể dẫn đến sựhình thành các khu vực cư trú khác nhau giữa các loài [2]

Lượng dinh dưỡng khoáng cung cấp cho tảo có tác động phối hợp với nhiệt

độ ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tảo Khi loài tảo silic Skeletonema costatum

nuôi cấy hàng loạt ở 17oC với lượng dinh dưỡng đầy đủ, các tế bào kết chuỗi dàihơn so với nuôi ở các nhiệt độ thấp hơn (6-8oC) Tốc độ tăng trưởng cao của loàinày cũng giúp độ dài chuỗi cao hơn, kể cả trong điều kiện nuôi cấy hay trong tựnhiên Chuỗi dài sẽ giúp chúng lơ lửng ở các tầng nước trên, nhằm tận dụng đượccác yếu tố hóa lý thuận lợi cho quá trình tăng trưởng [69]

Trong các nguyên tố đa lượng thì nitrogen (N) và phosphorus (P) có vai tròquan trọng hơn cả N có vai trò quan trọng trong thành phần và cấu trúc của protein,thành phần cấu tạo nên bộ máy quang hợp và hệ enzym Nitrogen là thành phần của

acid amin, nucleotide, hormone, coenzyme,… Thiếu nitrogen, sườn carbon khôngđược dùng cho sự tổng hợp các hợp chất nitrogen (tỷ lệ C/N cao) [8].

Các loài thực vật phiêu sinh thường sử dụng nitrogen từ các nguồn nitrate vàmuối ammonium Nếu ammonium là nguồn nitrogen duy nhất cho tảo thì môitrường pH môi trường sẽ giảm xuống rõ rệt, ảnh hưởng đến sự tăng trưởng củachúng Các nguồn nitrogen dạng oxi hóa cần được khử trước khi tham gia phản ứngvới các chất hữu cơ: nitrate được khử thành nitrite nhờ enzyme nitrate reductase,tiếp đó nitriteđược nitrite reductase khử thành ammonium Nếu môi trường có đồngthời ammonium và nitrate thì tảo sẽ sử dụng ammonium trước, sau đó mới dùngnitrate [2]

Việc đồng hóa ammonium để chuyển sang các dạng hợp chất chứa nitrogenkhác, kéo theo sự hao tổn nguồn carbonhydrate dự trữ trong tế bào và hiệu suất sinhtổng hợp protein khi sử dụng nguồn nitrogen dạng khử (ammonium, ure) thấp hơn

so với dạng oxi hóa (nitrate) Ngược lại, sự đồng hóa NO3- đòi hỏi các cơ chế vậnchuyển bổ sung cũng như sinh tổng hợp các enzyme nitrite reductase và nitratereductase, vốn không cần khi sử dụng nguồn NH4 Chẳng hạn, Skeletonema costatum tăng trưởng nhanh hơn trong những ngày đầu khi nuôi trên môi trường có

nguồn nitrogen là ammonium, so với nguồn nitrate và nitrite [2]

Phosphorus là thành phần cấu tạo quan trọng của tế bào thực vật phiêu sinh,

có vai trò chính trong đa số các quá trình sinh học nội bào, đặc biệt là quá trìnhchuyển năng lượng và tổng hợp acid nucleic Nguồn phosphorus cho thực vật phiêusinh chủ yếu là các orthophosphate, trong khi chỉ có một số rất ít có thể sử dụngđược phosphorus hữu cơ, dù thường có nhiều trong môi trường tự nhiên [7] Thôngthường các tác động của phosphorus trên sự tăng trưởng của thực vật phiêu sinh cónhững liên hệ rất phức tạp với tác động của nitrogen, đặc biệt trong các quá tình có sựtham gia của enzyme và các sản phẩm phosphoryl hóa trung gian [29]

1.4.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến tích lũy lipid của tảo silic

Vi tảo có khả năng tồn tại trong những điều kiện đa dạng, chúng có thể đượcnuôi cấy trong một môi trường gây bất lợi cho sự sinh trưởng của tế bào và thuđược lipid Hơn nữa, một số vi tảo cũng có thể thay đổi phản ứng như chuyển hóa

thành lipid hiệu quả nhằm mục đích phù hợp với những thay đổi trong điều kiệnmôi trường [37].

Trong điều kiện tối ưu, sinh khối tảo được tạo ra khá lớn nhưng với khốilượng lipid tương đối thấp, chiếm khoảng 5-20% trọng lượng khô tế bào của chúng(DCW), bao gồm cả lipid của màng glycerol Về cơ bản, sinh khối vi tảo và sự tíchlũy TAG cạnh tranh quang hợp và đồng hóa, với việc thay đổi lại con đường sinh lý

là cần thiết để kích thích sinh tổng hợp lipid Điều kiện môi trường không thuận lợihoặc stress làm nhiều vi tảo thay đổi con đường sinh tổng hợp của chúng để hìnhthành tích lũy lipid trung tính (20-50 % DCW), chủ yếu dưới dạng TAG, cho phép

tế bào tảo chống những điều kiện bất lợi [37]

Chi phí cao do năng suất lipid thấp là một vấn đề gây trở ngại cho sản xuấtthương mại khi sản xuất dầu diesel sinh học có nguồn gốc từ vi tảo Những nghiêncứu nuôi cấy vi tảo trong phòng thí nghiệm hoặc điều kiện ngoài trời nhận thấy rằng

để có được hàm lượng lipid cao cần gây stress môi trường bên ngoài hoặc áp dụng

kỹ thuật cảm ứng lipid [37]

Nhiều vi tảo sản xuất FA bão hòa và không bão hòa trong điều kiện sinhtrưởng lý tưởng sẽ có giá trị dinh dưỡng cao, nhưng ít lý tưởng cho nhiên liệu sinhhọc Tuy nhiên, quá trình tổng hợp lipid trung tính dưới dạng TAG có thể được sảnxuất bởi nhiều loài trong điều kiện căng thẳng, và các lipid này đều phù hợp để sảnxuất nguyên liệu cho diesel sinh học Sự xuất hiện và mức độ của TAG phụ thuộcvào loài hoặc chủng cụ thể, và bởi gen di truyền của sinh vật đó [37]

Tổng hợp và tích lũy một lượng lớn các TAG cũng làm thay đổi đáng kểthành phần FA trong vi tảo khi được đặt trong điều kiện stress như thiếu dinhdưỡng, kích thích môi trường vật lý Đã có một loạt các nghiên cứu thực hiện kỹthuật cảm ứng lipid trong vi tảo như việc gây thiếu chất dinh dưỡng, trong đó gồmthiếu lượng N hoặc P bổ sung vào môi trường, chiếu xạ ánh sáng, độ pH, nhiệt độ,kim loại nặng và các hóa chất khác [37]

1.4.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng dinh dưỡng

Hàm lượng dinh dưỡng có tác động đáng kể đến sự phát triển của vi tảo, tíchlũy lipid của chúng và thành phần acid béo (FA) Khi lượng dinh dưỡng hạn chế,

gây stress môi trường cho vi tảo luôn làm giảm mạnh quá trình phân chia tế bào.Tuy nhiên nếu có đủ ánh sáng và CO2 cho quang hợp, thì hoạt động sinh tổng hợpcủa các acid béo vẫn được duy trì trong một số loài tảo dưới những điều kiện stressnhư vậy Vì tăng trưởng của tảo (sự phân chia tế bào) chậm lại do đó sự tổng hợpcác hợp chất của màng tế bào mới ít đi, thay vào đó các tế bào chuyển hướng tổnghợp, tạo nên TAG Trong những điều kiện này, sản xuất TAG có thể xem như làmột cơ chế bảo vệ tế bào vi tảo [37].

Thiếu dinh dưỡng là một trong những hướng nghiên cứu sử dụng rộng rãinhất và việc áp dụng thiếu dinh dưỡng trong kỹ thuật cảm ứng tạo lipid để sản xuấtTAG ở vi tảo đã được nghiên cứu ở nhiều loài [21] Ví dụ, khi tảo silic

Stephanodiscus minutuluswas nuôi trong điều kiện thiếu silic, nitrogen hay

phosphorus, người ta nhận thấy rằng có sự tăng tích lũy TAG và giảm lipid phâncực (trên tỷ lệ phần trăm của tổng số lipid) được chú ý trong tất cả các thí nghiệmnuôi cấy hạn chế dinh dưỡng [37]

Nitrogen là chất dinh dưỡng quan trọng nhất ảnh hưởng đến chuyển hóa lipidtrong tảo Nhiều nghiên cứu cho thấy, sự sinh tổng hợp và tích lũy lipid gia tăngtrong điều kiện giới hạn nitrogen Ngược lại với lipid phân cực trong điều kiện đủnitrogen, lipid trung tính ở dạng TAG là thành phần ưu thế của lipid trong tế bàothiếu nitrogen [37]

1.4.2.2 Ảnh hưởng của ánh sáng

Ánh sáng là yếu tố quan trọng nhất cho quang hợp, cần thiết cho sự tự dưỡng Vitảo đã được nghiên cứu phát triển trên cường độ ánh sáng khác nhau cho thấy sự thay đổiđáng kể trong tổng thành phần hóa học, sắc tố và hoạt động quang hợp [37]

Bên cạnh đó, cường độ ánh sáng và bước sóng khác nhau cũng đã đượcnghiên cứu để thay đổi chuyển hóa lipid và thành phần lipid trong vi tảo Cường độánh sáng cao dẫn đến oxy hóa của PUFA, và cũng là cần thiết cho sự tổng hợp củaC16: 1 (3 trans) làm thay đổi acid béo này trong vi tảo [37]

Thông thường, cường độ ánh sáng thấp gây ra sự hình thành của lipid phâncực, đặc biệt là lipid phân cực màng liên kết với các lục lạp, trong khi cường độ ánh

sáng cao làm giảm tổng hàm lượng lipid phân cực với sự gia tăng đồng thời lipidtích trữ, chủ yếu là TAG [37].

Sản xuất TAG dưới điều kiện ánh sáng cao có thể được xem như là một cơchế bảo vệ cho tế bào Như đã nêu ở trên, nhận điện tử cần thiết cho quang hợp màcác chất nhận điện tử này có thể bị cạn kiệt trong điều kiện ánh sáng cao Tăng tổnghợp FA mà lần lượt được lưu trữ trong các phân tử TAG, có khả năng giúp các tếbào tái tạo lại nhóm chất nhận điện tử của nó [37]

Chu kỳ sáng/ tối ở giai đoạn phát triển khác nhau cũng có ảnh hưởng đáng

kể đến thành phần lipid tảo đã được chứng minh thành công trong một nghiên cứu

chi tiết về chế độ ánh sáng khác nhau lên tảo silic Thalassiosira pseudonana [37].

1.4.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ đã được chứng minh là có ảnh hưởng lớn đến thành phần acidbéo của vi tảo Một xu hướng chung đó là nhiệt độ giảm làm tăng FA không bãohòa và khi nhiệt độ tăng làm tăng FA bão hòa đã được quan sát thấy ở nhiều loài

vi tảo [37]

Nhiều thay đổi trong cấu trúc lipid làm thay đổi tính chất vật lý của màng

tế bào để đảm bảo các chức năng bình thường (ví dụ độ thấm ion, quá trìnhquang hợp và hô hấp) có thể vẫn tiếp tục được giữ nguyên Sự thay đổi thườngthấy nhất của lipid màng sau sự thay đổi nhiệt độ là một sự thay đổi trong acidbéo bất bão hòa [37]

Trong một nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ, tảo silic P tricornutumthe

đạt hàm lượng PUFA và EPA cao nhất so với khối lượng khô tương ứng là 4,9 và2,6%, khi nhiệt độ từ 25°C giảm xuống 10°C trong 12 giờ, tăng 120% so với điềukiện tối ưu cho sinh trưởng [7]

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ LIPID CỦA TẢO SILIC

1.5.1 Tình hình nghiên cứu về lipid của tảo silic trên thế giới

Từ những năm 1940, người ta rất quan tâm đến nuôi sinh khối tảo, khôngphải chỉ dùng cho nghề nuôi thủy sản mà còn vì nhiều mục đích khác như: cải tạođất, lọc nước thải, nguồn thực phẩm cho con người hay thức ăn tươi sống Để phục

vụ cho mục đích nuôi thủy sản, nhiều loài tảo khác cũng được nghiên cứu nuôitrong điều kiện phòng thí nghiệm hoặc ở quy mô sản xuất Tùy theo từng loài tảo vàđặc điểm của chúng mà mỗi loài đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng đối

với ấu trùng tôm [3] Những loài được sử dụng nhiều nhất là tảo silic (Skeletonema costatum, Thalassiosirapseudonana, Chaetoceros gracilis, Chaetoceros calcitrans), tảo roi (Isochrysis galbana, Tetraselmis suecica, Monochrysis lutheri) và tảo lục Chlorella sp Trong đó, các loài tảo silic thường được dùng làm thức ăn cho tôm biển như Chaetoceros gracilis, Skeletonema costatum; cho cá biển như Chaetoceros gracilis [50].

Đến năm 1941, khi Matsue tìm ra phương pháp phân lập và nuôi cấy tảo thuần

loài S costatum thì loài tảo này đã được Hudinaga dùng làm thức ăn cho ấu trùng tôm Penaeus japonicus và đã nâng tỷ lệ sống của ấu trùng đến giai đoạn Megalope lên 30%,

thay vì 1% so với các kết quả trước đây Phương pháp nuôi tảo silic cho ấu trùng tômcủa Hudinaga được gọi là “phương pháp nuôi cùng bể” và sau đó phương pháp nàyđược Loosanoff áp dụng trong ương nuôi ấu trùng hai mảnh vỏ [3]

Từ năm 1978 đến 1996, Phòng thí nghiệm năng lượng tái tạo Hoa Kỳ(NREL) đã thực hiện Chương trình các loài ở nước (Aquatic Species Program)nghiên cứu về khả năng sản xuất lipid của vi tảo Các nhà nghiên cứu không chỉquan tâm đến việc tìm kiếm các loài tạo nhiều lipid mà còn tới sự sinh trưởng ở cácđiều kiện khắc nghiệt về pH, nhiệt độ, độ mặn Hơn 3000 chủng được phân lập từcác vùng phía Tây, Tây Bắc và Nam Hoa Kỳ cũng như ở Hawaii Sau khi sàng lọc,phân lập, mô tả, còn lại khoảng 300 loài chủ yếu là tảo lục và tảo silic Khoảng 125

chủng tảo silic được phân lập, các chi điển hình có thể kể đến như Achnanthes, Amphora, Caloneis, Camphylodiscus, Cymbella, Entomoneis, Gyrosigma, Melosira, Navicula, Nitzschia, Pleurosigma, và Surirella Hàm lượng lipid ở một số tảo silic được nghiên cứu như Amphiprora hyalina là 22,1%, Navicula acceptata là

21,8%,… Các điều kiện về dinh dưỡng cũng được thử nghiệm Chẳng hạn, khi môi

trường đầy đủ dinh dưỡng, hàm lượng lipid của Amphiprora hyalina đạt được là

22,1%, ở điều kiện thiếu Si là 37,1% và 30,2% ở điều kiện thiếu N [63]

Wendy và Kevan (1991) đã nhận định: ở Hoa kỳ, các loài Thalasiossira pseudomonas, Skeletonema costatum, Chaetoceros calcitrans, Chaetoceros mulleri, Nannochloropsis oculata, Chlorella minutissima, được nuôi để làm thức ăn cho

luân trùng, ấu trùng hai mảnh vỏ, ấu trùng tôm và cá theo phương pháp từng đợt hoặcbán liên tục trong những bể composite 2.000-25.000 lít Ở Washington, năng suất tảo

loài Thalasiossira pseudomonas có thể đạt 720 kg khô/24.000 tấn/8 tháng; còn ở Hawaii năng suất loài Nanochloropsis đạt khoảng 2,2 triệu lít/năm [3].

Nuôi tảo silic cũng rất phổ biến ở Thái Lan, nhất là loài Skeletonema costatum và Chaetoceros calcitrans dùng cho ấu trùng tôm Bể nuôi thường là bể

làm bằng sợi thủy tinh có thể tích 1.000 lít hay bể ximăng 4.000 lít [3]

Theo Lavens và cs (1996), có hơn 40 loài vi tảo được nuôi như những chủngthuần khiết trong các hệ thống chuyên sâu được sử dụng làm thức ăn cho nuôi trồngthủy sản, bao gồm tảo silic, tảo roi, tảo lục và tảo lam [38] Những loài được sử dụng

nhiều nhất là tảo silic (Skeletonema costatum, Thalassiosirapseudonana, Chaetoceros gracilis, Chaetoceros calcitrans), tảo roi (Isochrysis galbana, Tetraselmis suecica, Monochrysis lutheri) và tảo lục Chlorella sp Trong đó, các loài tảo silic thường được dùng làm thức ăn cho tôm biển như Chaetoceros gracilis, Skeletonema costatum; cho cá biển như Chaetoceros gracilis [50].

Trong quá trình phát triển của lĩnh vực sản xuất tôm giống, người ta đã chếbiến ra nhiều loại thức ăn nhân tạo để thay thế một phần hoặc toàn bộ tảo silic Tuynhiên, đến nay tảo silic vẫn được xem là thức ăn tươi sống rất quan trọng của ấutrùng tôm Leway và cs (1993) đã nghiên cứu về ảnh hưởng của các nguồn thức ăntươi sống và nhân tạo đến sự tăng trưởng, tỉ lệ sống, hoạt động của enzyme tiêu hóa

và thành phần của protein trong cơ thể của tôm he Nhật Bản, kết quả cho thấy: ấu

trùng zoea sử dụng tảo Chaetoceros gracilis và thức ăn nhân tạo có sức tăng trưởng

tương đương nhau, nhưng đến giai đoạn mysis, nếu cho ăn thức ăn nhân tạo thì sẽdẫn đến trọng lượng khô và hàm lượng protein trong cơ thể của ấu trùng thấp hơn

so với ấu trùng cho ăn hỗn hợp Chaetocerosvà Artemia [3].

Năm 2000, Ying và cs đã nghiên cứu thành phần acid béo và lipid tổng số

của 6 chủng tảo silic (Nitzchia frustrula, Nitzschia closterium, Nitzschia incerta,

Navicula pelliculosa, Phaeodactylum tricornutum, Synedra fragilaroides) Các

chủng được nuôi ở điều kiện xác định và thu hoạch ở cuối pha sinh trưởng [78]

Một số loài tảo silic đã được Tan và cs (1996) đề xướng cho sản xuất EPA

như Nitzschia sp., Navicula sp., Phaeodatylum sp [68] Fernández và cs (2010) đã

nghiên cứu sản xuất EPA trong photobioreactor, năng suất tối đa thu được là 30 mg/L/ngày đối với ống đường kính 0,06m và 50 mg/L/ngày đối với ống đường kính0,03 m [28] Sheehan và cs (1998) với Chương trình các loài ở nước nhằm sản xuấtbiodiesel từ vi tảo, cũng đã đưa ra các mô hình nuôi trồng thu sinh khối Năng suất

tối đa khảo sát được đối với Phaeodactylum tricornutum là 21-22 g/m2/ngày,

Amphora là 45-50 g/m2/ngày (tính theo khối lượng khô) Đối với Phaeodactylum tricornutum, năm 1998, Fernández và cs đã sử dụng photobioreactor dạng ống để

nhân sinh khối, thu được năng suất 17750 L/năm [63]

Theo Becker và cs, tính đến năm 2004, 30% sản lượng tảo trên thế giới đượcbán cho những ứng dụng làm thức ăn động vật [15]

Ở Bangladesh, nơi mà S costatumchiếm ưu thế đến 62% ven biển ở Cox’s Bazar, cùng với tầm quan trọng của việc nhân nuôi sinh khối S costatum để phát

triển các trại giống tôm và trang trại nuôi tôm, các công việc hiện nay là cung cấpthông tin và công nghệ để sản xuất một cách có hiệu quả, nuôi cấy ổn định và sảnxuất chất lượng [75]

Nhiều công ty trên thế giới đã sử dụng tảo để sản xuất nhiên liệu nhưAlgenol Biofuels (Mexico), Sapphire Energy (Southern New Mexico), Solazyme(South San Francisco), Seambiotic (Israel), … Seambiotic đã thành công trongsản xuất dầu từ tảo với sản lượng hơn 5600 gallons/ha/năm Một số loài tảo silic

được Seambiotic sử dụng như Phaeodactylum tricornutum, Amphora sp ,

Navicula saprophila Gen mã hóa cho enzyme này cũng được phân lập và tạo dòng.

Tuy nhiên, những thí nghiệm chuyển gen ACC vào đã không chứng tỏ được khảnăng làm tăng tích lũy lipid có tăng lên Điều này gợi ra những giả thuyết rằng chỉbiểu hiện quá mức gen ACC thôi có thể chưa hiệu quả để tăng cường toàn bộ quátrình sinh tổng hợp lipid [63] Ryu và cs (2010) đã nghiên cứu ảnh hưởng của cácnhiệt độ khác nhau trong điều kiện thiếu Si đến hàm lượng lipid tổng số đối với

Nitzschia frustulum Chủng được nuôi trong photobioreactor ở hai giai đoạn Đầu

tiên, các tế bào được nuôi 7 ngày để làm thiếu Si với nhiệt độ 22°C Sau đó, nuôithêm hai ngày ở khoảng nhiệt độ 12-37°C Sự thay đổi trong hàm lượng lipid tổng

số nuôi ở nhiệt độ được thay đổi giữa 17-32°C là nhỏ, chỉ 15% khối lượng tươi sovới trước khi thay đổi nhiệt độ Tuy nhiên, nó tăng lên tới 21% đối với các tế bàosinh trưởng dưới 12°C và giảm mạnh tới 7% ở nhiệt độ cao hơn 37°C [59]

Smith (1852) nghiên cứu tập trung vào cấu trúc, hình thái vỏ của chi

Pleurosigma, định danh các loài, chưa có nhiều nghiên cứu sâu về sinh trưởng, hàm

lượng lipid, thành phần acid béo và các cảm ứng tạo lipid trên các loài trong chi này

Bảng 1.2 Hàm lượng lipid của một số chủng tảo [15]

1.5.2 Tình hình nghiên cứu về lipid của tảo silic ở Việt Nam

Những nghiên cứu về lipid của tảo silic ở Việt Nam chỉ mới tập trung vào

sử dụng làm thức ăn cho thủy hải sản Nguyễn Văn Hòa và cs (2006) đã nghiên cứu

nhân mật độ Chatoceros sp phân lập từ ruộng muối Vĩnh Châu trước khi cấy giống

cho ao bón phân trong hệ thống nuôi Artemia Tiến hành nhân mật độ tảo qua các

bể nhựa 100 L, 500 L, và các bể nuôi 2 m3, 15 m3 ở hệ thống ngoài trời trước khichuyển sang ao đất Môi trường tảo được bổ sung dung dịch Walne, các loại muối

Silicate, vitamin và được duy trì trong thời gian 7 ngày Kết quả cho thấy mật độ tảo

có thể đạt 2,2-2,5 triệu tế bào/mL trong bể nuôi 15 m3 [8]

Năm 2007, Nguyễn Tấn Đại đã khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiệnnuôi trồng trên sự tăng trưởng của một số loài tảo silic ở thủy vực ven biển CầnGiờ, Thành phố Hồ Chí Minh Từ nước biển Cần Giờ, tác giả đã phân lập được hai

loài tảo là Thallassiosira sp và Skeletonema costatum Cả hai loài này đều có thể

tăng trưởng trong môi trường F/2 ở điều kiện nuôi trong phòng thí nghiệm (ánhsáng 3000 lux ± 500 lux, nhiệt độ 25oC Trong điều kiện này, S costatum có xu

hướng kết chuỗi dài, nhưng khi điều kiện sống bất lợi, các chuỗi sẽ có xu hướng rútngắn hoặc tách rời nhằm giảm thiểu sự mất năng lượng [2]

Năm 2009, Nguyễn Thanh Mai và cs đã nghiên cứu ứng dụng sinh khối

tảo làm thức ăn cho tôm he chân trắng Tảo nước mặn Chaetoceros calcitrans được

thử nghiệm trên ba môi trường là Liao, TT3, F/2 Kết quả cho thấy ở môi trườngTT3 và F/2, tảo phát triển tốt hơn Mật độ nuôi cấy thử nghiệm là 2.105 tế bào/mL,4.105 tế bào/mL, 6.105 tế bào/mL, 8.105 tế bào/mL và 106 tế bào/mL, mật độ tối

ưu là 6.105 tế bào/mL [8]

Nguyễn Thị Hoài Hòa (2010), Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đạihọc Quốc gia Hà Nội đã phân lập và tuyển chọn lưu giữ ba chủng vi tảo silic kí hiệu

C2 thuộc chi Chaetoceros và N8, N9 thuộc chi Navicula N9 đều có tỷ lệ acid

palmitic lớn nhất chiếm 52,557% và 53,303% Sự đa dạng về thành phần các loạiacid béo (từ 17-19 loại acid béo) cho thấy cả ba chủng vi tảo đều có thể ứng dụngcho nuôi trồng thủy sản, làm tăng chất lượng con giống [4]

Nguyễn Quang Huy (2010) đã bước đầu phân lập và khảo sát khả năng sinhlipid của một số chủng tảo silic từ vùng biển Thừa Thiên Huế cho thấy chúng có

tiềm năng sinh lipid cao Pleurosigma là chi tảo silic khá phổ biến trong vùng biển

Thừa Thiên Huế và có tiềm năng trong việc sử dụng làm nguồn nguyên liệu để sảnxuất lipid [6]

Võ Hồng Trung, Lê Thị Trung (2012) đã nuôi cấy Chaetoceros subtilis trên

môi trường có bổ sung N-ammonium cho thấy ở nồng độ 75 µmol/L tế bào vi tảođạt được sự sinh trưởng và sinh lý tốt nhất [10]

Năm 2012, Lý Thị Tùy Duyên và cs nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ xuất

phát đến sinh trưởng của vi tảo S costatum trong môi trường nước biển nhân tạo

AQuil* Tác giả đã nhận định mật độ nuôi cấy là một trong những yếu tố có liên

quan đến sinh khối và thời gian tảo đạt cực đại Skeletonema costatum tăng trưởng

tốt nhất trên môi trường Aquil* ở mật độ nuôi cấy 30000 tb/mL, ánh sáng 3000 lux

± 500, nhiệt độ 25oC ± 2 cho chuỗi tế bào dài, sắc thể đậm màu, có đường cong tăngtrưởng điển hình [1]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Chủng tảo Pleurosigma sp và chủng tảo Nitzschia sp đã được phân lập ở bờ

biển Thuận An, Phú Vang, Thừa Thiên Huế, được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm Bộmôn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế

2.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Từ tháng 2 đến tháng 9 năm 2014

2.3 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đạihọc Khoa học, Đại học Huế

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Phương pháp nuôi cấy

2.4.1.1 Môi trường nuôi cấy

Sử dụng môi trường F/2 [34]

Thành phần môi trường và cách pha:

1 Nước biển: Lọc sạch bằng bể hút chân không, sau đó khử trùng bằng nồihấp áp suất

2 Nước cất: Sử dụng nước cất hai lần

4 Dung dịch NaH2PO4.H2O 0,5 g/100 mL H2O

5 Dung dịch Na2SiO3.9H2O 2g/100 mL H2O

6 Vi lượng F/2: Pha trong 500mL H2O

- Fe(NH4)2(SO4)2 4,6 mg/500mL H2O

Cho lần lượt vào cốc đồng thời khuấy đều

7 Vitamin B12: Pha trong 200 mL H2O

Cho lần lượt các hóa chất vào đồng thời khuấy đều Bổ sung thêm nước cất cho

đủ 1L, sau đó đem chuẩn độ ở pH 7,8 và độ mặn khoảng 30‰ Đây là các giá trị pH,

độ mặn tương tự pH, độ mặn nước biển tự nhiên Khử trùng môi trường ở 1210C,1atm, trong 30 phút Lưu ý là vitamin được cho vào môi trường sau khi hấp đã đểnguội, trong phòng cấy vô trùng

2.4.1.2 Điều kiện nuôi cấy

Chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang, chu kỳ chiếu sáng của phòng nuôi là 12 giờsáng: 12 giờ tối Nhiệt độ được điều chỉnh bằng máy điều hòa nhiệt độ từ 220C -250C

2.4.1.3 Phương pháp xác định điều kiện nuôi cấy

Xác định độ pH của môi trường nuôi cấy bằng máy đo pH hiệu Sension 3 HACH ở Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đạihọc Khoa học Huế

Xác định độ mặn của môi trường nuôi cấy bằng máy đo độ mặn hiệu HoribaU52-Japan ở Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, TrườngĐại học Khoa học Huế

- Thực hiện sục khí vào môi trường nuôi cấy bằng máy sục khí hiệu Winner.Aquarium W=9968

- Đo cường độ ánh sáng môi trường nuôi cấy bằng Lux kế

2.4.2 Phương pháp xác định mật độ tế bào

Mật độ tế bào để xây dựng đường cong được xác định bằng phương phápđếm tế bào bằng buồng đếm Sedgewick Rafter (dung tích 1 mL với 1000 ô đếm) vàkính hiển vi có độ phóng đại x10

Cách đếm: đếm số lượng tế bào của 5 góc (4 góc ngoài cùng và 1 góc ởgiữa), mỗi góc 10 ô Tiến hành đếm số lượng tế bào ở độ phóng đại x10

Cách tính:

Mật độ tế bào (tế bào/mL) =

F D A

C

.

1000

Trong đó:

C: Số lượng tế bào đếm được A: Diện tích của mỗi ô (1 mm2)D: Chiều cao mỗi ô (1 mm) F: Số lượng ô được đếm

2.4.3 Nhân sinh khối

Từ các chủng phân lập được, kiểm tra sự tạp nhiễm Khi mẫu là sạch, tiếnhành nhân giống vào các chai 500 mL Chuẩn bị môi trường nuôi, tiến hành nuôitrong thùng xốp (15 L hoặc 50 L) có sục khí Tỉ lệ tiếp giống khoảng 10% (v/v) khicác tế bào đang ở pha sinh trưởng Theo dõi sinh trưởng của chủng hàng ngày Sinhkhối thu ở cuối pha sinh trưởng bằng cách để lắng và ly tâm

2.4.4 Phương pháp xác định hàm lượng lipid tổng số

Lipid được tách chiết bằng phương pháp Soxhlet

Nguyên tắc

Dùng dung môi kỵ nước trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã được nghiềnnhỏ Một số thành phần hòa tan trong chất béo cũng được trích ly theo như sắc tố,vitamin tan trong chất béo, chất mùi, … tuy nhiên hàm lượng của chúng thấp.

- Sấy khô nguyên liệu ở 1050C trong 2 giờ để làm bất hoạt các enzyme, sau

đó sấy 650C đến khối lượng không đổi

- Sấy giấy lọc đến khối lượng không đổi Gói mẫu vào giấy lọc

- Chiết mẫu với hệ dung môi Chloroform: Methanol = 2:1(v/v)

- Điều chỉnh nhiệt độ để chu kì hoàn lưu của dung môi đạt từ 5 đến 8 lầntrong một giờ Chiết đến khi trích ly hoàn toàn chất béo

- Sau khi chiết xong, sấy túi mẫu 65oC đến khối lượng không đổi, xác địnhkhối lượng

x Trong đó:

x: hàm lượng lipid (% khối lượng khô) trong mẫu

m1: khối lượng mẫu khô ban đầu (g)

m2: khối lượng mẫu khô sau khi chiết (g)

2.4.5 Bố trí thí nghiệm

2.4.5.1 Thiết lập đường cong sinh trưởng

Phân phối môi trường F/2 vào chai thủy tinh dung tích 100 mL, mỗi chai 50

mL Cấy giống với mật độ tiếp giống ban đầu như nhau, tỉ lệ khoảng 10% (v/v).Thực hiện thao tác chuyển mẫu trong phòng cấy vô trùng

Ghi thời gian chuyển mẫu Lấy mẫu để xác định mật độ tế bào sau 2, 4, …

12, 14 ngày nuôi cấy Tiến hành thí nghiệm với 3 lần lặp lại

2.4.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường đến sinh trưởng của các chủng nghiên cứu

a) Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn nitrogen khác nhau đếnsinh trưởng của các chủng nghiên cứu ở dạng nirtrat, ammoni, urea Môi trường F/2

là môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng của các chủng tảo Trong đó nguyên tố

N (NaNO3) có hàm lượng tương ứng là: 12,35 mg/l Dựa vào môi trường này đểtính toán và xây dựng môi trường sử dụng: phân ure ((NH2)2CO) với thành phần: 44

- 48% nitrogen nguyên chất, ammonium (NH4NO3) dạng tinh khiết thay thế để nuôi

trồng các chủng tảo Theo đó hàm lượng nguồn urea và ammonium tương ứng để

đảm bảo hàm lượng N là:

Nguồn urea: 26,5 mg/l

Nguồn ammonium: 35,2 mg/l

Tiến hành khảo sát sự sinh trưởng trong chai kín dung tích 250mL, mỗi chai

100 mL môi trường Cấy giống với mật độ tiếp giống ban đầu như nhau, tỉ lệkhoảng 10% (v/v) Thực hiện thao tác chuyển mẫu trong phòng cấy vô trùng

Ghi thời gian chuyển mẫu Lấy mẫu để xác định mật độ tế bào sau 2, 4, ,

14 ngày nuôi cấy Tiến hành thí nghiệm với 3 lần lặp lại

b) Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng phối hợp của hàm lượng nitrogen vàiđiều kiện ánh sáng đến sinh trưởng của các chủng tảo được thực hiện trên cơ sởhàm lượng nitrogen có trong môi trường nuôi F/2 (12,35 mg N/l) Nguồn nitrogenđược sử dụng cho nghiên cứu này ở dạng NaNO3 (môi trường đối chứng):

- Môi trường đối chứng: sử dụng NaNO3 7,5g/100ml

- Môi trường giảm 50% N: sử dụng NaNO3 3,75g/100ml

- Môi trường giảm 100% N: loại NaNO3 khỏi F/2

- Môi trường tăng 50% N: sử dụng NaNO3 11,25g/100ml

- Môi trường tăng 100% N: sử dụng NaNO3 15g/100ml

Mỗi chủng chuẩn bị hai lô thí nghiệm với các công thức môi trường theo