2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Chủng tảo Pleurosigma sp. và chủng tảo Nitzschia sp. đã được phân lập ở bờ biển Thuận An, Phú Vang, Thừa Thiên Huế, được lưu giữ tại Phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế.
2.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Từ tháng 2 đến tháng 9 năm 2014
2.3. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế.
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1. Phương pháp nuôi cấy
2.4.1.1. Môi trường nuôi cấy
Sử dụng môi trường F/2 [34].
Thành phần môi trường và cách pha:
1. Nước biển: Lọc sạch bằng bể hút chân khơng, sau đó khử trùng bằng nồi hấp áp suất.
2. Nước cất: Sử dụng nước cất hai lần.
3. Dung dịch NaNO3 7,5g/100 mL H2O
4. Dung dịch NaH2PO4.H2O 0,5 g/100 mL H2O 5. Dung dịch Na2SiO3.9H2O 2g/100 mL H2O 6. Vi lượng F/2: Pha trong 500mL H2O
- ZnSO4.7H2O 23mg/500mL H2O - MnSO4.2H2O 152 mg/500mL H2O
- Na2MoO4.2H2O 7,3 mg/500mL H2O
- Na2MoO4.7H2O 14 mg/500mL H2O
- Fe(NH4)2(SO4)2 4,6 mg/500mL H2O
- Na2EDTA.2H2O 4,4 mg/500mL H2O
Cho lần lượt vào cốc đồng thời khuấy đều 7. Vitamin B12: Pha trong 200 mL H2O
- HEPES đệm pH 7,8 2,4g
- Vitamin B12 0,027g
8. Biotin: Pha trong 200 mL H2O
- HEPES đệm pH 7,8 2,4g
- Biotin 0,005g
9. Thiamin: Pha trong 200 mL H2O
- HEPES đệm pH 7,8 2,4g - Thiamin 0,22g - Cách pha trong 1L: 1. Nước biển 286mL/L 2. Nước cất 600mL/L 3. Dung dịch NaNO3 1mL/L 4. Dung dịch NaH2PO4.H2O 1mL/L 5. Dung dịch Na2SiO4.9H2O 1mL/L 6. Vi lượng F/2 1mL/L 7. Vitamin B12 1mL/L 8. Biotin 1mL/L 9. Thiamin 1mL/L
Cho lần lượt các hóa chất vào đồng thời khuấy đều. Bổ sung thêm nước cất cho đủ 1L, sau đó đem chuẩn độ ở pH 7,8 và độ mặn khoảng 30‰. Đây là các giá trị pH, độ mặn tương tự pH, độ mặn nước biển tự nhiên. Khử trùng môi trường ở 1210C, 1atm, trong 30 phút. Lưu ý là vitamin được cho vào môi trường sau khi hấp đã để nguội, trong phịng cấy vơ trùng.
2.4.1.2. Điều kiện nuôi cấy
Chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang, chu kỳ chiếu sáng của phịng ni là 12 giờ sáng: 12 giờ tối. Nhiệt độ được điều chỉnh bằng máy điều hòa nhiệt độ từ 220C -250C .
2.4.1.3. Phương pháp xác định điều kiện nuôi cấy
- Xác định độ pH của môi trường nuôi cấy bằng máy đo pH hiệu Sension 3 - HACH ở Phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Huế.
- Xác định độ mặn của môi trường nuôi cấy bằng máy đo độ mặn hiệu Horiba U52-Japan ở Phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Huế.
- Thực hiện sục khí vào mơi trường ni cấy bằng máy sục khí hiệu Winner. Aquarium W=9968.
- Đo cường độ ánh sáng môi trường nuôi cấy bằng Lux kế.
2.4.2. Phương pháp xác định mật độ tế bào
Mật độ tế bào để xây dựng đường cong được xác định bằng phương pháp đếm tế bào bằng buồng đếm Sedgewick Rafter (dung tích 1 mL với 1000 ơ đếm) và kính hiển vi có độ phóng đại x10.
Cách đếm: đếm số lượng tế bào của 5 góc (4 góc ngồi cùng và 1 góc ở giữa), mỗi góc 10 ơ. Tiến hành đếm số lượng tế bào ở độ phóng đại x10.
Cách tính: Mật độ tế bào (tế bào/mL) = F D A C . . 1000 . Trong đó:
C: Số lượng tế bào đếm được A: Diện tích của mỗi ơ (1 mm2) D: Chiều cao mỗi ơ (1 mm) F: Số lượng ô được đếm.
2.4.3. Nhân sinh khối
Từ các chủng phân lập được, kiểm tra sự tạp nhiễm. Khi mẫu là sạch, tiến hành nhân giống vào các chai 500 mL. Chuẩn bị môi trường nuôi, tiến hành nuôi trong thùng xốp (15 L hoặc 50 L) có sục khí. Tỉ lệ tiếp giống khoảng 10% (v/v) khi các tế bào đang ở pha sinh trưởng. Theo dõi sinh trưởng của chủng hàng ngày. Sinh khối thu ở cuối pha sinh trưởng bằng cách để lắng và ly tâm.
2.4.4. Phương pháp xác định hàm lượng lipid tổng số
Lipid được tách chiết bằng phương pháp Soxhlet. Nguyên tắc
Dùng dung mơi kỵ nước trích ly hồn tồn lipid từ nguyên liệu đã được nghiền nhỏ. Một số thành phần hòa tan trong chất béo cũng được trích ly theo như sắc tố, vitamin tan trong chất béo, chất mùi, … tuy nhiên hàm lượng của chúng thấp.
Dụng cụ, hoá chất: - Bếp cách thuỷ - Tủ sấy
- Cân
- Chloroform, Methanol
- Bộ Soxhlet (gồm bình cầu, trụ chiết, ống sinh hàn). Tiến hành:
-Sấy khô nguyên liệu ở 1050C trong 2 giờ để làm bất hoạt các enzyme, sau đó sấy 650C đến khối lượng khơng đổi.
-Sấy giấy lọc đến khối lượng khơng đổi. Gói mẫu vào giấy lọc. -Chiết mẫu với hệ dung môi Chloroform: Methanol = 2:1(v/v).
-Điều chỉnh nhiệt độ để chu kì hồn lưu của dung mơi đạt từ 5 đến 8 lần trong một giờ. Chiết đến khi trích ly hồn tồn chất béo.
-Sau khi chiết xong, sấy túi mẫu 65oC đến khối lượng khơng đổi, xác định khối lượng.
Lặp lại thí nghiệm 3 lần. Tính tốn kết quả:
Hàm lượng lipid được tính dựa vào khối lượng chất khơ cịn lại:
1 2 1 ).100 ( m m m x= − Trong đó:
x: hàm lượng lipid (% khối lượng khơ) trong mẫu m1: khối lượng mẫu khô ban đầu (g)
m2: khối lượng mẫu khơ sau khi chiết (g)
2.4.5. Bố trí thí nghiệm
2.4.5.1. Thiết lập đường cong sinh trưởng
Phân phối môi trường F/2 vào chai thủy tinh dung tích 100 mL, mỗi chai 50
mL. Cấy giống với mật độ tiếp giống ban đầu như nhau, tỉ lệ khoảng 10% (v/v).
Thực hiện thao tác chuyển mẫu trong phịng cấy vơ trùng.
Ghi thời gian chuyển mẫu. Lấy mẫu để xác định mật độ tế bào sau 2, 4, … 12, 14 ngày ni cấy. Tiến hành thí nghiệm với 3 lần lặp lại.
2.4.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường đến sinh trưởng của các chủng nghiên cứu
a) Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn nitrogen khác nhau đến sinh trưởng của các chủng nghiên cứu ở dạng nirtrat, ammoni, urea. Mơi trường F/2 là mơi trường thích hợp cho sự sinh trưởng của các chủng tảo. Trong đó nguyên tố N (NaNO3) có hàm lượng tương ứng là: 12,35 mg/l. Dựa vào môi trường này để tính toán và xây dựng môi trường sử dụng: phân ure ((NH2)2CO) với thành phần: 44 - 48% nitrogen nguyên chất, ammonium (NH4NO3) dạng tinh khiết thay thế để nuôi trồng các chủng tảo. Theo đó hàm lượng nguồn urea và ammonium tương ứng để đảm bảo hàm lượng N là:
Nguồn urea: 26,5 mg/l
Nguồn ammonium: 35,2 mg/l
Tiến hành khảo sát sự sinh trưởng trong chai kín dung tích 250mL, mỗi chai 100 mL mơi trường. Cấy giống với mật độ tiếp giống ban đầu như nhau, tỉ lệ khoảng 10% (v/v). Thực hiện thao tác chuyển mẫu trong phịng cấy vơ trùng.
Ghi thời gian chuyển mẫu. Lấy mẫu để xác định mật độ tế bào sau 2, 4, ..., 14 ngày nuôi cấy. Tiến hành thí nghiệm với 3 lần lặp lại.
b) Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng phối hợp của hàm lượng nitrogen vài điều kiện ánh sáng đến sinh trưởng của các chủng tảo được thực hiện trên cơ sở hàm lượng nitrogen có trong mơi trường ni F/2 (12,35 mg N/l). Nguồn nitrogen được sử dụng cho nghiên cứu này ở dạng NaNO3 (môi trường đối chứng):
- Môi trường đối chứng: sử dụng NaNO3 7,5g/100ml - Môi trường giảm 50% N: sử dụng NaNO3 3,75g/100ml - Môi trường giảm 100% N: loại NaNO3 khỏi F/2
- Môi trường tăng 50% N: sử dụng NaNO3 11,25g/100ml - Môi trường tăng 100% N: sử dụng NaNO3 15g/100ml
Mỗi chủng chuẩn bị hai lơ thí nghiệm với các công thức môi trường theo bảng 2.1.
Phân phối mơi trường vào các chai tam giác dung tích 250 mL, mỗi chai 100 mL môi trường. Cấy giống với mật độ tiếp giống ban đầu như nhau, tỉ lệ khoảng 10% (v/v). Thực hiện thao tác chuyển mẫu trong phịng cấy vơ trùng.
12, 14 ngày ni cấy. Tiến hành thí nghiệm với 3 lần lặp lại.
Một lơ bố trí dưới điều kiện chiếu sáng 12h sáng: 12h tối (12h:12h), còn một lơ kia bố trí dưới điều kiện chiếu sáng 6 ngày sáng: 6 ngày tối (6d:6d).
Bảng 2.1. Bố trí cơng thức thí nghiệm ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường đến sinh trưởng và hàm lượng lipid
Điều kiện ánh sáng Điều kiện môi trường Tên cơng thức thí nghiệm
12h: 12h (-)50% N I (-)100% N II (+)50% N III (+)100% N IV Ammonium V Urea VI 6d: 6d (-)50% N VII (-)100% N VIII (+)50% N IX (+)100% N X
2.4.5.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện ni cấy đến tích lũy lipid ở các chủng nghiên cứu
Nhân giống cấp 1 của mỗi chủng nghiên cứu trong chai thủy tinh 500mL. Nhân giống cấp 2 trong thùng xốp: Mỗi chủng chuẩn bị môi trường thí nghiệm giống mục 2.4.5.2 nhưng với chai dung tích 500mL, mỗi chai 500mL mơi trường, hấp khử trùng môi trường. Giống được nuôi ở điều kiện đầy đủ dinh dưỡng đến cuối pha sinh trưởng, sau đó chuyển nhân sinh khối với các mơi trường nêu trên với tỉ lệ 1 giống: 5 môi trường (v/v). Khử trùng thùng xốp bằng cồn 90o, cho mỗi loại môi trường vào mỗi thùng cùng với giống cấp 1, thao tác trong phịng ni vơ trùng.
Nuôi cấy trong thời gian 12 ngày, tiến hành thu sinh khối và chiết lipid. Bố trí các cơng thức thí nghiệm theo bảng 2.1.
2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu
