3.1. ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA CÁC CHỦNG TẢO SILIC NGHIÊN CỨU
Mỗi chủng tảo silic có tốc độ sinh trưởng khác nhau nên việc xây dựng đường cong sinh trưởng cho mỗi chủng có vai trị quan trọng trong nghiên cứu. Đường cong sinh trưởng là cơ sở để xác định thời gian cấy chuyển, tiếp giống cũng như thời điểm thu sinh khối thích hợp.
Để xác định đường cong sinh trưởng của các chủng nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy trong môi trường F/2 trong các chai dung tích 100 mL, mỗi chai 50 mL mơi trường dinh dưỡng. Mật độ tế bào được xác định sau 2, 4, 6,…, 14 ngày nuôi cấy. Đường cong sinh trưởng được vẽ ra dựa vào sự biến động mật độ tế bào sau một thời gian nuôi cấy. Kết quả xác định mật độ tế bào được trình bày ở bảng 3.1 và đường cong sinh trưởng được minh họa ở hình 3.1.
Bảng 3.1 . Mật độ tế bào của các chủng tảo qua các thời gian nuôi cấy
Mật độ tế bào (x104 tb/mL)
Chủng Thời gian (ngày)
0 2 4 6 8 10 12 14
PLTA 0,12 0,2 0,81 1,08 1,23 1,44 1,57 1,29
Hình 3.1. Đường cong sinh trưởng của chủng PLTA và NITA
Kết quả cho thấy, 2 chủng nghiên cứu đều phát triển cực đại từ 10-12 ngày, sau đó đi vào pha tử vong:
- Chủng PLTA sinh trưởng tối đa vào khoảng ngày thứ 12 và có pha tử vong diễn ra chậm. Mật độ tế bào cực đại vào ngày thứ 12 của chủng PLTA là 1,57 x 104 tế bào/mL, cao gấp khoảng 13 lần số tế bào ban đầu.
- Chủng NITA có mật độ tế bào gia tăng nhanh vào khoảng ngày thứ 10 và đạt cực đại ở ngày thứ 12 với 3,97 x 104 tế bào/mL, cao gấp khoảng 9 lần số tế bào ban đầu sau đó đi vào pha tử vong và mật độ suy giảm dần.
3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG PLTA VÀ NITA
Để khảo sát hàm lượng lipid tích lũy các chủng tảo silic ở các điều kiện môi trường nghiên cứu, chúng tôi bước đầu khảo sát sự sinh trưởng của chúng trong các điều kiện đó rồi tiến hành nhân sinh khối để xác định hàm lượng lipid.
3.2.1. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến sinh trưởng của chủng PLTA và NITA
Mơi trường thích hợp cho sinh trưởng của các chủng tảo phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng (C, N, P,...) và các nguyên tố vi lượng cần thiết (Fe, Mg, ...) là
những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng của tảo. Trong đó, C và N là quan trọng nhất để sản xuất sinh khối thích hợp cho sản xuất biodiesel [51]. Nitrogen được cung cấp chủ yếu như nitrate nhưng ammonium và urea cũng được sử dụng. Một số hợp chất nitrogen hữu cơ (hypoxanthine, lysine, guanine…) cũng được sử dụng bởi tảo [10].
Hình 3.2. Hình ảnh nghiên cứu sự sinh trưởng của các chủng tảo silic trên các điều kiện môi trường khác nhau: PLTA (trái), NITA (phải).
Trong thí nghiệm này, chúng tơi tiến hành khảo sát các nguồn nitrogen khác nhau đến sự sinh trưởng của các chủng tảo nhằm tìm ra điều kiện cho sự sinh trưởng tốt nhất ở mỗi chủng. Chuẩn bị môi trường với các nguồn nirogen là: nitrate, ammonium và urea. Trong đó nguồn nitrate ở dạng NaNO3 có trong mơi trường F/2 với hàm lượng: 12,35 mg/l. Dựa vào môi trường này để tính toán và xây dựng môi trường sử dụng: phân urea ((NH2)2CO), ammonium (NH4NO3) thay thế để ni cấy các chủng tảo. Theo đó hàm lượng nguồn urea và ammonium tương ứng để đảm bảo hàm lượng N là:
Nguồn urea: 26,5 mg/l
Nguồn ammonium: 35,2 mg/l
Tiến hành khảo sát sự sinh trưởng của các chủng tảo trong chai kín dung tích 250mL, mỗi chai 100 mL mơi trường. Cấy giống với mật độ tiếp giống ban đầu như nhau, tỉ lệ khoảng 10% (v/v). Thực hiện thao tác chuyển mẫu trong phịng cấy vơ trùng.
Ghi thời gian chuyển mẫu. Lấy mẫu để xác định mật độ tế bào sau 2, 4, …, 12, 14 ngày ni cấy. Tiến hành thí nghiệm với 3 lần lặp lại.
Bảng 3.2. Khả năng sinh trưởng của PLTA ở các nguồn N khác nhau
Ngày Mật độ tế bào (x104 tế bào/mL)
Môi trường
Nitrate Ammonium Urea
0 0,17 0,17 0,18 2 0,41 0,28 0,43 4 0,71 0,44 0,67 6 0,95 0,79 0,74 8 1,04 0,82 0,77 10 1,29 1,13 1,26 12 1,64 1,31 1,59 14 1,43 0,97 1,18
Bảng 3.3. Khả năng sinh trưởng của NITA ở các nguồn N khác nhau
Ngày Mật độ tế bào (x104 tế bào/mL) Môi trường
Nitrate Urea Ammonium
0 0,45 0,49 0,49 2 0,77 0,84 0,51 4 1,07 1,13 0,98 6 3,05 3,38 2,18 8 3,27 4,16 3,09 10 3,33 4,44 3,89 12 3,97 4,97 3,86 14 2,74 3,04 2,4
Từ kết quả trên ta thấy, trong các điều kiện trên thì mơi trường nitrate có ảnh hưởng đến sinh trưởng của chủng PLTA nhất, mật độ tế bào đạt cao nhất là 1,64 x 104 tế bào/mL ở ngày thứ 12; tiếp đến là môi trường urea với mật độ tế bào 1,59 x 104 tế bào/mL; ở môi trường ammonium chủng sinh trưởng kém nhất chỉ đạt 1,31 x 104 tế bào/mL.
Đối với chủng NITA sự sinh trưởng của chủng tảo khơng có sự khác biệt đáng kể giữa môi trường ammonium (3,86 x 104 tế bào/mL) và môi trường nitrate (3,97 x 104 tế bào/mL) và mật độ tế bào đạt cao nhất là môi trường urea với 4,97 x 104 tế bào/mL. Ammonium cũng là nguồn nitrogen ưa thích đối với vi sinh vật và sự sự đồng hoá nitrate hoặc ammonium đều liên quan đến mơi trường.
Có thể nhận thấy rằng ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến sự sinh trưởng của mỗi chủng tảo là khác nhau. Khi ammonium được sử dụng như là nguồn nitrogen duy nhất, pH có thể giảm đáng kể trong giai đoạn tăng trưởng mạnh, do sự giải phóng các ion H+. Ngược lại, pH tăng khi nitrat được cung cấp như nguồn nitrogen duy nhất [10].
Võ Hồng Trung, Lê Thị Trung (2012) đã nuôi cấy Chaetoceros subtilis trên mơi trường có bổ sung N-ammonium cho thấy ở nồng độ 75 µmol/L tế bào vi tảo đạt được sự sinh trưởng và sinh lý tốt nhất [10].
Như vậy, mỗi chủng khác nhau chịu ảnh hưởng của nguồn nitrogen không giống nhau.
3.2.2. Ảnh hưởng phối hợp của hàm lượng nitrogen và điều kiện ánh sáng đến sinh trưởng của chủng PLTA và NITA
Nitrogen (N) là chất dinh dưỡng quan trọng cho sự tăng trưởng và trao đổi chất của các tế bào tảo. N là một yếu tố cơ bản cho sự hình thành các protein và acid nucleic, cấu tạo nên các phân tử ATP, đơn vị năng lượng trong các tế bào, nó cũng là một thành phần thiết yếu của tất cả các protein cấu trúc và chức năng trong tế bào tảo, chiếm 7 % -20% khối lượng khô tế bào. Tảo hấp thụ N vơ cơ rồi nhanh chóng đồng hóa thành các hợp chất sinh hóa nhằm đáp ứng thay đổi nhu cầu sinh lý của tế bào [3].
Có nhiều nghiên cứu cho rằng thành phần tế bào vi tảo có thể chịu ảnh hưởng bởi một hóa chất hay yếu tố vật lý riêng biệt nhưng hiệu quả của tác động như vậy thường không cao và sự thay đổi thường là thấp.
Hình 3.5. Hình ảnh thí nghiệm nghiên cứu sự sinh trưởng của các chủng tảo trên các điều kiện môi trường khác nhau.1. PLTA (12h:12h), 2.PLTA (6d:6d),
3. NITA (12h:12h), 4. NITA (6d:6d).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của hai điều kiện ánh sáng và hàm lượng nitrogen đến sự sinh trưởng của các chủng tảo nhằm tìm ra điều kiện mà ở đó chúng tăng trưởng tốt nhất.
Chuẩn bị môi trường với giá trị pH, độ mặn tối ưu, trong đó thay đổi hàm lượng dinh dưỡng N. Phân phối môi trường vào các chai tam giác thủy tinh dung tích 250 mL, mỗi chai 100 mL. Giống được ni ở điều kiện đầy đủ dinh dưỡng đến cuối pha sinh trưởng sau đó chuyển qua các môi trường nêu trên với tỷ lệ tiếp giống như nhau, khoảng 10% (v/v).
Kết quả được trình bày ở bảng hình 3.6 và hình 3.7.
1 2
A
B
Hình 3.6 . Khả năng sinh trưởng của PLTA ở các điều kiện môi trường khác nhau
A. Điều kiện chiếu sáng 12h: 12h B. Điều kiện chiếu sáng 6d: 6d
A
B
Hình 3.7 . Khả năng sinh trưởng của NITA ở các điều kiện môi trường khác nhau A. Điều kiện chiếu sáng 12h: 12h
B. Điều kiện chiếu sáng 6d: 6d
Kết quả nghiên cứu cho thấy các mức N khác nhau có ảnh hưởng lên sinh trưởng của các chủng tảo. Tuy nhiên khả năng sinh trưởng của các chủng tảo ở các điều kiện khác nhau là khác nhau. Hầu hết các môi trường, sinh khối cực đại đều đạt được ở ngày nuôi thứ 12 và ngày 14 đối với (-)100% N. Ở điều kiện (-)100% N
luôn làm cho các chủng tảo sinh trưởng kém nhất. Trong đó, tảo được ni ở các mức N cao hơn, cho sinh khối cực đại lớn hơn.
- Đối với chủng PLTA (12h:12h): Mật độ tế bào đạt 1,74 x 104 tế bào/mL ở điều kiện (+)100% N; 1,89 x 104 tế bào/mL ở điều kiện (+)50% N; cao hơn so với đối chứng (1,57 x 104 tế bào/mL); mật độ tế bào thấp so với đối chứng ở điều kiện (-)50% N (1,36 x 104 tế bào/mL) và thấp nhất là (-)100% N (0,64 x 104 tế bào/mL).
- Đối với chủng NITA (12h:12h): Khơng có sự khác biệt ở điều kiện (+)100% N: Mật độ tế bào đạt 5,21 x 104 tế bào/mL và (+)50% N: 5,29 x 104 tế bào/mL, hai điều kiện này đều cao hơn so với đối chứng (3,96 x 104 tế bào/mL), ở điều kiện (-)100% N tế bào sinh trưởng kém nhất (1,14 x 104 tế bào/mL ).
Có thể nhận thấy một xu hướng chung rằng, khi gia tăng mức N từ (+)50% N đến (+)100% N, sinh khối cực đại đạt được của tảo (vào ngày ni thứ 12) có xu hướng giảm. Ngược lại, ở nhóm thấp hơn (tảo được ni ở mức N thấp hơn mức N đối chứng) cho sinh khối cực đại tăng dần từ (-)100% N đến (-)50% N.
Các mức N khác nhau ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của các chủng tảo đã được đề cập trong nhiều nghiên cứu. Dư thừa hay thiếu hụt N đều làm giảm sinh trưởng, khả năng trao đổi chất, chất lượng dinh dưỡng của nhiều lồi tảo trong đó có tảo silic. Trong nghiên cứu này, khi mức N cao hoặc thấp hơn giá trị tối ưu (+)50% N đối với chủng PLTA và (+)50% N, (+)100% N đối với chủng NITA, quá trình quang hợp của các chủng tảo vẫn diễn ra nhưng với cường độ thấp, sinh khối tảo gia tăng chậm.
Bên cạnh đó, điều kiện chiếu sáng cũng ảnh hưởng đến sinh trưởng của các chủng tảo. Hai lơ thí nghiệm bố trí ở hai điều kiện ánh sáng có sự khác biệt rõ rệt. Lơ thí nghiệm bố trí ở điều kiện chiếu sáng 12h:12h tăng trưởng theo cấp lũy thừa. Cịn lơ bố trí ở điều kiện 6d:6d thì trong 6 ngày đầu được chiếu sáng, tốc độ sinh trưởng xảy ra nhanh hơn, tuy nhiên khi bước vào giai đoạn ủ tối thì sinh khối khơng tăng nữa.
3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN HÀM LƯỢNG LIPID TÍCH LŨY Ở CHỦNG PLTA VÀ NITA
3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến hàm lượng lipid tích lũy ở chủng PLTA và NITA
Sau khi khảo sát sự sinh trưởng của các chủng tảo ở các điều kiện thí nghiệm, chúng tơi tiến hành nhân sinh khối các chủng tảo ở các điều kiện môi trường khác nhau trong các thùng 15L, theo dõi hằng ngày và thu sinh khối vào cuối pha sinh trưởng bằng cách để lắng và ly tâm. Mẫu đối chứng được ni trong mơi trường F/2 bình thường (ĐC).
Sinh khối sau đó được sấy khơ và chiết lipid bằng phương pháp Soxhlet với lượng mẫu khô ban đầu là 1 g. Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp lại. Trong thí nghiệm này, các chủng tảo được ni trong các môi trường dinh dưỡng theo công thức chi tiết ở bảng 2.1.
3.3.1.1. Chủng PLTA
Kết quả ảnh hưởng của nguồn N đến hàm lượng lipid của PLTA được thể hiện qua bảng 3.4 và hình 3.7
Bảng 3.4. Hàm lượng lipid của chủng PLTA ở các điều kiện môi trường
Điều kiện mơi trường Hàm lượng lipid (%)
Nitrat 14,22
Ammonium 10,48
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nguồn N lên sự tích lũy lipid của PLTA
Kết quả trên cho thấy, ở điều kiện môi trường sử dụng nguồn N là nitrate, hàm lượng lipid của PLTA đạt giá trị cao nhất (14,22%) và thấp nhất là ở môi trường ammonium chỉ đạt 10,48% khối lượng khô.
3.3.1.2. Chủng NITA
Kết quả ảnh hưởng của môi trường đến hàm lượng lipid của NITA được thể hiện qua bảng 3.5 và hình 3.11.
Bảng 3.5. Hàm lượng lipid của chủng NITA ở các điều kiện môi trường
Điều kiện mơi trường Hàm lượng lipid (%)
Nitrat 13,16
Ammonium 12,53
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nguồn N lên sự tích lũy lipid của NITA
Kết quả cho thấy rằng, nguồn urea là tốt nhất cho sự tích luỹ lipid ở NITA (16,91%) cao gấp 1,2 lần so với đối chứng.
Năm 2009, Ying Shen và cs đã nghiên cứu ảnh hưởng của ba nguồn nitrogen đó là urea, nitrate và glycine đến hàm lượng lipid tích lũy của 2 chủng
Scenedesmus dimorphus và Chlorella protothecoides thấy rằng Scenedesmus dimorphus đạt hàm lượng lipid cao nhất khi sử dụng môi trường urea với hàm
lượng từ 0,4 g/L-1,8 g/L; urea là nguồn nitrogen thích hợp hơn nitrate và glycine cho sản xuất lipid; Chlorella protothecoides thích hợp với mơi trường nitrat ở hàm lượng từ 5,89 g/L - 2,4 g/L [64]. Như vậy, nguồn nitrogen có ảnh hưởng đến hàm lượng lipid tích lũy ở các chủng tảo, các chủng khác nhau thích hợp với nguồn nitrogen khác nhau.
3.3.2. Ảnh hưởng phối hợp của hàm lượng nitrogen và điều kiện ánh sáng đến hàm lượng lipid tích lũy ở chủng PLTA và NITA
Sau khi khảo sát sự sinh trưởng của các chủng tảo ở các điều kiện thí nghiệm, chúng tôi tiến hành nhân sinh khối các chủng tảo ở các điều kiện môi trường khác nhau trong các thùng 15L, theo dõi hằng ngày và thu sinh khối vào cuối pha sinh trưởng bằng cách để lắng và ly tâm. Mẫu đối chứng được nuôi trong môi trường F/2 bình thường (ĐC).
Sinh khối sau đó được sấy khơ và chiết lipid bằng phương pháp Soxhlet với lượng mẫu khơ ban đầu là 1 g. Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp lại. Trong
thí nghiệm này, các chủng tảo được nuôi trong các môi trường dinh dưỡng theo công thức chi tiết ở bảng 2.1.
3.3.2.1. Chủng PLTA
Kết quả ảnh hưởng của môi trường đến hàm lượng lipid của PLTA được thể hiện ở bảng 3.6 và hình 3.10
Bảng 3.6. Hàm lượng lipid của chủng PLTA ở các điều kiện môi trường
Điều kiện môi trường Hàm lượng lipid (%)
ĐC 14,22 (-)100% N 19,76 (-)50% N 16,81 (+)50% N 13,25 (+)100% N 13,48 (-)100% N 18,26 (-)50% N 16,02 (+)50% N 8,41 (+)100% N 6,35
Hình 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng N và điều kiện chiếu sáng lên sự tích lũy lipid của PLTA
Ở điều kiện ánh sáng 12h: 12h, hàm lượng lipid đạt được từ thấp đến cao theo thứ tự (+)50% N, (+)100% N, (-)50% N, (-)100% N, tương ứng với 13,25%;
13,48%; 16,81%; 19,76% khối lượng khơ. Trong khi đó, ở điều kiện ánh sáng 6d: 6d, hàm lượng lipid tăng dần theo thứ tự các điều kiện dinh dưỡng (+)100% N, (+)50% N, (-)50% N, (-)100% N tương ứng với 6,35%; 8,41%; 16,02%; 18,26% khối lượng khô.
Kết quả trên cho thấy, hàm lượng lipid ở điều kiện (+)50% N, (+)100% N, 12h:12h (13,25%; 13,48%) khơng có sự khác biệt so với mơi trường đối chứng (14,22%). Còn ở các điều kiện (-)50% N, (-)100% N tương ứng với 16,02%; 18,26% cao hơn so với đối chứng, trong đó hàm lượng lipid cao nhất (19,76%) thu được ở điều kiện dinh dưỡng (-)100% N, chiếu sáng 12h:12h; gấp gần 1,3 lần so với đối chứng. Hàm lượng lipid ở điều kiện (+)100% N, 6d:6d thấp hơn nhiều (6,35%) so với đối chứng.
3.3.2.2. Chủng NITA
Kết quả ảnh hưởng của môi trường đến hàm lượng lipid của NITA được thể hiện qua bảng 3.7 và hình 3.11.
Bảng 3.7. Hàm lượng lipid của chủng NITA ở các điều kiện môi trường
Điều kiện môi trường Hàm lượng lipid (%)
ĐC 13,16 (-)100% N 17,43 (-)50% N 15,26 (+)50% N 12,04 (+)100% N 11,78 (-)100% N 17,88 (-)50% N 13,62 (+)50% N 10,53 (+)100% N 7,20
Hình 3.11. Ảnh hưởng của hàm lượng N và điều kiện chiếu sáng lên sự tích lũy lipid của NITA
Ở điều kiện ánh sáng 12h: 12h, hàm lượng lipid tăng dần từ 11,78%; 12,04%; 15,26%; 17,43% tương ứng với các điều kiện (+)100% N; (+)50% N, (-)50% N, (-)100% N. Trong khi đó, ở điều kiện chiếu sáng 6d:6d hàm lượng lipid tăng dần từ 7,2%; 10,53%; 13,62%; 17,88% tương ứng với các điều kiện (+)100% N; (+)50% N,