Khảo sát khả năng kháng nấm của hợp chất thứ cấp vi khuẩn lactic và ứng dụng trong bảo quản hạt đâu phộng

Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài: Tình hình nghiên cứu: Mục đích nghiên cứu: Mục tiêu nghiên cứu: Nội dung nghiên cứu: Phương pháp nghiên cứu: 6.1 Phương pháp luận: 6.2 Phương pháp xử lý số liệu: Kết đạt được: Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm sợi: 1.1.1 Giới thiệu chung: 1.1.2 Độc tố nấm tiết ra: 1.1.2.1 Các lồi có khả sinh độc tố: 1.1.2.2 Độc tố Aflatoxin: 1.1.2.3 Độc tốc Patulin: .7 1.1.2.4 Độc tố Fumonisin: 1.1.3 Các cách khử nhiễm độc tố: 1.1.3.1 Phương pháp vật lý học: i Đồ án tốt nghiệp 1.1.3.2 Phương pháp hoá học: 10 1.1.3.3 Phương pháp sinh học: 10 1.2 Tổng quan vi khuẩn lactic: 13 1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic: 13 1.2.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus: 13 1.2.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic: .14 1.2.2 Khả sinh chất kháng khuẩn: .16 1.2.2.1 Bacteriocins: 16 1.2.2.2 Các chất có khả kháng khuẩn khác: 17 1.2.3 Khả kháng nấm ứng dụng sản phẩm vi khuẩn lactic: 17 1.2.3.1 Khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic: 17 1.2.3.2 Ứng dụng vi khuẩn lactic: 19 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Địa điểm nghiên cứu: .21 2.2 Thời gian thực hiện: .21 2.3 Vật liệu nghiên cứu 21 2.3.1 Vật liệu: .21 2.3.2 Hố chất mơi trường sử dụng: 21 2.3.2.1 Hoá chất: .21 2.3.2.2 Môi trường nuôi cấy: 21 2.4 Thiết bị dụng cụ: 22 2.4.1 Thiết bị: .22 2.4.2 Dụng cụ: .22 2.5 Phương pháp luận: 22 ii Đồ án tốt nghiệp 2.5.1 Mục tiêu đồ án: 22 2.5.2 Nội dung: .22 2.6 Phương pháp nghiên cứu: .24 2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu: 24 2.6.2 Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hoá vi khuẩn Lactobacillus sp L5: 25 2.6.2.1 Nhuộm gram: 25 2.6.2.2 Nhuộm bào tử: 26 2.6.2.3 Thử nghiệm Catalase: 26 2.6.2.4 Xác định hàm lượng acid tổng: 26 2.6.2.5 Thử nghiệm khả lên men đường: 27 2.6.2.6 Thử nghiệm Protease: 27 2.6.2.7 Thử nghiệm Chitinase: 27 2.6.3 Khảo sát phát triển nấm chủng nấm Aspergillus spp.: 28 2.6.4 Khảo sát khả đối kháng trực tiếp chủng Lactobacillus sp L5 với chủng nấm Aspergillus spp.: 29 2.6.5 Khảo sát khả đối kháng sản phẩm trao đổi chất chủng Lactobacillus sp L5 với chủng nấm Aspergillus spp.: 31 2.6.6 Khảo sát khả đối kháng hợp chất thứ cấp chủng Lactobacillus sp L5 với chủng nấm Aspergillus spp.: 33 2.6.7 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn Lactobacillus sp L5 bảo quản hạt: 34 2.6.7.1 Ứng dụng tạo màng bao bảo quản hạt đậu phộng: 34 2.6.7.2 Kiểm nghiệm vi sinh sản phẩm: 36 Đồ án tốt nghiệp Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 37 3.1 Khảo sát sinh lý – sinh hoá chủng vi khuẩn lactic: 37 3.1.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc: 37 3.1.2 Nhuộm Gram: 37 3.1.3 Nhuộm bào tử: .38 3.1.4 Thử nghiệm Catalase: 38 3.1.5 Xác định hàm lượng acid tổng: 39 3.1.6 Thử nghiệm khả lên men đường: 40 3.1.7 Thử nghiệm protease: 41 3.1.8 Thử nghiệm chitinase: .42 3.2 Khảo sát khả phát triển chủng nấm Aspergillus spp.: .42 3.3 Khảo sát khả đối kháng trực tiếp chủng Lactobacillus sp L5 với chủng nấm Aspergillus spp.: 44 3.4 Khảo sát khả đối kháng sản phẩm trao đổi chất chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 với chủng nấm Aspergillus spp.: 46 3.4.1 Dịch ly tâm khơng trung hồ pH: .47 3.4.2 Dịch ly tâm trung hoà pH = 6: 49 3.5 Khảo sát khả đối kháng hợp chất thứ cấp chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 với chủng nấm Aspergillus spp.: 51 3.5.1 Khảo sát thời gian chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 sinh hợp chất thứ cấp: 51 3.5.2 Khảo sát khả đối kháng hợp chất thứ cấp chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 với chủng nấm Aspergillus spp.: 55 3.5.3 Khảo sát thành phần hoá học cao Ethyl acetate: .58 Đồ án tốt nghiệp 3.6 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn Lactobacillus sp L5 bảo quản hạt: 59 3.6.1 Ứng dụng tạo màng bao bảo vệ đậu phộng: .59 3.6.2 Kiểm tra vi sinh chất lượng sản phẩm: 69 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75 4.1 Kết luận: 75 4.2 Kiến nghị: 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC VIẾT TẮT LAB: Vi khuẩn sinh acid lactic BVTV: Bảo vệ thực vật CPSH: Chế phẩm sinh học ĐC: Đối chứng TN: Thí nghiệm NT: Nghiệm thức KTH: Khơng trung hồ TH: Trung hoà UV: Ultra Violet TLC: Thin Layer Chromatography EA: Ethyl Acetate PDA: Potato Dextrose Agar MRS: de Man, Rogosa Sharpe DMSO: Dimethyl Sulfoxide VRB: Violet Red Bile TPC: Tổng số vi sinh vật hiếu khí PCA: Plate Count Agar BPW: Buffered Peptone Water Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các chế khử nhiễm sinh học số chủng vi khuẩn .11 Bảng 1.2 Một số bacteriocins sử dụng rộng rãi (M P Zacharof, 2012) 16 Bảng 1.3 Khả đối kháng sản phẩm biến dưỡng vi khuẩn LAB (Holzapfel cộng sự, 1995) .17 Bảng 1.4 Một số hợp chất xác định có tiềm kháng nấm mốc nấm men (Corsetti cộng sự, 1998) 18 Bảng 3.1 Khả lên men loại đường Lactobacillus sp L5 41 Bảng 3.2 Đường kính phát triển chủng nấm mốc Aspergillus spp 43 Bảng 3.3 Tỉ lệ ức chế chủng nấm mốc Lactobacillus sp L5 44 Bảng 3.4 Tỉ lệ ức chế nấm mốc dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 khơng trung hồ pH khơng xử lý nhiệt xử lý nhiệt 47 Bảng 3.5 Tỉ lệ ức chế nấm mốc dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 trung hoà pH = không xử lý nhiệt xử lý nhiệt 49 Bảng 3.6 Khả đối kháng nấm dịch ly tâm 16 giờ, 24 40 Lactobacillus sp L5 .51 Bảng 3.7 Tỉ lệ đối kháng với chủng nấm mốc cao ethyl acetate 55 Bảng 3.8 Kết thí nghiệm thành phần hố học cao ethyl acetate 58 Bảng 3.9 Khả kháng nấm dịch nuôi cấy tạo màng bao ứng dụng đậu phộng .60 Bảng 3.10 Khả kháng nấm dịch nuôi cấy gia nhiệt 100°C tạo màng bao ứng dụng đậu phộng .63 Bảng 3.11 Khả kháng nấm cao Ethyl acetate tạo màng bao ứng dụng đậu phộng 66 Bảng 3.12 Kết kiểm nghiệm Tổng số vi sinh vật hiếu khí Coliform .69 vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc hố học số loại độc tố Hình 3.1 Khuẩn lạc Lactobacillus sp L5 môi trường MRS Agar 37 Hình 3.2 Kết nhuộm gram chủng Lactobacillus sp L5 .38 Hình 3.3 Kết nhuộm bào tử chủng Lactobacillus sp L5 .38 Hình 3.4 Thử nghiệm catalase chủng Lactobacillus sp L5 39 Hình 3.5 Hàm lượng acid lactic chủng Lactobacillus sp L5 theo thời gian 40 Hình 3.6 Kết lên men loại đường chủng Lactobacillus sp L5 41 Hình 3.7 Thử nghiệm protease chủng Lactobacillus sp L5 .42 Hình 3.8 Thử nghiệm chitinase chủng Lactobacillus sp L5 42 Hình 3.9 Khả phát triển chủng nấm mốc Aspergillus spp môi trường MRS Agar cải tiến 43 Hình 3.10 Đồ thị thể ức chế dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp L5 với chủng nấm mốc 45 Hình 3.11 Khả ức chế nấm mốc dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp L5 46 Hình 3.12 Đồ thị thể tỉ lệ ức chế dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 khơng trung hồ pH gia nhiệt khơng gia nhiệt 47 Hình 3.13 Khả ức chế nấm CĐP1 (I), ĐN2 (II), ĐN3 (III) HCP2 (IV) dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 khơng trung hồ pH 48 Hình 3.14 Đồ thị biểu thị tỉ lệ ức chế nấm mốc dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 trung hồ pH = khơng xử lý nhiệt xử lý nhiệt 49 Hình 3.15 Khả ức chế nấm CĐP1 (I), ĐN2 (II), ĐN3 (III) HCP2 (IV) dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 trung hoà pH 50 Hình 3.16 Đồ thị thể khả đối kháng nấm CĐP1 dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 giá trị OD hàm lượng acid lactic 53 Hình 3.17 Đồ thị thể khả đối kháng nấm ĐN2 dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 giá trị OD hàm lượng acid lactic 53 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.18 Đồ thị thể khả đối kháng nấm ĐN3 dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 giá trị OD hàm lượng acid lactic 54 Hình 3.19 Đồ thị thể khả đối kháng nấm HCP2 dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 giá trị OD hàm lượng acid lactic 54 Hình 3.20 Đồ thị thể đối kháng chủng nấm Aspergillus spp cao Ethyl acetate so với Trung hoà pH không gia nhiệt gia nhiệt 100°C .56 Hình 3.21 Khả ức chế nấm Aspergillus spp cao Ethyl acetate .57 Hình 3.22 Kết thử nghiệm Lipid cao Ethyl acetate 58 Hình 3.23 Kết thử nghiệm Đường khử, Protein, Acid amin cao Ethyl acetate 59 Hình 3.24 Sự phát triển nấm mốc qua ngày dịch nuôi cấy 62 Hình 3.25 Sự phát triển nấm mốc qua ngày dịch nuôi cấy gia nhiệt 100°C .65 Hình 3.26 Sự phát triển nấm mốc qua ngày cao Ethyl acetate 68 Hình 3.27 Kết tổng số vi sinh vật hiếu khí 70 Hình 3.28 Kết Coliform mơi trường VRB .71 Hình 3.29 Kết thử nghiệm Coliform TN1 – NT2 (Dịch nuôi cấy Chitosan 0,4% 72 Hình 3.30 Kết kiểm tra phát triển nấm mốc mơi trường MRS Agar 73 Hình 3.31 Thử nghiệm Catalase với TN1-NT1 (Canh trường nuôi cấy) TN1NT2 (Dịch nuôi cấy Chitosan 0,4%) 74 Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài: Vệ sinh an toàn thực phẩm vấn đề xã hội cần giải kịp thời để bảo vệ sức khoẻ người Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm khơng khí thường cao, điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc tố cho thực phẩm thức ăn chăn nuôi, gây độc cho người gia súc, gây tổn thương gan (ung thư gan…) Tình trạng phơi nhiễm nấm mốc ảnh hưởng đến 25% mùa màng toàn giới, làm tổn thất trung bình 418 triệu ảnh hưởng gia súc 472 triệu đô năm (theo Bô Nông Nghiệp Mỹ, 2009) Tại Việt Nam, năm bị ảnh hưởng khoảng 13-16% lượng nông sản tuỳ loại Trước thực trạng đó, người ln tìm kiếm hoạt chất sinh học vừa có tác dụng kháng nấm, vừa không gây hại cho thể người Một chủng nghiên cứu ứng dụng nhiều chủng sinh acid lactic Vi khuẩn dạng có hoạt tính sinh học cao, an tồn, có khả tiêu diệt vi sinh vật có hại nguồn vi sinh vật hữu ích, trì hệ cân vi khuẩn đường ruột Từ lợi ích vi khuẩn lactic vấn đề ngộ độ thực phẩm hư hại nông sản nấm mốc gây năm Đây lí chúng tơi chọn để thực đề tài “Khảo sát khả kháng nấm hợp chất thứ cấp vi khuẩn lactic ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng” Tình hình nghiên cứu: Trên giới, có nhiều nghiên cứu khả kháng nấm vi khuẩn sinh acid lactic tạo thành, chẳng hạn như:  “Khả kháng nấm chủng Lactobacillus plantarum với mốc Fusarium in vitro nấu mạch nha lúa mạch” A Laitila công (2002) Agar 15,00 Nước cất 1000ml pH 6,5 ± 0,2 A3 Môi trường de Man, Rogosa Sharpe Broth (MRS Broth): Thành phần Gms/L Peptone 10,00 Cao thịt 10,00 Cao nấm men 5,00 D – Glucose 20,00 Tween 80 1,00 Ammonium citrate 2,00 Sodium acetate 5,00 Magnesium sulphate 0,10 Manganese sulphate 0,05 Dipotassium phosphate 2,00 Nước cất 1000ml pH 6,5 ± 0,2 A4 Môi trường Chitin 1%: Thành phần Gms/L Chitin 10,00 Agar 15,00 Đệm phosphate (pH 7) 1000ml A5 Môi trường Casein 1%: Thành phần Gms/L Chitin 10,00 Agar 15,00 Đệm phosphate (pH 7) 1000ml Huyền phù hoá chitin: 10g chitin hoà vào 100ml HCl đậm đặc Khuấy 10 phút cho từ 500ml nước cất làm lạnh đến có màu trắng sữa Để qua đêm tủ lạnh ngăn mát Ly tâm 4000 vòng/phút 10 phút nhiều lần với dung dịch đệm pH = đến huyền phù đạt pH Bảo quản tủ mát A6 Môi trường Plate Count Agar (PCA): Thành phần Gms/L Dịch thuỷ phân casein 5,00 Cao nấm men 2,50 Dextrose 1,00 Agar 9,00 Nước cất 1000ml pH 7,0 ± 0,2 A7 Môi trường Violet Red Bile Agar (VRB): Thành phần Gms/L Peptide digest 7,000 Cao nấm men 3,000 Sodium chloride 5,000 Bile salt mixture 1,500 Lactose 10,000 Neutral red 0,030 Crystal violet 0,002 Agar 15,000 Nước cất 1000ml pH 7,4 ± 0,2 Môi trường VRBL hấp khử trùng autoclave, tiến hành cân vô trùng với nước cất hấp khử trùng để nguội sau đun nóng để hồ tan A8 Mơi trường EC Broth: Thành phần Gms/L Dịch thuỷ phân casein 20,00 Lactose 5,00 Bile salt mixture 1,50 Monotassium sulphate 4,00 Dipotassium phosphate 1,50 Sodium chloride 5,00 Nước cất 1000ml pH 6,9 ± 0,2 A9 Môi trường peptone đệm (BPW): Thành phần Gms/L Peptone 10,00 Disodium phosphate 3,50 Monopotassium phosphate 1,50 Sodium chloride 5,00 Nước cất 1000ml pH 7,2 ± 0,2 B PHỤ LỤC SỐ LIỆU B.1 Kết vòng kháng sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn Lactobacillus sp L5 với chủng nấm Aspergillus spp.: B.1.1 Đối với chủng CĐP1: TI LE UC CHE NAM CDP1 23:21 Thursday, June 13, 2016 21 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values CDP1 DCNYSTAT KTH100 KTH37 TH100 TH37 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 TI LE UC CHE NAM CDP1 23:21 Thursday, June 13, 2016 22 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TILEKHANG Sum of Source DF Model Squares Mean Square 2845.680600 711.420150 Error 10 311.622933 Corrected Total 14 3157.303533 Coeff Var Root MSE 0.901301 10.04171 5.582320 DF CDP1 F F Value Pr > F 22.83 F 76.46 F 4975.038627 1243.759657 76.46 TI LE UC CHE NAM DN2 F F Value Pr > F 9.87 0.0017 23:21 Thursday, June 13, 2016 29 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TILEKHANG NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 24.74237 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 9.0493 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N 61.627 KTH37 A 57.557 TH37 C 51.160 DCNYSTAT 43.023 KTH100 40.693 TH100 A DN3 A B B B C D C D D B.1.4 Đối với chủng HCP2: TI LE UC CHE NAM HCP2 23:21 Thursday, June 13, 2016 14 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values HCP2 DCNYSTAT KTH100 KTH37 TH100 TH37 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 TI LE UC CHE NAM HCP2 23:21 Thursday, June 13, 2016 15 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TILEKHANG Sum of Source DF Model Squares Mean Square 1222.442493 F Value Pr > F 305.610623 Error 10 129.090200 Corrected Total 14 1351.532693 R-Square Coeff Var Root MSE 0.904486 7.167286 3.592912 10 23.67 F 23.67 F TILEKHANG Mean 41.76833 Anova SS Mean Square 2355.805350 2355.805350 F Value Pr > F 122.28 0.0004 TI LE UC CHE NAM CDP1 19:42 Thursday, August 06, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TILEKHANG NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 19.26533 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 9.9502 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N CDP1 A 61.583 DCNYSTAT B 21.953 CAOEA 12 B.2.2 Đối với chủng ĐN2: TI LE UC CHE NAM DN2 19:42 Thursday, August 06, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values DN2 CAOEA DCNYSTAT Number of Observations Read Number of Observations Used TI LE UC CHE NAM DN2 19:42 Thursday, August 06, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TILEKHANG Sum of Source DF Model Squares Mean Square 2913.688067 2913.688067 Error 6.201667 Corrected Total 2919.889733 Coeff Var Root MSE 0.997876 3.432707 1.245157 DF DN2 1879.29 F TILEKHANG Mean 36.27333 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 2913.688067 2913.688067 1879.29 TI LE UC CHE NAM DN2 F TILEKHANG Mean 36.62833 Anova SS Mean Square 1267.016017 1267.016017 14 F Value Pr > F 91.76 0.0007 TI LE UC CHE NAM DN3 19:42 Thursday, August 06, 2016 13 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TILEKHANG NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 13.80842 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 8.4239 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N DN3 A 51.160 DCNYSTAT B 22.097 CAOEA B.2.4 Đối với chủng HCP2: TI LE UC CHE NAM HCP2 19:42 Thursday, August 06, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values HCP2 CAOEA DCNYSTAT Number of Observations Read Number of Observations Used TI LE UC CHE NAM HCP2 19:42 Thursday, August 06, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TILEKHANG Sum of Source DF Model Squares 1457.041667 Mean Square 1457.041667 15 F Value Pr > F 126.33 0.0004 Error 46.133867 11.533467 Corrected Total 1503.175533 R-Square Coeff Var Root MSE 0.969309 9.175331 3.396096 Source DF HCP2 TILEKHANG Mean 37.01333 Anova SS Mean Square 1457.041667 1457.041667 F Value Pr > F 126.33 0.0004 TI LE UC CHE NAM HCP2 19:42 Thursday, August 06, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TILEKHANG NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 11.53347 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 7.6988 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N HCP2 A 52.597 DCNYSTAT B 21.430 CAOEA 16 ... tài Khảo sát khả kháng nấm hợp chất thứ cấp vi khuẩn lactic ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng Tình hình nghiên cứu: Trên giới, có nhiều nghiên cứu khả kháng nấm vi khuẩn sinh acid lactic tạo... học bảo quản hạt từ vi khuẩn lên men lactic Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát khả ứng dụng dịch nuôi cấy, sản phẩm trao đổi chất hợp chất thứ cấp vi khuẩn Lactobacillus sp L5 bảo quản hạt đậu phộng. .. chủng nấm Aspergillus spp Khảo sát khả đối kháng sản phẩm trao đổi chất chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 với chủng nấm Aspergillus spp Khảo sát khả đối kháng hợp chất thứ cấp chủng vi khuẩn