Nghiên cứu một số đặc tính hóa sinh dược của dịch chiết từ loại diệp hạ châu (phyllanthus urinaria (l))

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN HOÀNG THỊ LAN HƢƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA SINH DƢỢC CỦA DỊCH CHIẾT TỪ LOÀI DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS URINARIA (L.)) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa sinh học HÀ NỘI, 2015 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN HOÀNG THỊ LAN HƢƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA SINH DƢỢC CỦA DỊCH CHIẾT TỪ LOÀI DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS URINARIA (L.)) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa sinh học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học ThS PHÍ THỊ BÍCH NGỌC HÀ NỘI, 2015 Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Phí Thị Bích Ngọc, TS Trần Thị Phƣơng Liên tận tình hướng dẫn suốt trình thực đề tài hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội cung cấp cho tảng kiến thức quý báu để hoàn thành khóa luận Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn thầy cô phòng thí nghiêm Hoá sinh - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, cán Trung tâm chuyển giao công nghệ -Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, viện Vệ sinh dịch tễ Trung Uơng tạo điều kiện thuận lợi suốt thời gian thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè người thân gia đình động viên, giúp đỡ chỗ dựa tinh thần lớn để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Xin thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 13 tháng 05 năm 2015 Sinh viên thực Hoàng Thị Lan Hương Hoàng Thị Lan Hương K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu trình bày khóa luận thực không trùng lặp với tác giả khác Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với nội dung đề cập khóa luận Hà Nội, ngày 13 tháng 05 năm 2015 Sinh viên thực Hoàng Thị Lan Hương Hoàng Thị Lan Hương K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Các phản ứng định tính 19 Bảng 3.1 Hiệu suất chiết rút phân đoạn từ Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 24 Bảng 3.2 Kết định tính phân đoạn dịch chiết từ Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 25 Bảng 3.3 Kết xây dựng đường chuẩn acid gallic 27 Bảng 3.4 Định lượng polyphenol tổng số phân đoạn dịch chiết Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 28 Bảng 3.5 Kết thử độc tính cấp theo đường uống 29 Hoàng Thị Lan Hương K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc flavonoid kiểu C6-C3-C6 Hình 1.2 Flavan Hình 1.3 Cấu trúc số alkaloid Hình 1.4 Cấu trúc số hợp chất tannin Hình 2.1 Cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 15 Hình 2.2 Chuột nhắt trắng chủng Swiss 15 Hình 3.1 Mô hình chiết rút phân đoạn hợp chất tự nhiên từ Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 23 Hình 3.2 Chạy sắc kí mỏng dịch chiết Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 26 Hình 3.3 Đồ thị đường chuẩn acid gallic 28 Hoàng Thị Lan Hương K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Hoàng Thị Lan Hương EtOH Ethanol CHCl3 Chloroform EtOAc Ethylacetate PĐ Phân đoạn K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu NỘI DUNG CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 1.1.1 Tên gọi 1.1.2 Thực vật học 1.1.3 Phân bố, sinh thái 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Một số tác dụng Sinh-Dược công dụng Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 1.2 Một số hợp chất thứ sinh có hoạt tính sinh học thực vật 1.2.1 Flavonoid thực vật 1.2.2 Alkaloid thực vật 1.2.3 Tannin 1.2.4 Hợp chất phenolic 11 1.2.5 Terpen thực vật 12 1.2.6 Steroid 13 1.2.7 Glycosid trợ tim 13 1.2.8 Saponin 14 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.1 Mẫu thực vật 15 2.1.2 Động vật thí nghiệm 15 Hoàng Thị Lan Hương K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 2.2 Vật liệu 16 2.2.1 Hóa chất 16 2.2.2 Dụng cụ thí nghiệm 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp tách chiết mẫu nghiên cứu 16 2.3.2 Phương pháp khảo sát thành phần hóa học Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 17 2.3.3 Thử độc tính cấp, xác định LD50 22 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Quy trình tách chiết phân đoạn từ Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 23 3.2 Kết khảo sát thành phần hợp chất tự nhiên Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 24 3.2.1 Kết định tính số nhóm hợp chất tự nhiên phân đoạn dịch chiết từ Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 24 3.2.2 Phân tích thành phần hợp chất tự nhiên phân đoạn dịch chiết từ Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) sắc ký lớp mỏng 26 3.2.3 Định lượng polyphenol tổng số phân đoạn dịch chiết từ Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 27 3.3 Kết thử liều độc cấp, xác định LD50 29 KẾT LUẬN 30 KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 Hoàng Thị Lan Hương K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Bước sang kỉ XXI, với phát triển vũ bão kinh tế, giới có bước tiến vượt bậc nhiều lĩnh vực khoa học ngành hóa sinh, hóa sinh dược học Do đặc tính thân thiện an toàn, người tích cực sử dụng nghiên cứu sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên nhiều lĩnh vực khác có lĩnh vực dược học Dân tộc Việt Nam có truyền thống sử dụng loài thảo mộc làm thuốc chữa bệnh Những năm gần xu hướng tìm kiếm số hoạt chất có nguồn gốc từ thảo mộc làm thuốc chữa bệnh ngày tăng thu hút nhiều nhà khoa học nghiên cứu Nước ta nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa với hai mùa khô mùa mưa rõ rệt, thuận lợi cho phát triển nhiều loài tạo nên thảm thực vật vô phong phú đa dạng Trong vô số loài thực vật đó có họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) phân bố chủ yếu vùng cận nhiệt đới nhiệt đới Việt nam có 75 chi, 420 loài (là họ có nhiều loài nước ta) chúng sử dụng làm thuốc, làm cảnh, lấy gỗ lương thực có Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) Cây Diệp Hạ Châu hay gọi Chó đẻ cưa thân thảo sống năm, mọc thẳng, cao từ 30-60 cm 80 cm Ở nước ta, mọc khắp nơi thường thấy bãi cỏ, ruộng đất hoang, có tới độ cao 500 m Theo Đông y, Diệp Hạ Châu có vị đắng, ngọt, tính mát, có tác dụng can lương huyết, lợi tiểu, sát trùng giải độc, chữa số bệnh sỏi thận, sỏi mật, viêm gan Tuy nhiên, chưa nghiên cứu nhiều thành phần hóa học Hoàng Thị Lan Hương K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Các nhóm phản ứng trình bày tóm tắt bảng sau Bảng 2.1 Các phản ứng định tính Nhóm hợp chất Phản ứng Shinoda Flavonoid Thuốc thử Màu đỏ, hồng, da cam xuất chứng tỏ có mặt flavon, flavonol dẫn xuất hydro chúng Mg/HCl Diazo hoá Diazo Dung dịch NaOH 10% kiềm Acid sulfuric H2SO4 10% Vanilin/HCl Dung dịch 5% Gelatin/1% NaCl Acetate chì 10% Alkaloid Glycoside Phản ứng cho màu da cam dương tính Phản ứng có kết dương tính xuất màu vàng cam Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy có mặt flavon flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy có mặt chalcon auron Màu đỏ son xuất chứng tỏ có mặt catechin Phản ứng dương tính xuất màu đỏ đậm Vanilin/H2SO4 Tannin Dấu hiệu nhận biết Phản ứng dương tính xuất kết tủa Phản ứng dương tính kết tủa xuất Bouchardat Hỗn hợp KI + I2 /HCl Phản ứng dương tính có màu đỏ thẫm Vans-Mayer Hỗn hợp HgCl2+ KI Phản ứng dương tính có kết tủa màu trắng vàng nhạt Dragendorf Phản ứng dương tính có kết tủa màu da cam Keller-Killian Phản ứng dương tính xuất vòng đỏ nâu bề mặt phân cách hai lớp chất lỏng Hoàng Thị Lan Hương 19 K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Polyphenol khác Khóa luận tốt nghiệp Dung dịch kiềm Phản ứng dương tính xuất màu vàng FeCl3/HCl Phản ứng dương tính xuất màu lục, xanh, đen 2.3.2.2 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin-Ciocalteau * Nguyên tắc Dựa phản ứng hợp chất polyphenol (trong mẫu) với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam So màu máy quang phổ UV VIS 1000 bước sóng λ = 765 nm Hàm lượng polyphenol tổng số tính theo mg acid galic chuẩn dùng chất chuẩn acid gallic * Các bước tiến hành - Chuẩn bị mẫu định lượng hóa chất - Dung dịch acid gallic: 0,5 g acid gallic + 10 ml C2H5OH + 90 ml H2O bảo quản lạnh Như dịch chuẩn gốc acid gallic có nồng độ mg/ml - Dung dịch Na2CO3: 200 g Na2CO3 + 800 ml H2O đun sôi Thêm vài tinh thể Na2CO3, sau 24 đem lọc dẫn nước cất tới 1000 ml - Dung dịch mẫu cần định lượng - Tiến hành xây dựng đường chuẩn acid gallic - Chuẩn bị định lượng theo số lượng dung dịch gốc sau: 0, 1, 2, 3, 10 ml sau dẫn nước cất tới 100 ml ta thu nồng độ 0, 50, 100, 150, 250 500 mg/l acid gallic - Cho vào cốc 20 µl mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn nồng độ dịch chiết phân đoạn) + 1,58 ml H2 O + 100 µl thuốc thử FolinCiocalteau sau 30 giây đến phút cho thêm 300 µl Na2CO3 Để hỗn hợp dung dịch phản ứng 200C xác định bước sóng 765 nm Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn Hoàng Thị Lan Hương 20 K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp - Định lượng phenolic mẫu nghiên cứu cách lấy 20 µl (0,02 ml) để định lượng tương tự làm với mẫu chuẩn acid gallic 2.3.2.3 Phân tích thành phần hợp chất tự nhiên phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc kí lớp mỏng (TLC - thin layer chromatography) kĩ thuật sắc kí nhanh gọn tiện lợi Nó giúp nhận biết nhóm chất có mẫu nghiên cứu Phương pháp sắc kí lớp mỏng, thành phần hỗn hợp xác định nhờ so sách hệ số lưu hỗn hợp (Rf) hệ số lưu số chất biết [3] * Nguyên tắc Kĩ thuật dựa vào mức độ tương tác chất khác với pha tĩnh (bản mỏng) pha động (hệ dung môi chạy sắc kí) Pha tĩnh silicagel, bột Al2O3 polyamide Pha động hỗn hợp từ hai dung môi trở lên với độ phân cực khác tuỳ thuộc vào mẫu phân tích * Phương pháp Các mẫu (đã pha dung môi thích hợp) tiến hành chạy sắc ký mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715) kích thước phù hợp hệ dung môi khác để lựa chọn hệ dung môi phù hợp Một số hệ dung môi sử dụng: - TEAF: : : : (Toluen - ethylacetate - acetone - acid formic) - Toluen: etylaxetate: acid focmic = : : - Etylaxetat: acid focmic: nước = : : - Dùng ống vi quản để chấm mẫu lên sắc ký Mẫu chấm phải nhỏ gọn, không để lan rộng, dùng máy sấy làm khô Chấm lặp lại nhiều lần - Tiến hành chạy sắc ký: cho sắc ký vào bình sắc ký chứa sẵn dung môi triển khai Đặt sắc ký vào gờ nhỏ đáy bình Đậy nắp bình, dung môi thấm lên sắc ký theo lực mao dẫn phân tách thành phần hoạt chất mẫu Chấm dứt chạy mẫu dung môi thấm đến 2/3 sắc ký Hoàng Thị Lan Hương 21 K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp - Hiện màu dung dịch H2SO4 10%: sau tiến hành chạy sắc ký, cho sắc ký vào dung dịch H2SO4 10% để lên màu, hơ nguội lửa đèn cồn, quan sát đánh giá Xác định hệ số lưu (Rf) theo công thức: Rf = a/b Trong a khoảng di chuyển chất nghiên cứu, b khoảng di chuyển dung môi 2.3.3 Thử độc tính cấp, xác định LD50 Trong nghiên cứu bào chế, thử nghiệm thuốc chế phẩm tự nhiên giai đoạn tiền lâm sàng, việc thử độc cấp tính có vai trò quan trọng đánh giá hiệu lực an toàn thuốc phương hướng dùng liều cho nghiên cứu Nghiên cứu độc tính cấp thuốc động vật thí nghiệm, chủ yếu xác định liều chết trung bình liều làm chết 50% số động vật thí nghiệm (LD50) điều kiện định Chỉ số LD50 sở để đánh giá độc tính thuốc, liều dùng thí nghiệm dược lý cách đắn Xác định LD50 dịch chiết Diệp Hạ Châu đường uống theo phương pháp Lorke [15] Chuột nhịn đói trước 12 thí nghiệm phân lô ngẫu nhiên với số lượng 10 lô, cho uống theo liều tăng dần lên đến mức tối đa g/kg thể trọng Theo dõi biểu số chuột chết 72 để đánh giá mức độ độc dịch chiết Diệp Hạ Châu Hoàng Thị Lan Hương 22 K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Quy trình tách chiết phân đoạn từ Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) Hình 3.1 Mô hình chiết rút phân đoạn hợp chất tự nhiên từ Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) Hoàng Thị Lan Hương 23 K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Với quy trình chiết rút thu hiệu suất phân đoạn dịch chiết từ 3000 g Diệp Hạ Châu sau: Bảng 3.1 Hiệu suất chiết rút phân đoạn từ Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) Phân đoạn Mẫu ban đầu (g) Hiệu suất chiết rút (%) Cao ethanol 325,81 10,86 Cao n - hexan 64,52 2,15 Cao chloroform 27,46 0,94 Cao ethylacetate 38,15 1,27 PĐ nước 52,37 1,75 Hiệu suất chiết rút cao phân đoạn cao ethanol (10,86%) so với khối lượng nguyên liệu khô ban đầu 3000g, tiếp đến cao phân đoạn n hexan (2,15%), cao phân đoạn nước (1,75%), cao phân đoạn ethylacetate (1,27%) thấp cao phân đoạn chloroform (0,94%) Kết cho thấy dịch chiết từ Diệp Hạ Châu có chứa lượng lớn hợp chất tự nhiên 3.2 Kết khảo sát thành phần hợp chất tự nhiên Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 3.2.1 Kết định tính số nhóm hợp chất tự nhiên phân đoạn dịch chiết từ Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) Nhằm góp phần xác định thành phần hóa học cao phân đoạn EtOH, phân đoạn n-hexan, CHCl3 phân đoạn EtOAc từ dịch chiết Diệp Hạ Châu tiến hành phản ứng hóa học với số thuốc thử đặc trưng Kết trình bày bảng 3.2 Hoàng Thị Lan Hương 24 K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.2 Kết định tính phân đoạn dịch chiết từ Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) Nhóm Phản ứng đặc Mẫu chất trƣng EtOH n - hexan chloroform ethylacetate Nƣớc Flavonoid Shinoda +++ ++ +++ ++ + Diazo +++ ++ ++ ++ + H2SO4 đặc +++ ++ ++ + + Vanilin/HCl(đ) +++ + +++ ++ + Vanilin +++ + ++ ++ + Gelatin/NaCl +++ ++ ++ + - Acetate chì ++ + ++ + + Polyphenol NaOH 10% ++ + + - - +++ ++ +++ ++ + - - - - - Vans-Mayer ++ ++ ++ ++ - Dragendroff ++ + ++ ++ + Bouchardat +++ ++ ++ + + Tannin khác FeCl3 5% Glycoside Keller-Killian Alkaloid Chú thích: (-): Không phản ứng (++): Phản ứng mạnh (+): Phản ứng (+++): Phản ứng mạnh Từ kết phản ứng định tính cho thấy thành phần hợp chất tự nhiên dịch chiết Diệp Hạ Châu phong phú, có nhóm hợp chất tự nhiên phổ biến Cao phân đoạn EtOH, n-hexan, CHCl3, EtOAc phân đoạn nước chứa hầu hết flavonoid, tannin, alkaloid không chứa glycoside Điều chứng tỏ dung môi phù hợp để chiết rút hợp chất thứ sinh từ dịch chiết Diệp Hạ Châu Căn Hoàng Thị Lan Hương 25 K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp vào mức độ phản ứng cho thấy cao phân đoạn EtOH cao phân đoạn CHCl3, chứa hàm lượng lớn nhóm chất flavonoid, tannin, alkaloid cao phân đoạn n - hexan chứa chất với hàm lượng hơn, cao phân đoạn nước chứa tương đối đầy đủ nhóm chất flavonoid, tannin, alkaloid (trừ phản ứng với Gelatin/NaCl, NaOH 10% phản ứng Mayen) với hàm lượng Ở phân đoạn cao EtOH, n-hexan, CHCl3, EtOAc phân đoạn nước chứa nhiều polyphenol, đặc biệt cao EtOH CHCl3 có mức phản ứng mạnh Kết định tính giúp có định hướng để tiếp tục nghiên cứu mức độ cao 3.2.2 Phân tích thành phần hợp chất tự nhiên phân đoạn dịch chiết từ Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) sắc ký lớp mỏng Chúng tiến hành chạy sắc ký mỏng tráng sẵn silicagel Merck Alufolien 60 F254 hệ dung môi n - hexan : Ethylacetate (2 : 1) Kết sắc ký đồ hình 3.2 cho thấy sắc ký xuất nhiều băng vạch có màu sắc khác Hình 3.2 Chạy sắc kí mỏng dịch chiết Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) Cao n-hexan, Cao EtOH, Cao EtOAc, 4.Cao CHCl3 Hoàng Thị Lan Hương 26 K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Qua quan sát sắc ký đồ, nhận thấy phân đoạn dịch chiết từ Diệp hạ châu có nhiều vạch băng với nhiều màu sắc khác Vạch đậm chất có nồng độ cao, vạch nhạt chất có nồng độ thấp Trên sắc kí đồ xuất nhiều băng vạch màu vàng (đặc trưng flavonoid), màu nâu (đặc trưng cho dầu béo), màu xanh (diệp lục) Quan sát sắc kí đồ nhận thấy phân đoạn cao EtOH xuất nhiều băng vạch nhất, phân đoạn lại chứa băng vạch 3.2.3 Định lượng polyphenol tổng số phân đoạn dịch chiết từ Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) Chúng tiến hành xác định hàm lượng polyphenol tổng số phân đoạn dịch chiết phương pháp Folin-Ciocalteau 3.2.3.1 Kết xây dựng đường chuẩn acid Gallic Bảng 3.3 Kết xây dựng đƣờng chuẩn acid gallic Thứ tự acid gallic OD (mg/l) (765nm) 0.009 50 0.062 100 0.119 150 0.168 250 0.265 500 0.519 Hoàng Thị Lan Hương 27 K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội y = 0.001x + 0.0128 R2 = 0.9997 0.6 0.5 OD 765nm Khóa luận tốt nghiệp 0.4 0.3 0.2 0.1 0 100 200 300 400 500 600 axit gallic (m g/L) Hình 3.3 Đồ thị đƣờng chuẩn acid gallic 3.2.3.2 Kết xác định hàm lượng polyphenol tổng số Định lượng polyphenol tổng số dịch chiết phân đoạn theo phương pháp Folin-Ciocalteau nhằm xác định hàm lượng chất phenol tổng số nguyên liệu khô ban đầu hàm lượng hợp chất phân đoạn dịch chiết Dịch chiết mẫu cho phản ứng với thuốc thử Folin-Ciacalteau tạo sản phẩm có màu xanh lam [17] So màu máy ERMA bước sóng λ = 765 nm, dùng chất chuẩn acid gallic để tính lượng polyphenol Bảng 3.4 Định lƣợng polyphenol tổng số phân đoạn dịch chiết Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) Tỷ lệ (%) Mẫu OD765nm Nồng độ (mg/l) Cao EtOH 0,571 558,2 5,582 Cao n-hexan 0,108 95,2 0,952 Cao CHCl3 0,183 170,2 1,702 Cao EtOAc 0,117 104,2 1,042 Cao phân đoạn nước 0,089 76,2 0,762 Hoàng Thị Lan Hương 28 polyphenol K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Kết bảng 3.4 cho thấy hàm lượng polyphenol tổng số cao phân đoạn cao ethanol cao (5,582%) sau đến cao phân đoạn chloroform (1,702%), phân đoạn ethylacetate (1,042%), tiếp đến phân đoạn n-hexan (0,952%), thấp cao phân đoạn nước (0,762%) Kết rằng, thành phần hóa học dịch chiết Diệp Hạ Châu có chứa nhiều hợp chất có khả tan tốt cao ethanol cao chloroform Kết định lượng hoàn toàn phù hợp với kết định tính 3.3 Kết thử liều độc cấp, xác định LD50 Xác định LD50 dịch chiết tổng số từ Diệp Hạ Châu chuột nhắt trắng đường uống theo phương pháp Lorke [8], [9] Chuột cho nhịn đói trước 12 thí nghiệm, phân lô ngẫu nhiên, lô 10 cho uống theo liều tăng dần từ thấp đến cao Bước nhảy liều dùng thí nghiệm 500 mg/kg chuột (tăng đần theo lô), liều cao cho uống 8000 mg/kg thể trọng Theo dõi biểu số chuột chết 72 để đánh giá mức độ độc dịch chiết Diệp hạ châu Bảng 3.5 Kết thử độc tính cấp theo đƣờng uống Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết 6500mg/kg 10 0% 7000mg/kg 10 0% 7500mg/kg 10 0% 8000mg/kg 10 0% Sau 72 theo dõi với liều 6500, 7000, 7500 mg/kg thể trọng không thấy có chuột lô có biểu ngộ độc Sử dụng với liều cao 8000mg/kg thể trọng chết, chưa tính LD50 theo đường uống Điều cho thấy dịch chiết dạng cao ethanol Diệp Hạ Châu sử dụng theo đường uống hoàn toàn không gây độc kể sử dụng liều cao Hoàng Thị Lan Hương 29 K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp KẾT LUẬN Từ kết thu trình thực nghiệm đưa kết luận sau: Thành phần hợp chất Diệp Hạ Châu phong phú, có đầy đủ nhóm hợp chất tự nhiên phổ biến flavonoid, tannin, alkaloid số polyphenol khác, không chứa glycoside Cao phân đoạn EtOH cao phân đoạn CHCl3 chứa hàm lượng lớn nhóm chất flavonoid, tannin, alkaloid Phân đoạn cao cồn tổng số chứa hàm lượng polyphenol cao Dịch chiết từ Diệp Hạ Châu hoàn toàn không độc Những kết thu giúp có sở để tiến hành bước nghiên cứu cao hơn, hướng tới điều chế, thử nghiệm thực phẩm chức từ Diệp Hạ Châu Hoàng Thị Lan Hương 30 K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp KIẾN NGHỊ Tiếp tục sâu tìm hiểu thành phần, cấu trúc hóa học dịch chiết từ Diệp Hạ Châu (Phillanthus urinaria (L.)) Hoàng Thị Lan Hương 31 K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập Trần Toàn (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập 1, NXB Khoa học Kĩ thuật Hà Nội, tr 1061 - 1063 Tạ Văn Bình (2007), Những nguyên lý tảng bệnh đái tháo đường, tăng glucose máu, NXB Y học, Hà Nội Bộ môn Nội, Trường Đại học Y Hà Nội (2005), "Đái tháo đường thai nghén", Bệnh học Nội khoa sau đại học, tr 347-359 Võ Văn Chi (1999),Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội Nguyễn Huy Cường, (2010), “Bệnh đái tháo đường - quan điểm đại”, Nxb Y học, Hà Nội Phùng Thanh Hương, Hồ Mai Anh, Nguyễn Xuân Thắng (2002), “Tác dụng hạn chế tăng glucose huyết thân Mướp đắng (Momordica charantia L Cucubiaceae) số mô hình tăng glucose huyết thực nghiệm”, Tạp chí dược học, Bộ Y tế, 1, tr 22-25 Vũ Ngọc Lộ (2005), “Những dược liệu có tác dụng hạ đường huyết trị tiểu đường”, Tạp chí Dược học, 353, tr 7-8 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, tr 143-144 Hà Thị Bích Ngọc (2012), Điều tra nghiên cứu số thực vật Việt Nam có tác dụng hỗ trợ điều hòa lượng đường máu cho bệnh nhân đái tháo đường typ 2, Luận án Tiến sĩ, Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội, tr 5-6 Hoàng Thị Lan Hương 32 K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 10 Trần Đức Thọ (2002), “Bệnh đái tháo đường”, Bài giảng bệnh học nội khoa, 1, Nxb Y học, Hà Nội 11 Nguyễn Ngọc Xuân (2004), “Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết Thổ Phục Linh (Smilax glabra roxb smilacaceae) súc vật thực nghiệm”, Luận án tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH 12 Anggorowati R (2004), Telaah absorpsi ekstrak daun salam [(Syzygium polyanthum (Wight) Walp.], Skripsi Departemen Farmasi ITB 13 Finkle B J., Runeckles V C (1967), “Phenolic compounds and metabolic regulation”, Appleton-Century-Crofts, Division of Meredith Publishing Company, USA 14 Ju Chi Liua et al (2003), “Antihypertensive effects of tannins isolated from traditional Chinese herbs as non-specific inhibitors of angiontensin converting enzyme”, Life Sciences, 73, (12), pp 1543-1555 15 Lorke D A (1983), “A new approach to practical acute toxicity testing”, Arch Toxicol, Vol 54 pp 275-287 16 Parul Lakhanpal, Deepak Kumar Rai, (2007), “Quercetin: A Versatile Flavonoid”, Internet Journal of Medical Update, Vol 2, No 17 Singleton V L., Lamuela-Raventos R.M., Orthofer R (1999), “Analysis of total phenols and other oxydation substrates and antioxidants by means of Forlin-Ciocalteu Reagent”, Methods in Enzymemology, pp 152-178 18 Srinivasan K., Viswanad B., Asrat L., Kaul C L., Ramarao P (2005), “Combination of hight-fat-diet-fet and low-does STZ treated rat: A model for type diabetes and pharmacological screening”, Department Pharmacological Reseach, 52 pp 313-320 Hoàng Thị Lan Hương 33 K37C – CN Sinh [...]... 2 Khóa luận tốt nghiệp Xuất phát từ thực tế và yêu cầu trên đây, nhằm góp phần tìm hiểu thành phần hóa học cơ bản của cây Diệp Hạ Châu để sử dụng chúng một cách khoa học và hiệu quả, chúng tôi quyết định chọn đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu một số đặc tính hóa sinh dƣợc của dịch chiết từ loài Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu và tìm hiểu một số đặc tính hóa sinh. .. sinh dược của dịch chiết từ cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 3 Nội dung nghiên cứu 3.1 Sử dụng dung môi có độ phân cực khác nhau để tách các phân đoạn dịch chiết từ cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 3.2 Định tính một số nhóm chất tự nhiên từ phân đoạn dịch chiết từ cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) bằng các phản ứng hóa học đặc trưng 3.3 Định lượng polyphenol tổng số. .. Kết quả này cho thấy trong dịch chiết từ cây Diệp Hạ Châu có chứa một lượng lớn các hợp chất tự nhiên 3.2 Kết quả khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên của cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 3.2.1 Kết quả định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết từ cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) Nhằm góp phần xác định thành phần hóa học của cao các phân đoạn EtOH,... Hình 3.1 Mô hình chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) Hoàng Thị Lan Hương 23 K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Với quy trình chiết rút trên chúng tôi đã thu được hiệu suất các phân đoạn dịch chiết từ 3000 g cây Diệp Hạ Châu như sau: Bảng 3.1 Hiệu suất chiết rút các phân đoạn từ cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) Phân... n-hexan, CHCl3 và phân đoạn EtOAc từ dịch chiết của cây Diệp Hạ Châu chúng tôi tiến hành các phản ứng hóa học với một số thuốc thử đặc trưng Kết quả được trình bày trong bảng 3.2 Hoàng Thị Lan Hương 24 K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.2 Kết quả định tính các phân đoạn dịch chiết từ cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) Nhóm Phản ứng đặc Mẫu chất trƣng EtOH n - hexan... acetate, β -amyrin 1.1.5 Một số tác dụng Sinh- Dược và công dụng của cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) Theo Đông y, Diệp Hạ Châu có vị đắng, hơi ngọt, tính mát, có tác dụng thanh can lương huyết, lợi tiểu, sát trùng, giải độc Từ 2.000 năm nay, Y học cổ truyền của nhiều dân tộc đã sử dụng Diệp Hạ Châu đắp tại chỗ chữa các Hoàng Thị Lan Hương 4 K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp... pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 3.5 Nghiên cứu độc tính cấp của dịch chiết thu được Hoàng Thị Lan Hương 2 K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp NỘI DUNG CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 1.1.1 Tên gọi Cây Diệp Hạ Châu có một số tên gọi khác là cây Chó đẻ răng cưa, Trân Châu Thảo, Cam Kiềm Tên khoa học là Phyllanthus urinaria (L.) Thuộc họ Thầu... toàn của thuốc và phương hướng dùng liều cho các nghiên cứu tiếp theo Nghiên cứu độc tính cấp của thuốc trên động vật thí nghiệm, chủ yếu là xác định liều chết trung bình hay là liều làm chết 50% số động vật thí nghiệm (LD50) trong những điều kiện nhất định Chỉ số LD50 là cơ sở để đánh giá độc tính của thuốc, liều dùng thí nghiệm dược lý một cách đúng đắn Xác định LD50 của dịch chiết cây Diệp Hạ Châu. .. ngẫu nhiên với số lượng 10 con mỗi lô, cho uống theo liều tăng dần lên đến mức tối đa là 8 g/kg thể trọng Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết cây Diệp Hạ Châu Hoàng Thị Lan Hương 22 K37C – CN Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Quy trình tách chiết các phân đoạn từ cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.))... sáng sinh sống trên các cánh đồng, ven đường, vùng đất bỏ hoang, bìa rừng Diệp Hạ Châu cũng có thể chịu bóng nên khi mọc lẫn trong bãi cỏ, vườn nhà hoặc ở vùng đồi Cây Diệp Hạ Châu mọc từ hạt, thường xuất hiện vào khoảng cuối mùa xuân, sinh trưởng nhanh trong vòng 2 tháng của mùa hè, sau đó ra hoa quả và tàn lụi Vòng đời của cây chỉ kéo dài 3-4 tháng 1.1.4 Thành phần hóa học Thành phần hóa học của Diệp ... nghiên cứu: Nghiên cứu số đặc tính hóa sinh dƣợc dịch chiết từ loài Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu tìm hiểu số đặc tính hóa sinh dược dịch chiết từ Diệp. ..TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN HOÀNG THỊ LAN HƢƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA SINH DƢỢC CỦA DỊCH CHIẾT TỪ LOÀI DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS URINARIA (L.)) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP... tự nhiên phân đoạn dịch chiết từ Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) 24 3.2.2 Phân tích thành phần hợp chất tự nhiên phân đoạn dịch chiết từ Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) sắc